Xây Dựng Phương Pháp LC-MS/MS Để Xác Định Họ Sulfonamide Trong Thủy Sản

Bài viết trình bày phương pháp LC-MS/MS để xác định họ sulfonamide trong thủy sản, đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe người tiêu dùng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bạch Yến
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Trọng
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Phương Pháp LC-MS/MS Xác Định Họ Sulfonamide Trong Thủy Sản
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kháng sinh
• 1.2. Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc
• 1.3. Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide
• 1.4. Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs
• 1.5. Phân loại thuốc SAs
• 1.6. Các tác dụng phụ của SAs
• 1.7. Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs
• 1.8. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ
• 1.8.1. Các loại đầu dò khối phổ
• 1.8.2. Các kỹ thuật ghi phổ
• 1.9. Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố
• 1.9.1. Một số kết quả nghiên cứu phương pháp xác định kháng sinh họ Sulfonamide trong và ngoài nước
• 1.9.2. Ưu và hạn chế của các nghiên cứu đã công bố
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất – chất chuẩn
• 2.2. Nội dung thực hiện
• 2.2.1. Chuẩn bị hóa chất, pha động, dung dịch chuẩn
• 2.2.2. Chuẩn bị mẫu khảo sát
• 2.2.3. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm
• 2.2.3.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
• 2.2.3.2. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
• 2.2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích họ Sulfonamide trong thủy sản
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thực nghiệm
• 3.1.1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
• 3.1.2. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
• 3.2. Thẩm định phương pháp
• 3.2.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
• 3.2.2. Ảnh hưởng của nền mẫu (ME)
• 3.2.3. Xác định MDL, MQL của phương pháp
• 3.2.4. Hiệu suất thu hồi, độ lặp, độ tái lập
• 3.2.5. Độ không đảm bảo đo
• 3.3. Ứng dụng phân tích họ Sulfonamide trong nền mẫu thủy sản
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp LC MS MS xác định họ Sulfonamide trong thủy sản

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là trong thủy sản. Họ Sulfonamide là một nhóm kháng sinh phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản. Việc phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất này là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm và đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế.

1.1. Khái niệm về họ Sulfonamide và ứng dụng trong thủy sản

Họ Sulfonamide bao gồm nhiều loại kháng sinh khác nhau, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng trong động vật. Việc sử dụng chúng trong nuôi trồng thủy sản có thể dẫn đến dư lượng trong sản phẩm, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

1.2. Tầm quan trọng của việc xác định dư lượng Sulfonamide

Việc xác định dư lượng Sulfonamide trong thủy sản không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm xuất khẩu, đáp ứng các quy định quốc tế về an toàn thực phẩm.

II. Vấn đề và thách thức trong việc xác định họ Sulfonamide

Mặc dù phương pháp LC-MS/MS đã được phát triển, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định chính xác dư lượng Sulfonamide trong thủy sản. Các vấn đề như sự phân hủy của hợp chất, sự tương tác với các thành phần khác trong mẫu và độ nhạy của phương pháp là những yếu tố cần được xem xét.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp

Độ chính xác của phương pháp LC-MS/MS có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như loại mẫu, phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

2.2. Thách thức trong việc thu thập mẫu và xử lý

Việc thu thập mẫu từ các nguồn khác nhau và xử lý chúng để loại bỏ tạp chất là một thách thức lớn. Các phương pháp xử lý mẫu như QuEChERS và DSPE cần được áp dụng một cách hiệu quả để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

III. Phương pháp LC MS MS trong xác định họ Sulfonamide

Phương pháp LC-MS/MS được sử dụng để xác định đồng thời nhiều hợp chất Sulfonamide trong mẫu thủy sản. Phương pháp này cho phép phát hiện và định lượng chính xác các hợp chất với độ nhạy cao, đáp ứng yêu cầu của các tiêu chuẩn quốc tế.

3.1. Quy trình thực hiện phương pháp LC MS MS

Quy trình thực hiện phương pháp LC-MS/MS bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, phân tích và xử lý dữ liệu. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phân tích

Tối ưu hóa các điều kiện phân tích như loại cột, dung môi và tốc độ dòng chảy là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các thông số này có thể cải thiện đáng kể độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp LC MS MS trong nghiên cứu

Phương pháp LC-MS/MS đã được áp dụng để phân tích mẫu thực tế từ các chợ dân sinh tại TP.HCM. Kết quả cho thấy nhiều mẫu thủy sản có dư lượng Sulfonamide vượt mức cho phép, điều này cho thấy sự cần thiết phải kiểm soát chặt chẽ hơn trong ngành nuôi trồng thủy sản.

4.1. Kết quả phân tích mẫu thực tế

Kết quả phân tích cho thấy một số mẫu tôm và cá chẽm có dư lượng Sulfonamide cao, điều này cần được chú ý để đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

4.2. Ý nghĩa của kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin về tình trạng dư lượng Sulfonamide trong thủy sản mà còn giúp các cơ quan chức năng đưa ra các biện pháp kiểm soát hiệu quả hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về phương pháp LC-MS/MS trong xác định họ Sulfonamide trong thủy sản đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc kiểm soát chất lượng thực phẩm. Việc áp dụng phương pháp này sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm thủy sản xuất khẩu và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

5.1. Tương lai của phương pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS có tiềm năng lớn trong việc phát triển các kỹ thuật phân tích mới, giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong việc xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện quy trình phân tích và mở rộng ứng dụng của phương pháp LC-MS/MS trong các lĩnh vực khác như thực phẩm và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng thủy sản lớn với nhu cầu xuất khẩu cao. Tuy nhiên, giá trị xuất khẩu thủy sản vẫn còn thấp do chất lượng sản phẩm chưa được kiểm soát chặt chẽ, đặc biệt là vấn đề dư lượng kháng sinh trong thủy sản. Dư lượng kháng sinh, nhất là họ Sulfonamide, là một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến chất lượng và an toàn thực phẩm, đồng thời gây ra nguy cơ kháng thuốc ở vi khuẩn. Theo quy định quốc tế như Quy Định Liên Minh Châu Âu (EU) số 37/2010, dư lượng tối đa cho phép (MRL) của Sulfonamide trong thực phẩm thủy sản là 100 µg/kg. Tại Việt Nam, các quy định hiện hành cũng đặt ra giới hạn tương tự nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và nâng cao giá trị xuất khẩu.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng một phương pháp phân tích hiệu quả, chính xác và đáng tin cậy để xác định đồng thời 19 hoạt chất thuộc họ Sulfonamide trong các mẫu thủy sản phổ biến như tôm, cá chẽm và cá tra. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào các mẫu thủy sản thu thập ngẫu nhiên tại các chợ dân sinh trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2022. Nghiên cứu nhằm cung cấp công cụ phân tích hiện đại, đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế, góp phần kiểm soát dư lượng kháng sinh, nâng cao chất lượng thủy sản Việt Nam trên thị trường trong nước và quốc tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó nổi bật là:

• Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS): Kỹ thuật này kết hợp khả năng tách riêng của sắc ký lỏng với độ nhạy và độ chọn lọc cao của khối phổ, cho phép xác định đồng thời nhiều hợp chất trong mẫu phức tạp. Đầu dò Triple Quadrupole (QQQ) được sử dụng để tăng cường độ chính xác và độ nhạy trong việc phát hiện các ion đặc trưng của Sulfonamide.

• Phương pháp chiết QuEChERS: Đây là phương pháp chiết mẫu nhanh, đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm chi phí, phù hợp với việc xử lý mẫu thủy sản có ma trận phức tạp. QuEChERS kết hợp với bước làm sạch DSPE giúp loại bỏ tạp chất, nâng cao độ chính xác của phân tích.

Các khái niệm chính bao gồm: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, độ chính xác (RSD), và độ không đảm bảo đo. Nghiên cứu cũng tuân thủ các hướng dẫn quốc tế như SANTE/11813/2017 và tiêu chuẩn AOAC để đảm bảo tính hợp lệ và khả năng áp dụng rộng rãi.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu thủy sản tươi sống gồm tôm, cá chẽm và cá tra được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ dân sinh ở TP. Hồ Chí Minh. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ ≤ -18ºC trước khi phân tích.

Phương pháp phân tích gồm các bước:

• Xây dựng phương pháp LC-MS/MS: Khảo sát và tối ưu hóa các thông số sắc ký như loại cột (C8, C18), chương trình gradient pha động, dung môi chiết, và các thông số đầu dò MS để đạt độ nhạy tối ưu cho 19 hoạt chất Sulfonamide.

• Xây dựng quy trình xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS kết hợp với làm sạch DSPE để chiết xuất và loại bỏ tạp chất từ mẫu thủy sản. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết (acetonitrile, acetonitrile pha axit acetic hoặc axit formic) và các loại bột làm sạch DSPE khác nhau.

• Thẩm định phương pháp: Đánh giá độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lượng (MQL), độ chính xác (độ lặp RSDr, độ tái lập RSDR), hiệu suất thu hồi và độ không đảm bảo đo theo hướng dẫn SANTE/11813/2017 và AOAC.

Quá trình nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2022, tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phương pháp LC-MS/MS được xây dựng thành công:

   • Sử dụng cột GL Inert Sustain C18 (2,1 x 100 mm, 3 µm) cho hiệu quả tách sắc ký tốt nhất trong ba loại cột khảo sát.
   • Chương trình gradient pha động MeOH/H2O (0,1% HCOOH) được tối ưu giúp phân tách đồng thời 19 hoạt chất Sulfonamide với thời gian phân tích khoảng 15 phút.

2. Quy trình xử lý mẫu tối ưu:

   • Dung môi chiết acetonitrile pha 1% axit acetic cho hiệu suất thu hồi cao nhất, đạt từ 84,7% đến 105,8% tùy nền mẫu.
   • DSPE chứa MgSO4, C18 và PSA được chọn làm bột làm sạch tối ưu, giúp giảm thiểu tạp chất nền và tăng độ chính xác phân tích.

3. Thẩm định phương pháp:

   • Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của các hoạt chất trong nền cá chẽm dao động từ 0,83 – 2,79 µg/kg và 1,76 – 9,30 µg/kg; trong nền cá tra từ 0,87 – 2,45 µg/kg và 2,89 – 8,16 µg/kg; trong nền tôm từ 0,88 – 2,16 µg/kg và 2,94 – 7,19 µg/kg.
   • Độ chính xác trong ngày (RSD) của nền cá chẽm từ 2,64% đến 12,34%, cá tra từ 2,66% đến 9,18%, tôm từ 2,32% đến 9,48%, đều đáp ứng tiêu chuẩn AOAC.
   • Độ thu hồi mẫu đạt từ 84,7% đến 105,9%, phù hợp với yêu cầu phân tích dư lượng kháng sinh.

4. Phân tích mẫu thực tế:

   • Phát hiện dư lượng Sulfamethoxazole trong một số mẫu tôm và cá tại các chợ dân sinh TP. Hồ Chí Minh, tuy nhiên mức dư lượng đều nằm dưới giới hạn cho phép 100 µg/kg.
   • Kết quả cho thấy phương pháp có thể ứng dụng hiệu quả trong kiểm soát chất lượng thủy sản.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp LC-MS/MS kết hợp với quy trình xử lý mẫu QuEChERS và DSPE là phù hợp để xác định đồng thời 19 hoạt chất Sulfonamide trong thủy sản. Việc lựa chọn cột C18 và dung môi pha axit formic hoặc axit acetic giúp tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp. So với các nghiên cứu trước đây, giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp này thấp hơn hoặc tương đương, đáp ứng yêu cầu kiểm soát dư lượng kháng sinh theo tiêu chuẩn quốc tế.

Phân tích mẫu thực tế tại TP. Hồ Chí Minh cho thấy dư lượng Sulfamethoxazole là phổ biến nhất, phù hợp với xu hướng sử dụng Sulfonamide trong nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam. Mức dư lượng dưới ngưỡng cho phép chứng tỏ hiệu quả kiểm soát và quản lý kháng sinh trong ngành thủy sản đang được cải thiện. Tuy nhiên, việc phát hiện vẫn cho thấy cần tiếp tục giám sát chặt chẽ để tránh nguy cơ tích tụ và kháng thuốc.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hiệu suất thu hồi và độ chính xác của từng nền mẫu, bảng tổng hợp MDL, MQL và biểu đồ phân bố dư lượng Sulfamethoxazole trong mẫu thực tế, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả và ứng dụng của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thủy sản:

   • Mục tiêu: Nâng cao năng lực kiểm soát dư lượng Sulfonamide.
   • Thời gian: Triển khai trong 6 tháng tới.
   • Chủ thể thực hiện: Các trung tâm kiểm nghiệm, cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm.

2. Tăng cường giám sát dư lượng kháng sinh trong thủy sản tại các vùng nuôi và chợ đầu mối:

   • Mục tiêu: Phát hiện sớm và xử lý kịp thời các mẫu vượt ngưỡng.
   • Thời gian: Thường xuyên hàng quý.
   • Chủ thể thực hiện: Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Chi cục Thú y.

3. Đào tạo và nâng cao nhận thức cho người nuôi trồng thủy sản về sử dụng kháng sinh hợp lý:

   • Mục tiêu: Giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát.
   • Thời gian: Tổ chức các khóa đào tạo trong 12 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Các tổ chức đào tạo, hiệp hội thủy sản.

4. Xây dựng và hoàn thiện các quy định pháp lý về dư lượng kháng sinh trong thủy sản:

   • Mục tiêu: Đồng bộ tiêu chuẩn với quốc tế, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
   • Thời gian: Rà soát và đề xuất trong 1 năm.
   • Chủ thể thực hiện: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà khoa học và nghiên cứu trong lĩnh vực hóa phân tích và an toàn thực phẩm:

   • Lợi ích: Tham khảo phương pháp phân tích hiện đại, áp dụng trong nghiên cứu và kiểm nghiệm.
   • Use case: Phát triển các phương pháp phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, kháng sinh khác.

2. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và thủy sản:

   • Lợi ích: Cơ sở khoa học để xây dựng chính sách, quy chuẩn kiểm soát dư lượng kháng sinh.
   • Use case: Thiết lập chương trình giám sát chất lượng thủy sản xuất khẩu.

3. Doanh nghiệp sản xuất và xuất khẩu thủy sản:

   • Lợi ích: Nắm bắt tình hình dư lượng kháng sinh, đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn quốc tế.
   • Use case: Kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào, nâng cao uy tín thương hiệu.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành hóa phân tích, công nghệ thực phẩm:

   • Lợi ích: Tài liệu tham khảo về kỹ thuật LC-MS/MS và quy trình xử lý mẫu QuEChERS.
   • Use case: Học tập, nghiên cứu và phát triển đề tài liên quan đến phân tích dư lượng hóa chất trong thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với các phương pháp phân tích khác?
   LC-MS/MS kết hợp khả năng tách riêng sắc ký lỏng với độ nhạy và chọn lọc cao của khối phổ, cho phép xác định đồng thời nhiều hợp chất trong mẫu phức tạp với giới hạn phát hiện rất thấp, phù hợp cho phân tích dư lượng kháng sinh trong thủy sản.

2. Tại sao chọn phương pháp QuEChERS để xử lý mẫu?
   QuEChERS là phương pháp chiết mẫu nhanh, đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm chi phí, đặc biệt phù hợp với mẫu có ma trận phức tạp như thủy sản, giúp loại bỏ tạp chất và tăng độ chính xác của phân tích.

3. Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp là bao nhiêu?
   MDL dao động từ khoảng 0,83 đến 2,79 µg/kg tùy nền mẫu, MQL từ 1,76 đến 9,30 µg/kg, đều thấp hơn nhiều so với giới hạn tối đa cho phép 100 µg/kg, đảm bảo độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp.

4. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thủy sản khác ngoài tôm, cá chẽm và cá tra không?
   Có thể áp dụng với các thủy sản khác sau khi hiệu chỉnh và thẩm định lại phương pháp phù hợp với ma trận mẫu mới, nhờ tính linh hoạt của kỹ thuật LC-MS/MS và quy trình xử lý mẫu QuEChERS.

5. Làm thế nào để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích?
   Đảm bảo bằng việc thẩm định phương pháp theo các tiêu chuẩn quốc tế, bao gồm đánh giá độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác (RSDr, RSDR), hiệu suất thu hồi và độ không đảm bảo đo, đồng thời sử dụng mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn trong quá trình phân tích.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công phương pháp LC-MS/MS xác định đồng thời 19 hoạt chất họ Sulfonamide trong mẫu thủy sản tôm, cá chẽm và cá tra với độ nhạy cao và độ chính xác phù hợp tiêu chuẩn quốc tế.
• Quy trình xử lý mẫu sử dụng phương pháp QuEChERS kết hợp DSPE tối ưu, giúp loại bỏ tạp chất nền và nâng cao hiệu suất thu hồi.
• Phương pháp đạt giới hạn phát hiện và định lượng thấp hơn nhiều so với giới hạn tối đa cho phép 100 µg/kg, đảm bảo khả năng kiểm soát dư lượng kháng sinh hiệu quả.
• Ứng dụng phân tích mẫu thực tế tại TP. Hồ Chí Minh cho thấy dư lượng Sulfamethoxazole phổ biến nhưng nằm trong giới hạn an toàn.
• Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong kiểm nghiệm thủy sản, tăng cường giám sát và hoàn thiện quy định pháp lý nhằm nâng cao chất lượng và giá trị xuất khẩu thủy sản Việt Nam.

Các cơ quan quản lý và doanh nghiệp nên phối hợp triển khai áp dụng phương pháp này rộng rãi, đồng thời đẩy mạnh đào tạo và nâng cao nhận thức về sử dụng kháng sinh hợp lý trong nuôi trồng thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về kháng sinh 1.1 Khái niệm Kháng sinh là những chất có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp với nồng độ rất thấp [10].2 Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc 1.1 Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên Là những kháng sinh hoàn toàn do vi sinh vật tổng hợp (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn.2 Kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp Là những kháng sinh có phần cấu trúc cơ bản do vi sinh vật tổng hợp, sau đó được gắn thêm các nhóm hóa chức bằng phương pháp hóa học.3 Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hóa học Là những kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học. Ví dụ: Nhóm Sulfonamide (SAs).2 Giới thiệu về kháng sinh Sulfonamide Năm 1932, Domard (Đức) đã tìm ra Sulfonamide [11]. Kháng sinh Sulfonamide thường được nhận diện với tiếp đầu ngữ Sulf trong tên hoạt chất: Sulfadoxine, Sulfadiazine, Sulfamoxole, Sulfamethoxazole, Sulfaquinoxaline. - Sulfonamide thuộc họ kháng khuẩn được sử dụng phổ biến trong thú y do hiệu quả trong điều trị và giá thành thấp.

- Có dạng bột tinh thể của acid yếu, ít tan trong nước và môi trường acid yếu, tan tốt ở pH = 9. Tức là chúng có khuynh hướng kết tinh môi trường pH acid của nước tiểu. - Tính hòa tan của hỗn hợp nhiều Sulfonamide cũng có hiệu quả trị liệu tốt hơn.1 Giới thiệu 19 hoạt chất họ Sulfonamide Stt Hoạt chất Công thức hoá học CAS M (g/mol) 1 Sulfanilamide C6H8N2O2S 63-74-1 172.3 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs Hình 1.1 Công thức chung của nhóm Sulfonamide 7 Sulfanilamide Sulfacetamide Sulfachloropyridazine Sulfadimethoxine Sulfadoxin Sulfadiazine Sulfaguanidin Sulfisoxazol Sulfamonomethoxin Sulfamethoxypyridazin Sulfamerazin Sulfadimidine Sulfamethoxazole Sulfamoxol Sulfamethizole Sulfanitran Sulfapyridin Sulfaquinoxaline 8 Sulfathiazol Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 19 hoạt chất SAs [12]. Trong 19 hợp chất Sulfonamide ta thấy Sulfisoxazole và Sulfamoxole là hai đồng phân cấu tạo của nhau có cùng công thức phân tử C11H13N3O3S và tương tự Sulfamonomethoxine và Sulfamethoxypyridazine cũng là hai đồng phân cấu tạo của nhau có công thức C11H12N4O3S.4 Phân loại thuốc SAs Các Sulfonamide kháng khuẩn và các chất chuyển hóa của chúng được coi là chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy.

Theo thời gian tác dụng và thời gian bán hủy, các Sulfonamide uống có thể hấp thụ được có thể được chia ra gồm: - Sulfonamide tác dụng ngắn (3-8 giờ): Sulfadiazine, Sulfamethoxazol, Sulfisoxazol. - Các Sulfonamide tác dụng trung gian (8-18 giờ): Sulfaguanidine, Salazosulfapyridin. - Sulfonamde tác dụng kéo dài (> 35 giờ): Sulfadoxine 1.5 Các tác dụng phụ của SAs Triệu chứng phổ biến: Phát ban da, ngứa [13]. 9 Các triệu chứng ít gặp: Da nhợt nhạt, đau các khớp và cơ, đỏ, phồng rộp, bong tróc da hoặc lỏng lẻo, khó nuốt, mệt mỏi hoặc suy nhược bất thường, chảy máu hoặc bầm tím bất thường, đau họng và sốt, mắt hoặc da vàng.

Ngoài ra, các triệu chứng hiếm sau mà người bệnh có thể gặp: Co thắt và đau bụng nghiêm trọng, tiêu chảy nhiều nước và nặng, cũng có thể có máu, cơn khát tăng dần, thay đổi tâm trạng hoặc tinh thần, xuất hiện máu trong nước tiểu, đau lưng dưới, đau hoặc rát khi đi tiểu, sưng phần trước của cổ.6 Một số lưu ý khi dùng thuốc SAs SAs có thể gây ra các vấn đề liên quan đến máu, dẫn đến nguy cơ nhiễm trùng cao hơn, chảy máu nướu, vết thương chậm lành. Thuốc có thể làm da nhạy cảm với ánh nắng bất thường, gây phát ban da, đỏ, ngứa, cháy nắng nghiêm trọng hoặc đổi màu da. Thuốc cũng có thể khiến một số người bị chóng mặt [14].7 Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ 1.1 Nguyên lý chung Phân tích sắc ký (Chromatography): Kỹ thuật tách riêng các hợp chất đã được Tsvett (1906) sử dụng để tách riêng các chất màu trong cây cỏ. Từ ngữ “Chromatography” xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu [15].

LC-MS/MS là hệ thống được kết hợp giữa LC với đầu dò MS, trong đó LC có nhiệm vụ tách chất phân tích (thực hiện bởi cột sắc ký). MS có nhiệm vụ phân tích khối phổ dựa vào giá trị (m/z), là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích [16].3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ [17] Chất phân tích khi vào bộ phận MS được ion hoá bằng các phương pháp khác nhau. Các ion được hình thành đi vào bộ phận đo khối phổ. Do công thức hóa học các chất khác nhau hình thành các ion mang điện tích dương hoặc âm khác nhau, ta chọn kiểu quét âm hoặc dương.2 Các nguồn ion hóa Có ba kiểu hình thành ion trong LC-MS/MS [18]: - Ion hóa phun điện tử (ESI, electrospray ionization) là một kỹ thuật ion hóa chính của LC-MS/MS.

- Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI, atmospheric pressure chemical ionization). - Ion hóa sử dụng photon tại áp suất khí quyển (APPI, atmospheric pressure photoionization). 11 Kỹ thuật ESI được sử dụng nhiều nhất, APCI sử dụng ít hơn và trong nghiên cứu đề tài chúng tôi sử dụng phân tích các chất bằng kỹ thuật ESI. Khi so sánh 2 kỹ thuật ion hóa APCI và ESI có thể thấy: • Giống nhau − Đều thuộc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều trường hợp còn thấy được phân tử ban đầu.

− Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh cũng đơn giản, giúp đoán nhận cấu trúc chất ban đầu dễ dàng hơn. − Cả hai kỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dương tùy theo cấu trúc hợp chất khảo sát. − Khác nhau Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI): − Ion hình thành trong pha lỏng − Phân tích chất không khó bay hơi, nhiệt độ bay hơi cao. − Có thể tạo sự phân mảnh ít hơn APCI − Phân tích các chất phân cực nhiều − Các chất có khối lượng phân tử lớn − ESI hình thành các ion có nhiều điện tích khác nhau, kỹ thuật ion hóa ESI sử dụng nhiều hơn APCI.4 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI Kỹ thuật ion hóa ở áp suất thường (APCI): − Ion được hình thành ở dạng hơi − Phân tích các chất dể bay hơi.

− Có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơn ESI − Phân tích các chất phân cực kém − Phân tích các chất có khối lượng phân tử nhỏ Hình 1.5 Sự ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI) 13 Về nguyên tắc của APCI và ESI có thể thấy: APCI: Phân tử phân tích và dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử bay hơi được khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện. Hiện tượng ion hóa xảy ra: Cơ chế hình thành ion dương: N2 + e- → N2+ + 2e- H2O + e- → H2O+ +2e- H2O + H2O+ → H3O+ + OH. (phản ứng ion – phân tử) M + H3O+ → MH+ + H2O (phản ứng ion – phân tử) Cơ chế tạo ion âm: Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion: OH. + M → (M - H)- + H2O ESI: Các chất phân tích và dung môi ra khỏi cột sắc ký tới đầu vào LC/MS được đưa vào ống mao quản bằng kim loại có đường kính rất nhỏ và với áp suất của khí N2 hình thành chùm tia dạng sương.

Dưới tác dụng của dòng điện cao thế, những giọt sương mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Sau đó dung môi bốc hơi bởi dòng khí N2 thổi ngược dòng. Các hạt mang điện có kích thước nhỏ dần và do lực đẩy giữa các điện tích cùng dấu, chúng vỡ ra thành những ion mang điện tích dương hoặc âm. Sau đó các ion này được đưa vào bộ phận đưa ion qua một bộ phận rất nhỏ để đi vào tứ cực thứ nhất Q1.

Dung môi được bơm hút ra ngoài. Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm thì tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo sát.3 Các loại đầu dò khối phổ Hiện nay, có các kiểu đầu dò khối phổ đang được sử dụng: • Đầu dò khối phổ kiểu bẫy ion tứ cực tuyến tính (Linear quadrupole ion trap: LIT) • Cộng hưởng cyclotron ion biến đổi Fourier (Fourier-transform mass spectrometry hay Fourier-transform ion cyclotron resonance, FTMS) 14 • Đầu dò khối phổ phân tích thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) • Đầu dò khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole: QQQ) Kiểu đầu dò LIT và QQQ được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm độ nhạy cao, có tính chọn lọc và ứng dụng rộng rãi nên được sử dụng nhiều. Tùy mục đích sử dụng người ta lựa chọn thiết bị phù hợp. Các bộ phân tích khối thường được sử dụng để xác định kháng sinh hiện nay là Linear quadrupole ion trap (LIT), Triple Quadrupole (QQQ) (một cải tiến của Quadrupole) và Q-TOF (một cải tiến của TOF).6 Cấu tạo của đầu dò khối phổ Triple quadrupole QQQ Thành phần phân tích khối QQQ là sự kết nối giữa ba tứ cực.

Trong đó, Q1 dùng để lọc các ion chính có thông số m/z cần nghiên cứu (trong đó m: khối lượng phân tử, z: số điện tích). Q2 là nơi phân mãnh của các ion, khí trơ Ar hay N2 sẽ va chạm với các mảnh ion mẹ tạo ra các ion con và được đưa vào Q3 phân tích những mảnh ion con cần quan tâm.4 Các kỹ thuật ghi phổ Hiện nay, có 4 kiểu ghi phổ được dùng phồ biến: Selected Ion Monitoring (SIM), Full Scan, MRM (Multiple Reaction Monitoring) và SRM (Selected Reaction Monitoring) [19]. Selected Ion Monitoring (SIM) Chế độ SIM, đầu dò MS chọn chính xác một mảnh đặc trưng cho chất cần khảo sát. Ví dụ trong khoảng khối từ 50 - 300 như trên, mảnh ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ chọn riêng m/z 150 ra để định lượng.

Full scan Ở kĩ thuật này, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Ví dụ: chọn chế độ scan m/z 50 - 300 có nghĩa là quét tất cả các khối từ 50 - 300. Để tìm ion mẹ người ta chọn chế độ SCAN quét các ion trong vùng khảo sát để tìm ra ion mẹ.

Trong khối phổ ba tứ cực (MS/MS), 2 kỹ thuật thường được sử dụng phổ biến là MRM và SRM. MRM: Kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM bởi do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con mục tiêu thường từ hai trở lên.