Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Nấm Đông trùng Hạ Thảo (Cordyceps) từ lâu đã được xem là nguồn dược liệu quý trong y học cổ truyền phương Đông nhờ chứa các hoạt chất có hoạt tính sinh học quan trọng. Trong đó, loài tự nhiên Cordyceps sinensis rất khó nuôi trồng nhân tạo, sản lượng thu hái tự nhiên hạn chế và giá thành đắt đỏ. Ngược lại, nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) có khả năng sinh trưởng tốt trên các hệ giá thể nhân tạo và sở hữu hàm lượng dược chất quý tương đương, đặc biệt là cordycepin và adenosine. Tuy nhiên, rào cản kỹ thuật lớn nhất trong sản xuất sinh khối quy mô công nghiệp hiện nay là hiện tượng thoái hóa giống nấm. Hiện tượng thoái hóa dẫn đến việc giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng hình thành thể quả, quả thể phát triển dị dạng, tốc độ sinh trưởng hệ sợi chậm lại, giảm sản sinh bào tử, giảm số lượng mầm thể quả (primordia), kéo dài chu kỳ nuôi trồng và suy giảm hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp.
Kiểu hình thoái hóa của Cordyceps militaris mang bản chất di truyền và chịu sự chi phối chặt chẽ bởi các yếu tố môi trường cùng phương thức sinh sản. Do C. militaris là loài nấm dị sản (heterothallic), quá trình sinh sản hữu tính để tạo quả thể được điều khiển trực tiếp bởi các locus gen quy định kiểu giao phối (mating-type - gen MAT), bao gồm locus MAT1-1 (chứa các gen MAT1-1-1, MAT1-1-2) và locus MAT1-2 (chứa gen MAT1-2-1). Sự phân ly hoặc suy giảm tỷ lệ các alen quy định kiểu giao phối qua các thế hệ cấy truyền vô tính được xem là một trong những nguyên nhân cốt lõi gây suy thoái giống.
Khóa luận được xác định mục tiêu và hệ thống nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể như sau:
-
Mục tiêu nghiên cứu: Phân tích ảnh hưởng của thành phần và tỷ lệ bào tử mang gen MAT tới đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng và phát triển qua các giai đoạn (nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2, nuôi tạo quả thể) của các chủng nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) thương mại qua nhiều thế hệ, nhằm xác định mối tương quan giữa tỷ lệ bào tử mang gen MAT và đặc điểm hình thái thoái hóa.
-
Nhiệm vụ nghiên cứu:
- Xác định thành phần và tỷ lệ bào tử mang gen MAT (gồm MAT1-1-1, MAT1-1-2, MAT1-2-1) trong các chủng nấm Cordyceps militaris thương mại.
- Đánh giá đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng của các chủng nấm nuôi trên môi trường nhân giống cấp 1 qua các thế hệ T1, T2, T3.
- Đánh giá đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng của các chủng nấm nuôi trên môi trường nhân giống cấp 2 qua các thế hệ T1, T2, T3.
- Đánh giá đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm nuôi trên môi trường cơ chất tạo quả thể qua các thế hệ T1, T2, T3.
-
Đối tượng nghiên cứu: 03 chủng nấm nhộng trùng thảo thương mại ký hiệu là S1, S2 và S3, được lưu giữ và cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
-
Phạm vi nghiên cứu:
- Không gian: Các thí nghiệm sinh học phân tử và nuôi cấy vi sinh được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học (VAST) phối hợp cùng Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian và chu kỳ thực nghiệm: Đề tài hoàn thành năm 2022; quá trình theo dõi hình thái và sinh trưởng thực hiện qua 3 thế hệ cấy chuyển liên tiếp (T1, T2, T3) trên ba hệ môi trường chuyên biệt.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận vận dụng khung lý thuyết vi nấm học và di truyền học phân tử nấm lớn:
- Vị trí phân loại học: Loài Cordyceps militaris thuộc Giới Fungi, Ngành Ascomycota, Ngành phụ Pezizomycotina, Lớp Ascomycetes/Pyrenomycetes, Bộ Hypocreales, Họ Cordycipitaceae, Chi Cordyceps.
- Cơ chế di truyền giao phối: Hệ thống giao phối dị sản (heterothallism) ở nấm túi được kiểm soát bởi locus MAT. Thể mang nhân dị hợp (heterokaryon) chứa đủ các locus đối lập mới có thể hoàn thành chu trình hữu tính sinh quả thể bình thường; trong khi các thể đơn nhân đồng hợp (homokaryon) chỉ chứa một locus giao phối thường tạo quả thể bất thụ hoặc không tạo được quả thể.
- Hóa sinh dược liệu: Đánh giá dựa trên các thành phần hoạt tính sinh học chủ đạo của nấm gồm cordycepin (3'-deoxyadenosine), adenosine, acid cordycepic (D-mannitol), chuỗi polysaccharide phân nhánh và các acid amin thiết yếu.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:
- Phân lập dòng bào tử đơn: Nuôi hệ sợi nấm trong môi trường PDA lỏng bổ sung bi thủy tinh trên máy lắc 150 vòng/phút ở 25°C có chiếu sáng trong 7 ngày nhằm thu nhận bào tử sinh dưỡng (conidia). Ly tâm dịch nuôi ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 10 phút, lọc qua giấy lọc vô trùng, pha loãng nồng độ và cấy trải lên đĩa thạch PDA (pH 5,7) để thu các khuẩn lạc đơn bào tử.
- Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp CTAB cải tiến có sử dụng nitơ lỏng để nghiền mịn mẫu sợi nấm, kết hợp xử lý lysozyme (100 mg/ml ở 37°C trong 30 phút), biến tính protein bằng SDS 10% và Proteinase K (20 mg/ml ở 56°C), tủa tạp chất bằng hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) và tủa DNA bằng isopropanol ở -20°C. Nồng độ và độ tinh sạch DNA được định lượng trên máy quang phổ tử ngoại NanoDrop và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
- Kỹ thuật PCR và giải trình tự: Định danh loài thông qua khuếch đại vùng ITS với cặp mồi ITS1/ITS4. Xác định kiểu gen giao phối bằng 3 cặp mồi đặc hiệu:
MAT1-1-1-F/R, MAT1-1-2-F/R và MAT1-2-1-F/R. Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự bằng phương pháp Sanger và phân tích mức độ tương đồng thông qua các công cụ tin sinh học NCBI BLAST, BioEdit 7.2 và MUSCLE.
- Thử nghiệm sinh trưởng qua 3 cấp nhân giống:
- Cấp 1 (SDAY đặc): Peptone, cao nấm men, MgSO4, KH2PO4, glucose, agar; nuôi 7 ngày ủ tối và 15 ngày chiếu sáng (700–900 lux) ở 22–25°C.
- Cấp 2 (SDAY lỏng): Môi trường dinh dưỡng lỏng không thạch, nuôi lắc 150 vòng/phút trong tối ở 25°C từ 5–7 ngày.
- Cơ chất tạo quả thể: Hỗn hợp rắn chứa 50% gạo, 25% nhộng tằm, 15% khoai tây, 10% bột đậu kết hợp dung dịch khoáng bổ sung nước dừa, MgSO4, KH2PO4, thiamin B1 và glucose. Nuôi ủ tối ở 22°C trong 7–13 ngày, sau đó kích thích tạo quả thể dưới chu kỳ sáng/tối 14/10 giờ (900 lux, độ ẩm 80%, nhiệt độ 22°C) trong 8–9 tuần.
- Phương pháp xử lý số liệu: Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần lặp lại. Phân tích số liệu và tính toán thống kê (giá trị trung bình, độ lệch chuẩn) bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Nội dung chính theo từng chương
Phần 1: Mở đầu
Chương này khẳng định giá trị dược tính của nấm nhộng trùng thảo trong việc hỗ trợ điều trị ung thư, tăng cường miễn dịch và bảo vệ chức năng các cơ quan nội tạng. Tác giả đặt trọng tâm vào thực trạng suy giảm năng suất và chất lượng quả thể do hiện tượng thoái hóa giống trong quy trình sản xuất thương mại tại Việt Nam. Đồng thời, chương mở đầu xác lập mục tiêu làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các alen gen MAT với kiểu hình thoái hóa qua 3 thế hệ nhân giống vô tính.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Tổng hợp chi tiết các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về:
- Vị trí phân loại học, chu trình ký sinh côn trùng và biến thái của nấm Cordyceps militaris.
- Đặc tính sinh hóa của các hợp chất cordycepin, adenosine, D-mannitol và hàm lượng acid béo không no (chiếm 70% tổng lượng lipid, điển hình là acid linoleic).
- Cơ chế phân tử của locus quy định kiểu bắt cặp giao phối MAT (miền alpha ở MAT1-1-1 và miền HMG ở MAT1-2-1).
- Các nguyên nhân gây thoái hóa giống nấm nhân tạo: biến đổi môi trường bảo quản, số lần cấy chuyển thế hệ (thoái hóa rõ từ thế hệ thứ 3 trở đi) và sự mất cân bằng cấu trúc nhân dị hợp.
- Lịch sử nghiên cứu sản xuất C. militaris tại Việt Nam qua các công trình tại Đại học Nông Lâm TP.HCM, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Lâm Nghiệp và dự án hoàn thiện quy trình công nghệ của Dược thảo Thiên Phúc, Traphaco Sa Pa.
Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết toàn bộ hóa chất, thiết bị máy móc chuyên dụng và các bước quy chuẩn thực nghiệm:
- Công thức pha chế môi trường dinh dưỡng SDAY đặc và SDAY lỏng.
- Quy trình chuẩn tách chiết DNA bằng đệm CTAB cải tiến.
- Thành phần cho 1 phản ứng PCR thể tích 20 µl: 8,5 µl H2O; 10 µl Master Mix 2X; 1 µl mồi xuôi (10 pmol/µl); 1 µl mồi ngược (10 pmol/µl); 1 µl DNA khuôn (nồng độ khoảng 50–100 ng/µl).
- Chu trình nhiệt PCR: Biến tính ban đầu ở 94°C (5 phút); tiếp nối bởi 35 chu kỳ gồm biến tính 94°C (30 giây), gắn mồi ở nhiệt độ thích hợp (30 giây), kéo dài ở 72°C (1 phút); kết thúc bằng giai đoạn kéo dài cuối ở 72°C (10 phút).
- Các tiêu chí theo dõi hình thái học: đường kính khuẩn lạc, tốc độ phát triển hệ sợi, màu sắc sợi nấm, khả năng hình thành sắc tố, cấu trúc mầm thể quả và mật độ quả thể.
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Chương thực nghiệm cung cấp các dữ liệu định lượng và thảo luận chuyên sâu:
- Chất lượng tách chiết DNA và định danh loài: Phản ứng PCR vùng ITS cho kích thước sản phẩm đồng nhất khoảng 550 bp. Kết quả BLAST xác nhận cả 3 chủng đều thuộc loài Cordyceps militaris với độ tương đồng từ 99,32% đến 99,43%.
- Phân tích tỷ lệ gen MAT: Khả năng tạo bào tử đơn và thành phần gen MAT có sự phân hóa mạnh mẽ giữa các chủng. Chủng S1 có tỷ lệ bào tử mang gen MAT đạt 68,57%, chủng S2 đạt 36,00%, trong khi chủng S3 không mang bất kỳ gen MAT nào (0%). Cả 3 chủng đều không ghi nhận sự tồn tại của gen MAT1-2-1.
- Sinh trưởng trên môi trường cấp 1: Sau 7 ngày nuôi tối, hệ sợi cả 3 chủng đều có màu trắng đồng nhất, đường kính đạt từ 3,11 cm đến 3,65 cm. Khi chuyển sang chiếu sáng 15 ngày, sự khác biệt kiểu hình bộc lộ rõ: chủng S1 duy trì hệ sợi màu vàng cam đậm đồng nhất, xẻ rãnh sâu, tốc độ phát triển mạnh (+++) và hình thành nhiều mầm thể quả li ti; chủng S2 có sợi màu vàng cam nhạt, tốc độ chậm (+), mầm thưa thớt ở T1 và biến mất ở T2, T3; chủng S3 sợi chuyển dần sang dạng bột mịn, xuất hiện lớp màng trắng bao phủ, hoàn toàn không hình thành mầm quả thể.
- Sinh trưởng trên môi trường cấp 2 và cơ chất tạo quả thể: Chủng S1 tạo sinh khối dạng hạt (pellet) lơ lửng đồng đều ở môi trường lỏng, phát triển hệ sợi nhanh và tạo quả thể bình thường trên cơ chất tổng hợp. Ngược lại, chủng S3 tạo dịch nấm dạng huyền phù đục, hệ sợi trên giá thể bị thoái hóa dạng màng nhầy và mất hoàn toàn khả năng hình thành quả thể.
Kết quả và đóng góp
Kết quả định lượng chi tiết
Dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình kiểm tra nồng độ DNA, định danh phân tử và xác định thành phần alen MAT của 3 chủng nấm nghiên cứu được tổng hợp trong các bảng sau:
| Chủng mẫu |
Nồng độ DNA (ng/µl) |
Độ tinh sạch ($A_{260}/A_{280}$) |
Mã số truy cập GenBank tương đồng |
Tỷ lệ tương đồng ITS (%) |
| S1 |
100,7 |
1,88 |
MK209600.1 |
99,43 |
| S2 |
92,5 |
1,85 |
OL616168.1 |
99,32 |
| S3 |
89,8 |
1,91 |
MF379267.1 |
99,43 |
Sự phân bố các alen quy định kiểu giao phối trên các dòng đơn bào tử phân lập được:
| Chủng nấm |
Tổng số khuẩn lạc đơn bào tử |
Số bào tử mang MAT1-1-1 |
Số bào tử mang MAT1-1-2 |
Số bào tử mang MAT1-2-1 |
Tỷ lệ bào tử mang gen MAT tổng số (%) |
| S1 |
32 |
2 ± 0,55 |
20 ± 0,71 |
0 |
68,57 ± 2,61 |
| S2 |
28 |
0 |
10 ± 1,14 |
0 |
36,00 ± 3,65 |
| S3 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Đặc điểm đường kính và tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường thạch SDAY cấp 1 qua 3 thế hệ cấy chuyển liên tiếp:
| Thế hệ |
Chủng nấm |
Nuôi tối 7 ngày: Đường kính (cm) |
Nuôi tối 7 ngày: Tốc độ phát triển |
Nuôi sáng 15 ngày: Đường kính (cm) |
Nuôi sáng 15 ngày: Tốc độ phát triển |
Đặc điểm hình thái sau 15 ngày chiếu sáng |
| T1 |
S1 |
3,13 ± 0,32 |
+++ |
7,73 ± 0,31 |
+++ |
Vàng cam, xẻ rãnh sâu, nhiều mầm li ti |
|
S2 |
3,11 ± 0,33 |
+ |
6,31 ± 0,31 |
+ |
Vàng cam nhạt, mầm thưa thớt dạng cục |
|
S3 |
3,34 ± 0,28 |
++ |
6,38 ± 0,35 |
++ |
Vàng cam không đồng nhất, không có mầm |
| T2 |
S1 |
3,61 ± 0,21 |
+++ |
6,62 ± 0,25 |
+++ |
Vàng cam, mầm li ti xuất hiện, có phấn |
|
S2 |
3,42 ± 0,20 |
+ |
6,09 ± 0,22 |
+ |
Màu không đồng nhất, rãnh sâu, không có mầm |
|
S3 |
3,65 ± 0,25 |
++ |
6,45 ± 0,24 |
++ |
Vàng nhạt, có lớp sợi trắng bao phủ |
| T3 |
S1 |
3,58 ± 0,21 |
+++ |
6,01 ± 0,30 |
+++ |
Vàng cam đồng nhất, rãnh sâu, sợi mịn |
|
S2 |
3,23 ± 0,19 |
+ |
6,78 ± 0,25 |
+ |
Cam không đồng nhất, sợi ngắn dạng bột |
|
S3 |
3,53 ± 0,20 |
++ |
6,36 ± 0,24 |
+ |
Cam không đều, sợi bông xốp dạng bột, viền trắng |
(Ghi chú quy ước trong văn bản: +: phát triển chậm; ++: phát triển bình thường; +++: phát triển nhanh).
Đóng góp mới của tác giả
- Xác lập bằng chứng thực nghiệm về mối tương quan thuận giữa tỷ lệ đơn bào tử mang gen MAT với sức sống và khả năng duy trì kiểu hình bình thường của giống: chủng S1 sở hữu tỷ lệ gen MAT cao nhất (68,57%) duy trì được khả năng tạo mầm quả thể ổn định nhất; trong khi chủng S3 mất hoàn toàn các alen gen MAT biểu hiện triệu chứng thoái hóa nghiêm trọng.
- Ghi nhận hiện tượng thiếu vắng hoàn toàn alen MAT1-2-1 trong cả 3 chủng giống thương mại khảo sát, đồng thời alen MAT1-1-2 chiếm ưu thế vượt trội so với MAT1-1-1.
- Cung cấp dẫn liệu khoa học chứng minh sự suy giảm tỷ lệ bào tử mang gen MAT diễn ra đồng thời với quá trình cấy chuyển liên tiếp từ thế hệ T1 đến T3.
Giải pháp và kiến nghị
- Cần đưa kỹ thuật kiểm tra thành phần gen MAT bằng PCR vào quy trình kiểm soát chất lượng giống gốc định kỳ trước khi đưa vào sản xuất công nghiệp.
- Hạn chế số lần cấy chuyển sinh dưỡng vô tính (không cấy truyền quá 2–3 thế hệ) nhằm ngăn chặn hiện tượng mất mát locus giao phối và tích lũy đột biến thoái hóa.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Quy mô nghiên cứu dừng lại ở 03 chủng nấm thương mại thu thập tại một đơn vị lưu trữ giống, chưa đại diện cho toàn bộ các chủng giống đang lưu hành tại Việt Nam.
- Cả ba chủng khảo sát đều không phát hiện được gen MAT1-2-1, do đó chưa tiến hành được phép lai chéo trực tiếp giữa hai kiểu bắt cặp đối kháng để đánh giá khả năng phục tráng giống thoái hóa.
- Khóa luận chưa thực hiện phân tích định lượng biến động hàm lượng dược chất cordycepin và adenosine qua các thế hệ cấy truyền tương ứng.
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Mở rộng sàng lọc trên tập đoàn các chủng nấm tự nhiên và các nguồn giống thương mại khác nhằm tìm kiếm các chủng mang locus giao phối MAT1-2-1.
- Tiến hành lai tạo giữa các dòng bào tử đơn mang kiểu giao phối đối kháng (MAT1-1 và MAT1-2) thu nhận từ các dòng thoái hóa để tạo giống lai phục tráng có năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin cao.
- Nghiên cứu sâu hơn về mức độ biểu hiện gen (gene expression) của các yếu tố điều hòa phiên mã MAT trong mối liên hệ với các chỉ tiêu hóa sinh của nấm.
Giá trị tham khảo
Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên môn hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Thực nghiệm, Vi sinh vật học, Nông nghiệp và Dược liệu.
Các nội dung có giá trị ứng dụng cao gồm:
- Quy trình chi tiết tách chiết DNA chất lượng cao từ hệ sợi nấm bằng phương pháp CTAB cải tiến.
- Thông số chu kỳ nhiệt và trình tự các cặp mồi PCR chuyên biệt dùng để sàng lọc locus gen MAT phục vụ công tác quản lý giống nấm dược liệu.
- Hệ thống tiêu chí mô tả hình thái thoái hóa qua 3 cấp nhân giống (cấp 1 thạch đặc, cấp 2 dịch thể lỏng và cơ chất tạo quả thể) làm cơ sở chẩn đoán sớm độ thoái hóa giống trong thực tiễn sản xuất.
Câu hỏi thường gặp
1. Kích thước sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS của các chủng nấm trong nghiên cứu là bao nhiêu và kết quả định danh loài ra sao?
Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS bằng cặp mồi ITS1/ITS4 cho sản phẩm có kích thước khoảng 550 bp ở cả 3 chủng nấm. Phân tích đối sánh trình tự trên GenBank cho thấy độ tương đồng đạt trên 99% (S1: 99,43% tương đồng với mã MK209600.1; S2: 99,32% với mã OL616168.1; S3: 99,43% với mã MF379267.1), khẳng định cả 3 chủng đều thuộc loài Cordyceps militaris.
2. Tỷ lệ bào tử mang các alen của gen MAT phân bố như thế nào giữa 3 chủng nấm S1, S2 và S3?
Kết quả kiểm tra PCR trên các khuẩn lạc đơn bào tử cho thấy sự khác biệt rõ rệt:
- Chủng S1 (32 khuẩn lạc): có $2 \pm 0,55$ bào tử mang gen MAT1-1-1; $20 \pm 0,71$ bào tử mang gen MAT1-1-2; 0 bào tử mang gen MAT1-2-1; đạt tổng tỷ lệ mang gen MAT là $68,57 \pm 2,61%$.
- Chủng S2 (28 khuẩn lạc): có 0 bào tử mang MAT1-1-1; $10 \pm 1,14$ bào tử mang MAT1-1-2; 0 bào tử mang MAT1-2-1; đạt tỷ lệ mang gen MAT là $36,00 \pm 3,65%$.
- Chủng S3 (5 khuẩn lạc): hoàn toàn không phát hiện bào tử nào mang các gen MAT1-1-1, MAT1-1-2 hay MAT1-2-1 (tỷ lệ 0%).
3. Dấu hiệu thoái hóa nào chứng minh chủng nấm C. militaris S3 đã bị mất hoàn toàn khả năng tạo quả thể?
Chủng S3 có lượng bào tử đơn tạo ra rất ít (chỉ thu được 5 khuẩn lạc sau 3 lần lặp lại) và tỷ lệ mang gen MAT bằng 0%. Khi nuôi cấy cấp 1 ngoài sáng, hệ sợi chuyển sang màu vàng nhạt, tạo màng sợi trắng bao phủ dạng bột mịn và không xuất hiện mầm thể quả. Ở giai đoạn nhân giống cấp 2, dịch nấm chỉ tạo trạng thái huyền phù đục thay vì tạo các hạt sinh khối vón cục (pellet). Khi chuyển lên cơ chất tổng hợp, hệ sợi thoái hóa hoàn toàn và không hình thành được quả thể.
4. Môi trường cơ chất rắn nuôi tạo quả thể nấm trong nghiên cứu gồm những thành phần cụ thể nào?
Cơ chất nuôi tạo quả thể trong hộp kích thước 9x9x9 cm được phối trộn theo tỷ lệ khối lượng gồm: 50% gạo, 25% nhộng tằm, 15% khoai tây, 10% bột đậu kết hợp dung dịch khoáng bổ sung nước dừa, $MgSO_4$, $KH_2PO_4$, thiamin B1 và glucose, sau đó được khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121°C trong thời gian 20 phút.
5. Hệ sợi nấm của 3 chủng thay đổi thế nào sau 15 ngày chiếu sáng trên môi trường SDAY đặc qua các thế hệ cấy truyền?
Ở thế hệ T1, chủng S1 có hệ sợi màu vàng cam, xẻ rãnh sâu và xuất hiện nhiều mầm thể quả li ti; chủng S2 có màu vàng cam nhạt, mầm thưa thớt dạng cục; chủng S3 màu vàng cam không đồng nhất, không có mầm. Sang thế hệ T2 và T3, chủng S1 tiếp tục giữ màu vàng cam đồng nhất, hệ sợi mịn và duy trì mầm thể quả; trong khi chủng S2 và S3 xuất hiện các biến đổi thoái hóa rõ nét như hệ sợi chuyển dạng bột xốp, màu sắc loang lổ không đều, xuất hiện viền trắng hoặc màng sợi trắng phủ lên bề mặt và không còn khả năng tạo mầm.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Hoàng Thị Linh đã xác định thành công đặc điểm di truyền của 3 chủng nấm nhộng trùng thảo thương mại thông qua vùng gen ITS và hệ thống mồi đặc hiệu locus MAT. Nghiên cứu chứng minh rằng tỷ lệ bào tử mang gen MAT có mối liên hệ mật thiết với mức độ thoái hóa giống: chủng S1 mang tỷ lệ gen MAT cao (68,57%) duy trì hệ sợi tốt và tạo quả thể bình thường, trong khi chủng S3 mất hoàn toàn gen MAT bị thoái hóa nặng và mất khả năng sinh quả thể. Đây là công trình thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, cung cấp cơ sở sinh học phân tử cho việc kiểm soát chất lượng và ngăn ngừa suy thoái giống Cordyceps militaris trong quy trình sản xuất thương mại.
