MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên như: Đông trùng Hạ Thảo, nấm Linh chi, Nhân sâm, Sâm Ngọc Linh,. để phòng và trị bệnh đã trở nên phổ biến. Nấm Cordyceps được gọi là “Đông trùng Hạ Thảo” đã được sử dụng như là loại dược liệu dân gian truyền thống và là thành phần thực phẩm có tác dụng tăng cường hệ thống miễn nhiễm, phục hồi năng lượng tương tự nhân sâm của các quốc gia Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc.
Phần dược tính của Đông trùng Hạ Thảo được chứng minh là do chiết xuất từ nấm Cordyceps. Giống Cordyceps với hơn 500 loài có khả năng hình thành quả thể (Kobayashi, 1941; Petch, 1936) trong đó có khoảng 78 loài đã được chọn lọc và định danh theo loại ký chủ và hình dạng quả thể (Sung, 1996). Tuy nhiên, chỉ một vài loài được chọn lọc có khả năng sử dụng làm dược liệu và được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền châu Á như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris (C. Loài Cordyceps sinensis được sử dụng từ rất lâu nhưng giá thành của chúng rất cao vì rất khó để nuôi trồng mà chỉ được thu hái ngoài tự nhiên với sản lượng rất thấp.
Trong khi đó, loài C. militaris ngày càng được sử dụng phổ biến hơn và có thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. Cũng như Cordyceps sinensis, loài C. militaris cũng chứa các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là Cordycepin – chất có khả năng chống ung thư.
Ngày nay trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi trồng nấm nhộng trùng thảo và đạt được những kết quả khả quan. Tuy nhiên trong quá trình nuôi trồng nấm nhộng trùng thảo nhân tạo xuất hiện một vấn đề lớn là hiện tượng thoái hóa giống. Sự thoái hóa của các chủng nấm C. militaris thường dẫn đến việc giảm hoặc mất khả năng tạo thể quả hoặc gây biến dạng thể quả.
Điều này làm cho số lượng và chất lượng thể quả bị giảm sút và gây thiệt hại đáng kể về kinh tế cho người sản xuất. Thêm vào đó, sự thoái hóa 1 cũng dẫn đến tốc độ tăng trưởng của nhộng trùng thảo chậm hơn, giảm khả năng sản xuất bào tử, giảm khả năng phát sinh và số lượng mầm quả thể (primordia), chu kỳ sinh trưởng của nấm kéo dài hơn và hàm lượng chất chuyển hóa thứ cấp giảm xuống (Yin & cs. Điều này cho thấy, sự thoái hóa của các chủng nấm C. militaris dẫn tới việc giảm năng suất và chất lượng thể quả.
Do kiểu hình thoái hóa của C. militaris có tính di truyền nên việc ngăn chặn sự thoái hóa chủng giống là điều rất quan trọng. Việc nắm vững nguyên nhân và nhận biết được hiện tượng thoái hóa của nấm C. militaris sẽ giúp chúng ta ngăn chặn và làm giảm được sự thoái hóa của nấm, tránh thiệt hại về kinh tế.
Nhưng cho đến hiện nay các công trình nghiên cứu về thoái hóa giống còn rất hạn chế. Trên cơ sở các nghiên cứu trước đây, các yếu tố ảnh hưởng đến sự thoái hóa của C. militaris có thể được chia thành hai nhóm: yếu tố môi trường và sự biến đổi di truyền. Các yếu tố môi trường có thể gây thoái hóa là: phương pháp bảo quản, dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, thời gian và vòng đời cấy chuyển, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, nồng độ oxi… Sự biến đổi di truyền dựa theo hình thức sinh sản của nấm C.
militaris là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Sự biến đổi di truyền của C. militaris được coi là nguyên nhân gốc rễ của sự thoái hóa do nó là yếu tố quyết định cho sự phát triển bình thường của thể quả. Các kiểu gen giao phối (gen MAT) gồm MAT 1.2 có vai trò điều khiển đến quá trình sinh sản hữu tính của nấm Codyceps militaris.
Mối liên hệ giữa các kiểu gen giao phối và đặc điểm thoái hóa của Codyceps militaris vẫn cần nghiên cứu thêm. Do vậy đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của gen MAT tới khả năng thoái hóa của một số chủng nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) thương mại” được thực hiện.1 Hiện tượng ng thoái hóa giống gi nhộng trùng thảoo trong nuôi cấy c nhân tạo (https://namvang.vn/thoai https://namvang.vn/thoai-hoa-giong-trong-san-xuat xuat-dong-trung-ha-thao/) Chú thích: cm-6D2, 6D2, cm-6D3. cm Chủng nấm m thoái hóa không có khả kh năng hình thành quả thể, hệ sợi mỏng màu vàng nhẹ; cm-6. Chủng ng nấm n bình thường có khả năng tạo quả thể; th F12.
Chủng thoái hóa với hệ sợii nấm n màu vàng sáng bao quanh 1. Mục đích và yều u cầu c của đề tài 1.1 Mục đích Phân tích ảnh hưởng hư của thành phần và tỷ lệ bào tử mang gen MAT tới đặc điểm hình thái, khảả năng sinh trưởng và phát triển qua các giai đoạn đo (nhân giống cấp 1, nhân giống ng cấp c 2, nuôi tạo quả thể) của các chủng ng nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps Cordyceps militaris) militaris thương mại (C. militaris S3) trên nhiềuu thế hệ nhằm xác định mốii tương quan giữa gi tỷ lệ bào tử mang gen MAT và đặcc điểm đi hình thái.2 Yêu cầu của đề tài - Xác định thành phần ph và tỷ lệ bào tử mang gen MAT (gồm MAT 1.2 trong các chủng nấm C. militaris S3 thương mạii 3 - Đánh giá các đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng của các chủng nấm C.
militaris S3 thương mại nuôi trên môi trường nhân giống cấp 1 qua các thế hệ T1, T2, T3 - Đánh giá các đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng của các chủng nấm C. militaris S3 thương mại nuôi trên môi trường nhân giống cấp 2 qua các thế hệ T1, T2, T3 - Đánh giá các đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm C. militaris S3 thương mại nuôi trên môi cơ chất nuôi tạo quả thể qua các thế hệ T1, T2, T3 4 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về nấm Đông trùng Hạ Thảo Đông trùng Hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), có bản chất là loài nấm Cordyceps sinensic (thuộc nhóm Ascomycetes) mọc dạng ký sinh trên cơ thể sâu Hepialus fabricius.
Chúng được coi là một loài dược liệu quý. Phần dược tính của chúng đã được chứng minh là do các chất chiết xuất từ nấm Cordyceps sinensic. Sở dĩ có tên gọi "Đông trùng Hạ Thảo" là xuất phát từ quan sát thực tế. Vào mùa đông, một số sâu non thuộc chi Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis ký sinh.
Loại nấm này sẽ hút hết chất dinh dưỡng từ bên trong cơ thể ấu trùng rồi lớn lên theo dạng sợi. Sang mùa hè, sợi nấm Cordyceps sinensic phát triển mạnh, mọc chồi từ đầu con sâu và nhô lên khỏi mặt đất. Riêng tên “Đông trùng Hạ Thảo” được ghi chép là vị thuốc xuất hiện lần đầu tiên trong cuốn “Bản thảo cương mục” vào đời nhà Minh của danh y Lý Thời Trân (năm 1575), Đông trùng Hạ Thảo được xếp ngang với nhân sâm về công năng chữa bệnh – thuộc vào loại toàn diện nhất. Hai loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Trung Quốc là Cordyceps sinensis (tên khác: Ophiocordyceps sinensis) và Cordyceps militaris.
Đến nay, đã phát hiện được hơn 600 loài nấm Đông trùng Hạ Thảo thuộc chi Cordyceps nhưng chỉ có 2 loài được chú trọng nghiên cứu nhiều nhất là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris do có giá trị dược liệu cao. Ngoài tự nhiên, nấm Đông trùng Hạ Thảo thường được tìm thấy vào mùa hè, loài nấm C. sinensis phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao thuộc dãy núi Hymalaya có độ cao trên 4000 m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng Nepan và Butan; loài nấm C. militaris tìm thấy ở vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000-3000 m, phân bố rộng (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và các nước trong khu vực Đông Nam Á) (Sung, 1996; Li & cs.
Giới thiệu u chung về v nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps Cordyceps militaris) militaris 2. Vị trí phân loạii và đặc đ điểm Vị trí phân loạại Cordyceps militaris Cordyceps militaris (C. militaris) là loài nấm thuộc họ h Cordycipitaceae, chi Codyceps. Ban đầu, u, loài l này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi là Clavaria militaris (Kobayasi, 1982).
là chi đa dạng d nhất trong họ Clavicipitacese về v số lượng loài (hơn 400 loài) vớii phổ ph ký chủ rộng là ấu trùng và nhộng củaa các loài bướm, bư m, các loài côn trùng thuộc thu bộ cánh cứng (coleoptera), bộ cánh màng (Hymennoptera), bộ b hai cánh (diptera) (Kobayasi, 1982; Stensrud & cs., 2005) 2005 và có phân bố rộng rãi từ Châu Á sang Châu Âu và cả ở Bắc Mỹ (Paul Paul & cs. Loài nấm Cordyceps militaris có vị trí phân loại cụ thể như sau: Giới (Kingdom): Fungi Ngành (Division): Ascomycota Ngành phụụ (Subdivision): Pezizomycotina Lớpp (Class): Ascomycetes/ Pyrenomycetes Bộ (Order): Hypocreales Họ (Family): Cordycipitaceae Chi (Genus): Cordyceps Loài (Species): Cordyceps militaris Hình 2. militaris và mặt cắt dọc quả thể chứaa các bào tử t (Christian & Henry, 1837) 6 Đặc điểm củaa nấm n Cordyceps militaris: Nấm C. militaris thường có quả thể màu vàng nhạtt hoặc ho màu da cam (Zheng & cs., 2011), ), dài khoảng kho 8-10 cm.
Đầu quả thể nấm m tròn và có các đốm màu cam sáng. Quả thểể có mặt cắt ngang màu nhạt và rỗng ng ở giữa (Hình 2. Các nang bào tử nằm ở phần đầu quả thể dài từ 300-510 510 µm, bề b rộng 4 µm. Các bào tử nang hình sợi, i, không màu và phân đoạn, đo kích thướ ớc 3,5-6×1-1,5 µm.
Trong điều kiệnn nghèo dinh dưỡng, dư các bào tử nang này sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấpp (Paul ( & cs. Chu trình sống Giống như hầuu hết h các loài Cordyceps khác, C. militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu ấ trùng của côn trùng. Loài này chủ yếếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng củaa các loài bướm bư khác nhau, rồii nhân lên trong ký chủ ch vào mùa đông.
Bào tử nấm m theo gió dính vào bên b ngoài ký chủ, sau đó bào tử ử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám. Các ống này tiếtt ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của c ký chủ và xâm nhậpp vào bên trong cơ thể. th Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng ng và sinh trưởng trư mạnh chiếm toàn bộ cơ thể th và gây chết ký chủ. Đến cuối hè hoặcc thu, quả qu thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử t vào không khí (Koabayasi, 1982; Kamble amble & Agre, 2012).
Các quả thể nấm C. militaris thường có màu vàng nhạt hoặcc màu da cam (Zheng ( & cs.