MỞ ĐẦU Cordyceps spp. là nhóm các loài nấm gây bệnh ở côn trùng, còn được gọi là Đông trùng Hạ thảo dựa vào đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng, theo đó mùa đông nấm ký sinh trên vật chủ ở giai đoạn hệ sợi, mùa hè mọc thành cây nấm. được biết đến là dược liệu quý sử dụng trong y học cổ truyền Trung Hoa. Đông trùng hạ thảo có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị quý như Adenosine, Cordycepin, Cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy Ethyl Adenosine Analogs)… với tác dụng tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị hen suyễn, viêm phế quản, hạn chế khả năng suy thận, tiêu viêm, ức chế nhiều loại vi sinh vật có hại… Không chỉ được sử dụng trong dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo còn được dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh trong đó có ung thư và tăng cường sức khỏe.
Trên thị trường Việt Nam hiện đang lưu hành một số sản phẩm Đông trùng Hạ thảo như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana xuất xứ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản nhưng đa phần là của Trung Quốc. Trong thực tế, C.sinensis mới chỉ tìm thấy ở Tây Tạng, việc nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, sản phẩm vẫn phải khai thác từ tự nhiên nên giá thành rất cao.militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân tạo trên nhiều quy mô từ nhỏ đến lớn ở Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc… Việt Nam cũng đã tiến hành nhân nuôi ở quy mô nhỏ, nhưng chưa chủ động được giống, còn phụ thuộc vào nước ngoài, nên không chủ động và khó kiểm soát được chất lượng của giống cũng như sản phẩm tạo ra. Trong khi đó, các nghiên cứu cho thấy, C.takaomontana có gần như đầy đủ các hợp chất sinh học quý như C.sinensis tuy hàm lượng thấp hơn. Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong C.takaomontana có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50 ở mức mg/ml [20,30], mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần [36] và 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Beauvericin với 12 tác dụng gây độc nhiều dòng tế bào ung thư người với các liều gây độc khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn gram dương và 9 loại vi khuẩn gram âm gây bệnh trên người.
Ở Việt Nam, Phạm Quang Thu và cộng sự năm 2009 và 2010 đã phát hiện C.takaomotana tại vườn Quốc gia Tam Đảo. Ở khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, Nghệ An cũng thu thập được 29 mẫu, trong đó có C. Trần Ngọc Lân và cộng sự năm 2008 đã xác định được trong hơn 200 mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi C.takaomontana có 11 loài, trong đó Isaria tenuipes (thể vô tính của C.takaomontana) là loài phổ biến ở vườn Quốc gia Pù Mát [12]. Có thể thấy rằng, nguồn gen nấm C.takaomontana ở Việt Nam rất phong phú, có thể khai thác nên chủ động được giống.
Ngoài ra, thời gian nhân nuôi ngắn, nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm này như gạo, nhộng tằm. ở Việt Nam rất dồi dào. Vì vậy, việc nghiên cứu khai thác, phát triển nguồn gen nấm C.takaomontana chứa hoạt chất sinh học quý làm dược liệu có tính khả thi, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng, mở ra khả năng phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng. Với những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị”.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tuyển chọn được chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập, mô tả đặc điểm hình thái mẫu nấm, thuần khiết một số chủng nấm C. - Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chủng thuần khiết ( hệ sợi, khả năng sinh bào tử). - Nghiên cứu trình tự ITS của chủng nấm C.takaomontana tuyển chọn.
- Nghiên cứu môi trường thạch thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm C. - Nghiên cứu môi trường lỏng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm C. - Nghiên cứu khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học có giá trị 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp.
Giới thiệu về nấm Cordyceps spp. (tên gọi khác là Đông trùng Thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông trùng), là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm, gây chết và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm nguồn dinh dưỡng để nấm phát triển. Ở giai đoạn này, nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi.
Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Theo hệ thống phân loại, Cordyceps spp. thuộc chi Cordyceps, họ Clavicipataceae, bộ Hypocreales, lớp nấm Ascomycotes, ngành Ascomycota [52]. là loại nấm dược liệu quý và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền.
Hiện nay, Cordyceps có hơn 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis Zhang, C. Shanxiensis Liu,… Ngoài ra, còn có các chủng Cordyceps militaris, Cordyceps nutans Pat, C. Tuy nhiên cho đến nay, các nước trên thế giới, mới chỉ nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại nấm như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana,…Theo một số nghiên cứu cho thấy, các chủng nấm Cordyceps spp. khác cũng được tìm thấy tại một số nước châu Âu ( Pháp, Nga, Đức), và một số nước Châu Á khác (Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam).
Cordyceps takaomontana được phát hiện và mô tả lần đầu tiên bởi Yakush.takaomontana tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính (hình 1.1), còn được gọi bằng nhiều tên khác là Paecilomyces tenuipes hoặc Isaria japonica [9]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.takaomontana/ thể vô tính và hữu tính (nguồn: Cordyceps.us) + Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ, kích thước 10 - 45 x 1 - 1,5mm. Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng bình nổi trên bề nặt của phần chóp nấm. Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100 - 1200 x 2,2 - 3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích thước 2,5 x 3,0µm.
Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn bào tử có kích thước 6 - 8 x 0,5 - 0,8µm [9]. + Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần chính: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure). Cuống của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và số lượng thể quả có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5 đến 4,5cm. Phía trên của cuống nấm là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử.
Bào tử vô tính có hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5 - 3,0µm [9] (hình 1. Nấm Isaria tenuipes/ thể vô tính của C.takaomontana (nguồn: Daniel Guez, 1989) 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải qua 3 giai đoạn: Giai đoạn xâm nhập: Bắt đầu từ khi bào tử nấm nảy mầm đến lúc kết thúc việc xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng.
Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase. Các enzyme nay được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác nhau giữa các loài và ngay cả trong một loài. Enyzm protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy chitin (chitinase) của côn trùng.
Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu quả diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng. Giai đoạn sống ký sinh của nấm: Hệ sợ nấm trong khoang cơ thể tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả năng hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài.
Kết quả làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt động sống và dẫn đến chết [41]. Ở giai đoạn cuối cùng (sau khi vật chủ chết), sợi nấm phát triển rất nhanh đồng thời tiết độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng. Trong giai đoạn gây độc vật chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn bộ cơ thể côn trùng [12]. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới 1.
Đa dạng và phân bố Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại nấm Đông Trùng Hạ Thảo tại Nhật Bản gồm: C.ferruginosa, 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nấm Cordyceps crinalis (nguồn: cordyceps.L và cộng sự đã mô tả đặc điểm hình thái, ảnh minh họa và công dụng cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài C.hawkesii Gray, Cordyceps barnesii Thwaites, C.crassiora Zang, Yang et Li, C. Nấm Cordyceps sinensis (Beck) (nguồn: nepl.np) Tại Hàn Quốc, Sung Jae Mo và cộng sự (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái của 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm các loài: C. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Nấm Cordyceps militaris (nguồn: Daniel Winkler, 2013) 1. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp.