Khóa luận xác định Deoxynivalenol và chất chuyển hóa trong ngô bằng LC-MS/MS - ĐH Dược Hà Nội

Nghiên cứu LC-MS/MS xác định Deoxynivalenol (DON) trong ngô và sản phẩm. Phương pháp thẩm định, đánh giá an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

• Tác giả: Lê Thị Lan Hương
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Ngân Bình
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây Dựng Và Thẩm Định Phương Pháp Xác Định Đồng Thời Deoxynivalenol Và Chất Chuyển Hóa Trong Ngô Và Sản Phẩm Từ Ngô Bằng LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ VI NẤM
• 1.1.1. Giới thiệu chung về độc tố vi nấm
• 1.1.2. Nguồn gốc, sự hình thành DON
• 1.1.3. Tính chất hóa lý và độc tính
• 1.1.4. Quy định hiện hành
• 1.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI NẤM
• 1.2.1. Phương pháp ELISA
• 1.2.2. Phương pháp sắc ký
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.2.2. Dung môi, hóa chất
• 2.2.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
• 3. CHƯƠNG 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 3.1. Khảo sát các điều kiện xác định DON và các chất chuyển hóa bằng LC-MS/MS
• 3.1.1. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
• 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng nền
• 3.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích
• 3.1.4. Đánh giá hàm lượng DON và các chất chuyển hóa trong một số mẫu thực tế
• 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
• 3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
• 3.2.3. Phương pháp thẩm định
• 3.2.3.1. Tính chọn lọc
• 3.2.3.2. Độ phù hợp hệ thống
• 3.2.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
• 3.2.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 3.2.3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi
• 3.2.4. Phương pháp lấy mẫu
• 3.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
• 4.1.1. Xây dựng phương pháp LC – MS/MS
• 4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ
• 4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký
• 4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
• 4.1.5. Khảo sát dung môi chiết
• 4.1.6. Khảo sát điều kiện chiết
• 4.1.7. Khảo sát thể tích dung môi
• 4.1.8. Khảo sát muối chiết
• 4.1.9. Khảo sát chất làm sạch
• 4.1.10. Khảo sát dung môi hoàn nguyên
• 4.1.11. Thẩm định phương pháp
• 4.1.11.1. Tính chọn lọc
• 4.1.11.2. Độ phù hợp hệ thống
• 4.1.11.3. Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện
• 4.1.11.4. Đánh giá ảnh hưởng nền
• 4.1.12. Xây dựng đường chuẩn
• 4.1.13. Độ đúng và độ lặp lại
• 4.2. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DON VÀ MỘT SỐ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG MẪU NGÔ VÀ SẢN PHẨM TỪ NGÔ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Deoxynivalenol DON LC MS MS Trong Ngô

An toàn thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là ở các quốc gia nhiệt đới như Việt Nam, nơi điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của các độc tố vi nấm. Deoxynivalenol (DON) là một trong những độc tố nấm mốc phổ biến, gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi. Việc kiểm soát DON trong ngô và sản phẩm ngô là vô cùng quan trọng. LC-MS/MS là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, cho phép xác định chính xác và định lượng DON và các chất chuyển hóa của nó. Nghiên cứu sử dụng LC-MS/MS để xây dựng phương pháp xác định đồng thời DON và các chất chuyển hóa của DON trong ngô và sản phẩm ngô, đánh giá mức độ ô nhiễm và cung cấp dữ liệu cho các nhà quản lý trong việc hoạch định chính sách an toàn thực phẩm.

1.1. Định Nghĩa Nguồn Gốc Deoxynivalenol DON Tổng Quan

Deoxynivalenol (DON) là một độc tố vi nấm được sản sinh bởi các loài nấm Fusarium. Các loài nấm này phát triển trên các loại ngũ cốc, đặc biệt là ngô, trong điều kiện độ ẩm cao và nhiệt độ thích hợp. DON có thể gây ra các vấn đề sức khỏe như nôn mửa, tiêu chảy, và suy giảm hệ miễn dịch. Theo Thrane, U [29], các loại nấm Fusarium ưa thích điều kiện ẩm ướt, tức là hoạt độ nước (hay độ ẩm tương đối – aw) cao 3 hơn 0,86 và phát triển tốt ở nhiệt độ từ khoảng 0oC đến 37oC.

1.2. Vì Sao Cần Kiểm Tra DON Trong Ngô và Sản Phẩm Từ Ngô

Ngô là một loại lương thực quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Sự ô nhiễm DON trong ngô có thể ảnh hưởng đến chuỗi cung ứng thực phẩm và gây thiệt hại kinh tế. Việc kiểm tra DON trong ngô và sản phẩm ngô là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Thách Thức Tác Động Của Deoxynivalenol DON Lên Sức Khỏe

Sự hiện diện của DON trong ngô và sản phẩm ngô đặt ra nhiều thách thức. DON có thể gây độc tính cho người và động vật, gây ra các triệu chứng cấp tính và mãn tính. Hơn nữa, các chất chuyển hóa của DON có thể khó phát hiện hơn và có thể gây ra các tác động độc hại khác. Sự thiếu hụt các nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của các quy định về độc tố vi nấm ở Việt Nam đặt ra những lo ngại về an toàn thực phẩm. Độc tính của DON ảnh hưởng đến nhiều cơ quan trong cơ thể, gây ra rối loạn từ ruột đến hệ miễn dịch. Vì vậy, việc xác định DON và đánh giá nguy cơ phơi nhiễm từ thực phẩm là hết sức quan trọng.

2.1. Ảnh Hưởng Của DON Đến Sức Khỏe Nguy Cơ Tiềm Ẩn

DON có thể gây ra nhiều tác động tiêu cực đến sức khỏe, bao gồm rối loạn tiêu hóa, suy giảm hệ miễn dịch, và ảnh hưởng đến chức năng não. Độc tính của DON ảnh hưởng đến nhiều cơ quan trong cơ thể, gây ra rối loạn từ ruột đến hệ miễn dịch [5]. Do đó, cần phải hiểu rõ về độc tính của DON và các biện pháp phòng ngừa.

2.2. Các Chất Chuyển Hóa Của DON Nguy Cơ Khó Lường

Các chất chuyển hóa của DON, như Deoxynivalenol-3-glucoside (D3G), có thể khó phát hiện hơn so với DON và có thể gây ra các tác động độc hại khác. Ronald Maul và các cộng sự [25] đã thực hiện một nghiên cứu liên quan đến sự nảy mầm của lúa mạch được xử lý DON và ghi nhận sự xuất hiện của việc “che” độc tố vi nấm này trên diện rộng dẫn đến sự gia tăng D3G.

III. Phương Pháp LC MS MS Giải Pháp Xác Định DON Hiệu Quả Nhất

LC-MS/MS là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, cho phép xác định DON và các chất chuyển hóa của nó với độ nhạy và độ chính xác cao. Kỹ thuật này kết hợp sắc ký lỏng để tách các chất phân tích và khối phổ để xác định và định lượng chúng. Mô hình hệ thống LC-MS/MS bao gồm các thành phần như bộ phận tách, bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích khối [hình 1.3, 1.4]. LC-MS/MS đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.1. Nguyên Lý Hoạt Động Của Phương Pháp LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các chất phân tích bằng sắc ký lỏng và sau đó xác định và định lượng chúng bằng khối phổ. Các chất phân tích được ion hóa và phân tách dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z). Tỷ lệ ion đối với LC-MS/MS được thể hiện trong bảng 1.5.

3.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của LC MS MS Trong Phân Tích DON

LC-MS/MS có nhiều ưu điểm so với các phương pháp xác định DON khác, bao gồm độ nhạy cao, độ chính xác cao, khả năng phân tích đồng thời nhiều chất phân tích, và khả năng xác định các chất chuyển hóa của DON. LC-MS/MS được sử dụng rộng rãi trong kiểm soát chất lượng ngô và sản phẩm ngô.

IV. Quy Trình LC MS MS Cách Xác Định Deoxynivalenol DON Chuẩn

Để xác định DON bằng LC-MS/MS, cần tuân thủ một quy trình chuẩn, bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chạy sắc ký lỏng, phân tích khối phổ, và xử lý dữ liệu. Quy trình này cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ chính xác cao. Các thông số quan trọng cần được kiểm soát, bao gồm thành phần pha động, tốc độ dòng, và nhiệt độ cột. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được minh họa trong hình 1.23.

4.1. Chuẩn Bị Mẫu Yếu Tố Quan Trọng Cho Kết Quả Chính Xác

Chuẩn bị mẫu là một bước quan trọng trong quy trình LC-MS/MS. Mẫu ngô hoặc sản phẩm ngô cần được chiết xuất để loại bỏ các chất gây nhiễu và làm giàu DON. Các phương pháp chiết xuất khác nhau có thể được sử dụng, tùy thuộc vào loại mẫu và mục tiêu phân tích. Dung môi chiết được khảo sát trong hình 1.14. Dung môi hoàn nguyên được khảo sát trong hình 1.17.

4.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Sắc Ký và Khối Phổ để Xác Định DON

Các điều kiện sắc ký và khối phổ cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ nhạy và độ chính xác cao. Các thông số quan trọng cần được kiểm soát, bao gồm thành phần pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, và điện áp ion hóa. Gradient và điều kiện sắc ký được khảo sát trong bảng 1.7 và 1.8.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Đánh Giá Mức Độ Nhiễm DON Trong Mẫu Ngô

Nghiên cứu đã áp dụng phương pháp LC-MS/MS để đánh giá mức độ nhiễm DON và các chất chuyển hóa của nó trong một số mẫu ngô và sản phẩm ngô. Kết quả cho thấy mức độ nhiễm DON trong các mẫu này khác nhau, và một số mẫu vượt quá giới hạn cho phép. Đánh giá ảnh hưởng nền (ME) cho thấy sự khác biệt giữa các nền mẫu [hình 1.24, 1.25]. LC-MS/MS là một công cụ hữu ích để giám sát mức độ nhiễm DON trong ngô và sản phẩm ngô và đảm bảo an toàn thực phẩm.

5.1. Xây Dựng Đường Chuẩn Nền Tảng Định Lượng DON Chính Xác

Việc xây dựng đường chuẩn là cần thiết để định lượng DON và các chất chuyển hóa của nó. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Các yếu tố như độ chệch từng điểm của đường chuẩn cần được đánh giá. Kết quả đường chuẩn được thể hiện trong bảng 1.12 và hình 1.26, 1.27.

5.2. Đánh Giá Độ Thu Hồi Độ Lặp Lại Của Phương Pháp LC MS MS

Độ thu hồi và độ lặp lại là các thông số quan trọng để đánh giá hiệu năng của phương pháp LC-MS/MS. Độ thu hồi cho biết khả năng thu hồi lại DON từ mẫu sau quá trình chiết xuất và làm sạch. Độ lặp lại cho biết độ ổn định của phương pháp khi phân tích nhiều lần cùng một mẫu. Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại được thể hiện trong bảng 1.13 và 1.14.

VI. Ứng Dụng Triển Vọng LC MS MS Cho An Toàn Ngô Tương Lai

Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp LC-MS/MS để xác định đồng thời DON và các chất chuyển hóa của nó trong ngô và sản phẩm ngô. Phương pháp này có thể được ứng dụng để giám sát mức độ nhiễm DON trong chuỗi cung ứng thực phẩm và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá nguy cơ phơi nhiễm DON và các chất chuyển hóa của nó từ thực phẩm và đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

6.1. Ứng Dụng LC MS MS Kiểm Soát Chất Lượng Ngô Toàn Diện

LC-MS/MS có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng ngô từ khâu sản xuất đến khâu tiêu thụ. Phương pháp này có thể giúp phát hiện và loại bỏ các lô ngô bị nhiễm DON vượt quá giới hạn cho phép.

6.2. Nghiên Cứu Tiếp Theo Đánh Giá Nguy Cơ và Biện Pháp Phòng Ngừa

Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá nguy cơ phơi nhiễm DON và các chất chuyển hóa của nó từ thực phẩm và đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Các nghiên cứu này nên tập trung vào việc xác định các nguồn ô nhiễm DON, đánh giá tác động của DON và các chất chuyển hóa của nó đến sức khỏe, và phát triển các biện pháp giảm thiểu ô nhiễm DON trong ngô và sản phẩm ngô.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

An toàn thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm là vấn đề sức khỏe cộng đồng trọng yếu. Tại các quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm như Việt Nam, điều kiện môi trường rất thuận lợi cho các loài nấm mốc sinh trưởng và tiết ra độc tố vi nấm (mycotoxin), đặc biệt là deoxynivalenol (DON) cùng các chất chuyển hóa liên quan trên các loại nông sản như ngô và ngũ cốc. Khi xâm nhập vào cơ thể người và vật nuôi, các độc tố này gây ngộ độc cấp tính hoặc tích lũy lâu dài dẫn đến ngộ độc mạn tính, tổn thương tế bào ruột, suy giảm miễn dịch và rối loạn nội tiết.

Thực vật có cơ chế tự bảo vệ chống lại độc tố vi nấm bằng cách biến đổi cấu trúc hóa học của chúng thông qua các phản ứng liên hợp enzym (như glycosyl hóa tạo thành deoxynivalenol-3-glucoside - D3G). Các hợp chất này được gọi là "độc tố vi nấm ngụy trang" (masked mycotoxins) hay độc tố vi nấm biến thể (modified mycotoxins). Dù có độc tính trực tiếp thấp hơn, D3G có thể bị thủy phân ngược lại giải phóng DON tự do dưới tác động của hệ vi sinh đường ruột hoặc trong quá trình chế biến thực phẩm. Hiện nay, các quy chuẩn kỹ thuật tại Việt Nam mới chỉ quy định ngưỡng giới hạn cho DON tự do (từ 200 µg/kg đối với sản phẩm cho trẻ nhỏ đến 1750 µg/kg đối với ngũ cốc chưa qua chế biến) mà chưa có quy chuẩn hay nghiên cứu công bố về các chất chuyển hóa ngụy trang như D3G.

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời deoxynivalenol (DON) và chất chuyển hóa deoxynivalenol-3-glucoside (D3G) trong ngô và sản phẩm từ ngô bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
2. Ứng dụng phương pháp đã thiết lập để phân tích và đánh giá sơ bộ mức độ ô nhiễm của DON và D3G trong một số mẫu ngô, bột ngô và ngũ cốc ăn liền lưu hành trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu là độc tố vi nấm DON và chất chuyển hóa D3G. Phạm vi đối tượng mẫu bao gồm mẫu ngô khô và các sản phẩm chế biến từ ngô (bột ngô, ngũ cốc ăn liền từ ngô) được thu thập ngẫu nhiên tại thị trường Hà Nội trong năm 2024. Thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Khoa Độc học và dị nguyên (Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

• Khái niệm độc tố vi nấm ngụy trang (Masked/Modified Mycotoxins): Khái niệm do Gareis và sau đó là Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA - CONTAM, 2014) định nghĩa, chỉ các dẫn xuất chuyển hóa của độc tố vi nấm do thực vật hoặc vi sinh vật tạo ra bằng cách liên hợp với các phân tử phân cực (như glucose, sulfate).
• Cơ chế chuyển hóa sinh học: Thực vật chuyển đổi DON ($C_{15}H_{20}O_6$, phân tử lượng 296,3) thành D3G ($C_{21}H_{30}O_{11}$, phân tử lượng 458,5) nhờ enzym glycosyltransferase để lưu trữ trong không bào hoặc liên kết vào thành tế bào.
• Khung pháp lý và khuyến nghị quốc tế:
  • Ủy ban Châu Âu (EC 1126/2007) và quy định Việt Nam về giới hạn tối đa cho phép của DON trong ngũ cốc.
  • Liều dung nạp hàng ngày (TDI) của DON do EC thiết lập là 1 µg/kg thể trọng/ngày.
  • Khuyến nghị của Ủy ban Chuyên gia Quốc tế về Phụ gia Thực phẩm (JECFA, 2010) về việc tính gộp D3G vào liều phơi nhiễm DON trong khẩu phần ăn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Xử lý mẫu theo kỹ thuật QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe): Tối ưu hóa quá trình chiết lỏng - lỏng kết hợp chiết phân tán pha rắn (d-SPE) để tinh sạch và làm giàu đồng thời hai hợp chất phân cực DON và D3G.
• Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS): Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu dò khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole), chế độ ion hóa phun mù điện tử dương (ESI+) và kỹ thuật ghi phổ phản ứng chọn lọc (MRM/SRM).
• Thẩm định phương pháp: Tiến hành theo hướng dẫn của AOAC International (2016) và tiêu chuẩn Ủy ban Châu Âu (Ủy định EU 2021/808) về các tiêu chí: tính chọn lọc/đặc hiệu (đánh giá điểm nhận dạng IP và tỷ số ion), độ phù hợp hệ thống, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, ảnh hưởng nền (Matrix Effect - ME%), độ lặp lại và độ thu hồi.
• Phương pháp lấy mẫu: Thu thập mẫu ngẫu nhiên theo quy định tại Thông tư 14/2011/TT-BYT của Bộ Y tế.

Nguồn dữ liệu và trang thiết bị thực nghiệm

• Chất chuẩn: Deoxynivalenol (Romer Labs, độ tinh khiết 100%) và Deoxynivalenol-3-glucoside 50 µg/mL trong Acetonitrile (LGC Standards GmbH).
• Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu HPLC (bơm LC-20AD XR / LC-30AD XR, bộ ổn nhiệt CTO-30A, bộ tiêm tự động SIL-30AC XR) ghép nối khối phổ AB Sciex Triple Quad 6500.
• Hóa chất, phụ liệu: Cột UPLC BEH C18 (150 mm × 2,1 mm; 1,7 µm - Waters), chất hấp phụ d-SPE (PSA, C18, GCB - Agilent), dung môi sắc ký methanol, acetonitril (Merck), muối $MgSO_4$ khan, $CH_3COONa$.
• Xử lý dữ liệu: Phần mềm Analyst 1.6.3 (AB Sciex) thu nhận phổ và Microsoft Excel 2010 xử lý số liệu thống kê.

---

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan về độc tố vi nấm

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về nguồn gốc sinh nấm (chủ yếu là Fusarium graminearum và Fusarium culmorum hoạt động ở hoạt độ nước $a_w \ge 0,86$ và nhiệt độ 0–37°C). Phân tích cấu trúc hóa học đặc trưng bởi vòng 12,13-epoxy trichothecene quyết định độc tính tế bào của DON (nhiễm độc riboxom, ức chế tổng hợp protein, tổn thương hàng rào niêm mạc ruột, biến đổi cấu trúc gen và ức chế miễn dịch).

Tác giả so sánh các phương pháp phân tích mycotoxin phổ biến: phương pháp miễn dịch gắn enzym (ELISA) có ưu điểm nhanh nhưng dễ gặp hiện tượng phản ứng chéo gây sai số dương (phản ứng chéo của D3G với kháng thể DON lên tới 32–104%); phương pháp sắc ký gián tiếp qua thủy phân khó kiểm soát hiệu suất; do đó kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) xác định trực tiếp là giải pháp tối ưu về độ đặc hiệu và độ nhạy.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hóa chất, chuẩn đơn/chuẩn hỗn hợp, thiết bị và các bước xây dựng quy trình thực nghiệm. Thiết lập phương pháp xử lý mẫu chiết QuEChERS có bổ sung acid hóa, khảo sát các pha tĩnh và pha động sắc ký, đánh giá ảnh hưởng làm tăng hoặc triệt tiêu ion của nền mẫu (Matrix Effect). Quy định các tiêu chí chấp nhận thẩm định: điểm nhận dạng IP $\ge 5$, sai lệch tỷ số ion trong ngưỡng EU 2021/808, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic $\le 2%$, hệ số tương quan $R^2 \ge 0,99$, độ chệch điểm chuẩn $\le \pm 15%$ ($\le \pm 20%$ tại LOQ).

Kết quả nghiên cứu

Trình bày kết quả khảo sát tối ưu hóa từng thông số thiết bị khối phổ, điều kiện sắc ký, quy trình chiết mẫu và dữ liệu thẩm định phương pháp:

[Mẫu ngô/ngũ cốc: 2,5 g] 
[Siêu âm chiết 30 phút]
[Thu 7 mL dịch chiết lớp trên]
[Thu 5 mL dịch trong]
[Tiêm vào hệ thống LC-MS/MS]

• Tối ưu hóa điều kiện MS/MS: Khảo sát cho thấy ở chế độ ion hóa dương ESI(+), D3G bị phân mảnh mất gốc glucose ngay tại nguồn ion tạo ra mảnh ion giống DON ($m/z$ 297). Do đó, ion mẹ và mảnh ion con của hai chất trên khối phổ bị trùng nhau ($297 \rightarrow 249,1$ và $297 \rightarrow 231,1$), bắt buộc phải phân tách hoàn toàn hai chất trên cột sắc ký.
• Tối ưu hóa sắc ký: Lựa chọn cột Waters UPLC BEH C18 (150 mm × 2,1 mm; 1,7 µm) kết hợp pha động chứa đệm amoni acetat 5 mM và acid acetic 0,1% chạy chương trình gradient trong 15 phút, đạt độ phân giải phân tách DON và D3G là $R_s = 1,2$.
• Tối ưu hóa xử lý mẫu: Sử dụng dung môi chiết acetonitril chứa 1% acid acetic, hỗ trợ chiết bằng máy rung siêu âm 30 phút; hệ muối phân tách pha gồm 4 g $MgSO_4$ khan + 1,5 g $CH_3COONa$; hệ làm sạch d-SPE phối hợp 150 mg $MgSO_4$ + 25 mg C18 + 25 mg PSA cho mỗi mL dịch chiết; dung môi hoàn nguyên MeOH:nước (2:8).
• Thẩm định và ứng dụng: Phương pháp đạt độ chọn lọc cao (5 điểm IP theo EU 2021/808), loại trừ ảnh hưởng nền âm (-7,6% đến -26,5%) bằng cách dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng (Matrix-matched calibration). Ứng dụng thử nghiệm phân tích trên các mẫu ngô thực tế trên thị trường.

Kiến nghị và kết luận

Tổng hợp các kết quả thực nghiệm đạt được, khẳng định phương pháp QuEChERS kết hợp LC-MS/MS đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quốc tế và khuyến nghị các cơ quan quản lý mở rộng kiểm soát chất chuyển hóa D3G trong giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm định lượng

Thông số phân tích	Deoxynivalenol (DON)	Deoxynivalenol-3-glucoside (D3G)
Ion mẹ ($m/z$) / Ion con ($m/z$)	$297 \rightarrow 249,1$ (định lượng); $297 \rightarrow 231,1$ (định tính)	$297 \rightarrow 249,1$ (định lượng); $297 \rightarrow 231,1$ (định tính)
Thế phân ly DP (eV) / Năng lượng va chạm CE (eV)	130 eV / 12 eV (định lượng); 18 eV (định tính)	130 eV / 12 eV (định lượng); 18 eV (định tính)
Thời gian lưu ($t_R \pm$ RSD%)	7,26 phút (RSD = 0,07%)	7,00 phút (RSD = 0,17%)
Độ lặp lại diện tích pic (RSD%, n=6)	1,12%	1,81%
LOD trên nền ngô / ngũ cốc	10 µg/kg / 6 µg/kg	20 µg/kg / 20 µg/kg
LOQ trên nền ngô / ngũ cốc	20 µg/kg / 20 µg/kg	40 µg/kg / 40 µg/kg
Khoảng tuyến tính nồng độ	50 – 500 ng/mL (tương đương 20 – 200 µg/kg mẫu)	50 – 500 ng/mL (tương đương 20 – 200 µg/kg mẫu)
Hệ số tương quan ($R^2$)	> 0,99 (Nền ngô: 0,9964; Nền ngũ cốc: 0,9959)	> 0,99 (Nền ngô: 0,9932; Nền ngũ cốc: 0,9952)
Ảnh hưởng nền mẫu (ME%)	-13,4% đến -7,6% (ngô); -26,5% đến -20,9% (ngũ cốc)	-13,4% đến -7,6% (ngô); -26,5% đến -20,9% (ngũ cốc)
Độ thu hồi và độ lặp lại	Đạt yêu cầu AOAC tại 4 mức nồng độ (20, 40, 80, 200 µg/kg)	Đạt yêu cầu AOAC tại 4 mức nồng độ (20, 40, 80, 200 µg/kg)

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng quy trình phân tích đồng thời DON và D3G bằng LC-MS/MS đã được thẩm định vào hoạt động kiểm nghiệm thường quy tại các trung tâm kiểm nghiệm thực phẩm.
• Kiến nghị các nhà quản lý y tế và an toàn thực phẩm tại Việt Nam sớm nghiên cứu bổ sung quy định giới hạn tối đa cho phép đối với các chất chuyển hóa ngụy trang của mycotoxin (đặc biệt là D3G), tạo dựng hàng rào kỹ thuật kiểm soát chất lượng nông sản nhập khẩu và bảo vệ người tiêu dùng.

Đóng góp mới của công trình

• Là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam xây dựng quy trình phân tích hoàn chỉnh cho độc tố vi nấm dạng chuyển hóa/ngụy trang (D3G) cùng với chất mẹ DON trên nền mẫu nông sản ngô.
• Giải quyết thành công hiện tượng trùng lặp mảnh khối phổ ($m/z$ 297) giữa DON và D3G ở chế độ ESI(+) bằng việc tối ưu hóa pha tĩnh hạt siêu nhỏ UPLC C18 (1,7 µm) và pha động chứa đệm phân cực, giúp tách sắc ký hoàn toàn hai chất ($R_s = 1,2$) trong thời gian phân tích ngắn (15 phút).
• Tối ưu hóa kỹ thuật QuEChERS cải tiến (phối hợp $MgSO_4$, $CH_3COONa$, PSA và C18 kết hợp rung siêu âm), tiết kiệm dung môi hữu cơ và giảm thiểu tạp chất gây ức chế ion so với các phương pháp chiết cột SPE hay cột ái lực miễn dịch (IAC) đắt tiền.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một chất chuyển hóa chính là D3G, chưa mở rộng định lượng đồng thời các dẫn xuất acetyl khác như 3-acetyldeoxynivalenol (3ADON) và 15-acetyldeoxynivalenol (15ADON) hoặc các độc tố trichothecene liên quan.
  • Số lượng và phạm vi mẫu thực nghiệm khảo sát thực tế còn hạn chế, chủ yếu lấy ngẫu nhiên trên địa bàn Hà Nội, chưa phản ánh toàn diện dịch tễ ô nhiễm độc tố vi nấm trên các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau của cả nước.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Phát triển phương pháp phân tích đa độc tố mở rộng, tích hợp đồng thời nhiều nhóm mycotoxin tự do và masked mycotoxins (Aflatoxin, Ochratoxin, Fumonisin, Zearalenone cùng các dẫn xuất liên hợp).
  • Triển khai điều tra, giám sát trên diện rộng quy mô quốc gia về mức độ phơi nhiễm D3G và DON trong các chuỗi cung ứng ngô và ngũ cốc dinh dưỡng tại Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Giảng viên, sinh viên, học viên sau đại học thuộc các chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và độc chất, Vệ sinh an toàn thực phẩm, Công nghệ thực phẩm và Độc học môi trường.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình chiết mẫu QuEChERS cải tiến chi tiết từng bước (khối lượng muối đệm, chất hấp phụ làm sạch d-SPE) áp dụng cho các nền mẫu thực phẩm giàu tinh bột và chất béo.
  • Các thông số tối ưu hóa phần cứng khối phổ (áp suất khí CUR, CAD, thế phun IS, nhiệt độ nguồn TEM, thế DP, CE) và chương trình gradient UPLC phân tách các hợp chất có cùng số khối phân mảnh.
  • Phương pháp luận thẩm định phân tích lượng vết theo quy chuẩn quốc tế AOAC 2016 và Ủy ban Châu Âu EU 2021/808.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần xác định đồng thời D3G cùng với DON dù D3G có độc tính trực tiếp thấp hơn?

Thực vật chuyển hóa DON thành D3G như một cơ chế tự giải độc. Mặc dù D3G bền trong môi trường acid dạ dày và không bị enzym cytosolic $\beta$-glucosidase của người phân giải, nhưng các chủng vi khuẩn sinh acid lactic trong đại tràng (như Enterococcus durans, Lactobacillus plantarum) và quá trình chế biến thực phẩm có thể thủy phân liên kết glucoside, giải phóng DON tự do trở lại dạng có độc tính cao. JECFA đã khuyến cáo coi D3G là yếu tố đóng góp trực tiếp vào tổng mức phơi nhiễm DON trong khẩu phần ăn.

2. Thách thức lớn nhất trong việc phân tích D3G bằng đầu dò LC-MS/MS ở chế độ ESI(+) là gì và nghiên cứu đã xử lý như thế nào?

Ở chế độ ESI(+), liên kết glucoside của D3G rất kém bền, phân tử D3G dễ bị mất gốc glucose ngay tại nguồn ion hóa để tạo ra tiền ion $m/z$ 297, trùng hoàn toàn với ion mẹ của DON. Cả hai chất sau đó đều cho các mảnh ion con phân đoạn giống nhau ($m/z$ 249,1 và $m/z$ 231,1). Nghiên cứu đã giải quyết triệt để thách thức này bằng cách tối ưu hóa điều kiện sắc ký trên cột Waters UPLC BEH C18 (1,7 µm) với pha động gradient chứa đệm amoni acetat 5 mM và acid acetic 0,1%, tách biệt hoàn toàn thời gian lưu của hai chất ($t_R$ của D3G là 7,00 phút, $t_R$ của DON là 7,26 phút, độ phân giải $R_s = 1,2$).

3. Quy trình QuEChERS tối ưu trong khóa luận gồm những thành phần cụ thể nào?

Quy trình xử lý 2,5 g mẫu ngô gồm:

• Chiết xuất: 7,5 mL nước cất kết hợp 10 mL acetonitril chứa 1% acid acetic, hỗ trợ rung siêu âm trong 30 phút.
• Phân tách pha: Hỗn hợp 4,0 g $MgSO_4$ khan và 1,5 g $CH_3COONa$, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút.
• Làm sạch d-SPE: Hút 7 mL dịch chiết lớp trên trộn với 1050 mg $MgSO_4$, 175 mg C18 và 175 mg PSA (tương ứng tỷ lệ 150 mg $MgSO_4$, 25 mg C18, 25 mg PSA cho mỗi mL dịch chiết).
• Hoàn nguyên: Thổi khô 5 mL dịch trong dưới dòng khí $N_2$ ở 40°C, hòa tan cặn bằng 0,5 mL dung môi hỗn hợp MeOH:nước (2:8).

4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp đạt được là bao nhiêu?

Trên nền mẫu ngô, LOD của DON là 10 µg/kg, LOQ là 20 µg/kg; LOD của D3G là 20 µg/kg, LOQ là 40 µg/kg. Trên nền ngũ cốc ăn liền, LOD của DON là 6 µg/kg, LOQ là 20 µg/kg; LOD của D3G là 20 µg/kg, LOQ là 40 µg/kg. Các giá trị LOQ này thấp hơn nhiều so với ngưỡng giới hạn quy định hiện hành của Châu Âu và Việt Nam đối với DON (200 – 1750 µg/kg), đảm bảo độ nhạy kiểm nghiệm hàm lượng vết.

5. Nghiên cứu đã xử lý hiện tượng ảnh hưởng nền mẫu (Matrix Effect) như thế nào?

Đánh giá ảnh hưởng nền cho thấy sự triệt tiêu tín hiệu ion đáng kể trên cả nền ngô (ME% từ -13,4% đến -7,6%) và nền ngũ cốc dinh dưỡng (ME% từ -26,5% đến -20,9%, vượt ngưỡng sai lệch cho phép $\pm 20%$). Để loại trừ triệt để sai số do nền mẫu gây ra mà không làm phát sinh chi phí dùng chất chuẩn nội đồng vị đánh dấu, tác giả đã sử dụng kỹ thuật dựng đường chuẩn trên dịch chiết nền mẫu trắng (Matrix-matched calibration curve), đưa hệ số tương quan $R^2$ đạt trên 0,99.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của dược sĩ Lê Thị Lan Hương đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp xác định đồng thời deoxynivalenol (DON) và chất chuyển hóa deoxynivalenol-3-glucoside (D3G) trong ngô và sản phẩm từ ngô bằng kỹ thuật QuEChERS kết hợp UPLC-MS/MS. Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao, giới hạn định lượng thấp (LOQ 20 µg/kg cho DON và 40 µg/kg cho D3G), độ lặp lại và độ thu hồi tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn AOAC 2016 và EU 2021/808. Đây là công trình thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, cung cấp quy trình phân tích tin cậy phục vụ công tác kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và hỗ trợ cơ sở dữ liệu cho việc hoạch định chính sách quản lý độc tố vi nấm ngụy trang tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn thực phẩm và các bệnh do thực phẩm đã và đang là vấn đề của nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam. Sức khỏe, tính mạng của con người bị đe dọa bởi tác nhân gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm. Sử dụng các thực phẩm không đảm bảo vệ sinh trước mắt có thể bị ngộ độc cấp tính với các triệu chứng nhanh, dễ nhận thấy. Nguy hiểm hơn nữa là sự tích lũy của các chất độc hại ở một số cơ quan gây ngộ độc mạn tính hoặc có thể gây ra các dị tật, dị dạng.

Việt Nam là nước nhiệt đới, có khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của các độc tố vi nấm, trong đó có deoxynivalenol (DON) và các chất chuyển hóa liên quan. Khi người và vật nuôi sử dụng các lương thực thực phẩm bị nhiễm độc tố vi nấm, có thể gây ra các ảnh hưởng không mong muốn đối với sức khỏe. Các quy định tại Việt Nam về độc tố vi nấm đều dựa trên các tiêu chuẩn quốc tế. Vẫn còn thiếu các nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của các quy định này với điều kiện tại Việt Nam, cũng như thực trạng mối nguy đối với sức khỏe do phơi nhiễm độc tố vi nấm từ thực phẩm, trong đó có DON và các chất chuyển hóa.

Tuy đã có quy định về kiểm soát DON trong thực phẩm [3] nhưng chưa có nghiên cứu được công bố cũng như bất cứ quy định nào về các chất chuyển hóa của DON, cần có các nghiên cứu dài hạn để làm cơ sở khoa học cho các nhà quản lý trong việc hoạch định các chính sách phù hợp với mục tiêu đảm bảo quyền lợi, sức khỏe người tiêu dùng và tăng tính cạnh tranh cho các sản phẩm nông sản của Việt Nam trên thị trường quốc tế đồng thời cũng là hàng rào kỹ thuật ngăn chặn các thực phẩm giá rẻ độc hại xâm nhập vào thị trường nước ta. Do đó, đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời Deoxynivalenol và chất chuyển hóa trong ngô và sản phẩm từ ngô bằng LC-MS/MS” được thực hiện với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời DON và chất chuyển hóa của DON trong ngô và sản phẩm từ ngô bằng sắc ký lỏng khối phổ. Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá sơ bộ mức độ ô nhiễm chất chuyển hóa của DON trong ngô và sản phẩm từ ngô.

Tổng quan về độc tố vi nấm 1. Giới thiệu chung về độc tố vi nấm Độc tố vi nấm là các chất hóa học có độc tính được sinh ra trong tự nhiên bởi một số chủng vi nấm có khả năng sinh độc tố. Thuật ngữ độc tố vi nấm (mycotoxin) bắt nguồn từ thuật ngữ “mykes” trong tiếng Hy lạp có nghĩa là vi nấm và thuật ngữ “toxicum” trong tiếng La tinh có nghĩa là chất độc. Độc tố vi nấm là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có độc tính do một số loài vi nấm tổng hợp trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào trong các điều kiện xác định.

Các độc tố này có thể gây bệnh hoặc gây tử vong cho người và động vật. Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái. Thuật ngữ mycotoxin thường được áp dụng hạn chế cho các độc tố vi nấm ngoại bào có độc tính đối với động vật máu nóng [5]. Các độc tố vi nấm thường phát triển trên các loại ngũ cốc (ngô, gạo, đậu…) và các loại hạt có dầu (lạc, đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng…), do đó làm ô nhiễm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.