ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh α-thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin trong phân tử Hemoglobin. Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất, là nguyên nhân gây thiếu máu tan máu hàng đầu ở trẻ em [1]. Bệnh α-thalassemia xuất hiện ở tất cả các chủng tộc trên thế giới, rất phổ biến ở các nước Đông Nam Á. Hiện có khoảng 5% dân số thế giới là người mang gen bệnh α-thalassemia, bao gồm dạng α+-thalassemia, α0-thalassemia, phân bố khác nhau ở từng khu vực, quốc gia, chủng tộc khác nhau [1].
Tại Trung Quốc, người mang gen α-thalassemia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [4], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [6]. Người bình thường có hai gen α globin nằm trên mỗi NST 16, và có tổng số bốn gen α globin trên hai NST 16 tương đồng (αα/αα). Tùy theo số lượng gen α bị đột biến, và tùy theo sự kết hợp đa dạng giữa các dạng allen đột biến khác nhau của bệnh α-thalassemia, gây ra các biểu hiện lâm sàng ở nhiều mức độ khác nhau. Trẻ mắc bệnh HbH thường có thiếu máu tan máu, có thể phải phụ thuộc truyền máu, gây hậu quả nghiêm trọng cho hàng loạt các cơ quan trong cơ thể.
Nếu không được điều trị, trẻ mắc HbH thể nặng thường tử vong sớm, hoặc muộn hơn vì các biến chứng của bệnh. Hội chứng phù thai do Hb Bart’s là thể nặng nhất của bệnh α-thalassemia, do đột biến mất hoàn toàn bốn gen α globin, gây thiếu máu nặng, dẫn đến suy tim, tràn dịch đa màng, phù toàn thân, thường chết lưu trong khoảng từ 28-40 tuần, hoặc tử vong ngay trong vài giờ đầu sau khi sinh. Ngoài ra, hội chứng phù thai do Hb Bart’s còn làm tăng nguy cơ nhiễm độc thai nghén và tiền sản giật cũng như các biến chứng sản khoa khác cho sản phụ. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 Tại Việt Nam, từ năm 1985, bệnh α-thalassemia mới bắt đầu được quan tâm nghiên cứu [8].
Từ năm 2008 đến 2010, kỹ thuật phân tích kiểu đột biến gen bệnh α-thalassemia mới bắt đầu được tiến hành tại Việt Nam [9, 10]. Việc nghiên cứu một cách sâu rộng về đặc điểm gen α globin, xác định các đột biến gây bệnh, mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh α-thalassemia, đóng vai trò quan trọng trong vấn đề tiên lượng mức độ nặng của bệnh và đưa ra các quyết định điều trị, theo dõi phù hợp. Ngoài ra, việc nghiên cứu các đột biến trên gen α globin sẽ bước đầu cung cấp các thông tin về đột biến trên gen α globin của người Việt Nam. Đặc biệt, phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia.
Đây được xem là biện pháp hiệu quả và cần thiết để phòng bệnh. Xuất phát từ các l do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, kiểu gen của người mắc bệnh HbH và chẩn đoán trước sinh bệnh D-thalassemia” với các mục tiêu sau đây: 1. Phát hiện một số đột biến trên gen globin của bệnh nhân D-thalassemia b ng các k thuật PCR, MLPA và giải trình tự gen Sanger. Nhận xét biểu hiện lâm sàng và kiểu gen của bệnh nhân mắc HbH.
Chẩn đoán trước sinh bệnh -thalassemia b ng k thuật sinh học phân tử từ tế bào ối. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và các dạng phân tử hemoglobin 1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường Phân tử hemoglobin (Hb) ở người là một phân tử protein được cấu tạo từ hai cặp chuỗi dimer polypeptide, α và β globin, tạo thành cấu trúc tetramere.
Phân tử α2β2 là cấu trúc của phân tử Hb ở người trưởng thành. Chức năng chính của phân tử này là vận chuyển oxygen (O2) từ phổi đến các tổ chức, và vận chuyển carbon dioxide (CO2), carbon monoxide (CO), nirtric oxide (NO) theo chiều ngược lại. Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần globin và phần HEM [11]. Sơ đồ cấu tạo phân tử Hb Phần HEM là phần tạo nên màu đỏ của chất Hb, có cấu trúc chung cho nhiều loài.
Phần này là một vòng protoporphyrin và một nguyên tử sắt hóa trị II nằm ở trung tâm (Hình 1. Ở người những rối loạn bệnh lý trong phần HEM ít xảy ra hơn hẳn so với những rối loạn bệnh lý trong phần globin [11]. Phần globin có bản chất là protein. Phần này đặc hiệu cho từng loài.
Ở người, phần globin được cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptide giống nhau từng đôi một, gắn với nhau. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Do đó, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy [11]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Tế bào hồng cầu vận chuyển oxy 1. Các dạng phân tử hemoglobin Trong quá trình phát triển cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả chia chuỗi polypeptide thành các loại như sau: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (γ), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε), chuỗi zeta (δ) [12]. Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin.
Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Trong hồng cầu của người bình thường trưởng thành, HbA (α2β2) chiếm khoảng 97% trong tổng số Hb của cơ thể, HbA2 (α2δ2) chiếm ~2% và HbF - hemoglobin bào thai (α2γ2) chiếm ~ 1% [12]. 2 gen δ và ε chỉ biểu hiện trong giai đoạn sớm của phôi, sau đó giảm dần và thay bằng sự biểu hiện của 2 gen α và 2 gen γ, hình thành nên Hb Gower1 (δ2ε2), Gower2 (α2ε2) và Porland (δ2γ2). 2 gen α và γ dần dần biểu hiện tạo thành HbF (α2γ2), là loại Hb chiếm ưu thế ở 3 tháng giữa của thai kỳ và có ái lực với oxy tăng nhẹ so với Hb ở người trưởng thành.
Tại thời điểm sinh, gen α globin đã đạt đến mức độ hoạt động đầy đủ, gen γ giảm hoạt động, nhóm gen β (δ và β) dần dần tăng hoạt động. Do đó ở người bình thường, khi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 được 1 tuổi, loại Hb chiếm ưu thế là Hb của người trưởng thành HbA và HbA2. Tuy nhiên trong một vài trường hợp, gen γ globin vẫn tiếp tục được biểu hiện trong tế bào hồng cầu trưởng thành, gây hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai có tính chất di truyền (HPFH) [12]. Khái niệm Bệnh α-thalassemia là bệnh thiếu máu tan máu di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, do giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp của chuỗi α globin trong phân tử Hb.
Sự suy giảm tổng hợp này dẫn đến sự tăng tổng hợp quá mức của chuỗi β globin tạo phân tử γ4, gọi là Hb Bart’s (trong thời kỳ bào thai), và β4, gọi là HbH (trong thời kỳ trưởng thành) [13]. Dịch tễ học bệnh α-thalassemia Bệnh α-thalassemia gặp phổ biến ở tất cả các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở một số vùng, người mang gen α-thalassemia có thể chiếm 80-90% dân số [14]. Dịch tễ của bệnh α-thalassemia liên quan đến các khu vực lưu hành bệnh sốt rét, tuy nhiên cơ chế về vấn đề này vẫn chưa được làm sáng tỏ [15].
Trong tất cả các bệnh về rối loạn gen globin, bệnh α-thalassemia là bệnh có sự phân bố rộng rãi nhất. Với sự kết hợp giữa các dạng allen đột biến khác nhau của bệnh α-thalassemia, cũng như giữa bệnh α và β thalassemia, đã tạo ra nhiều kiểu hình phong phú của bệnh. Bệnh HbH, là α- thalassemia thể trung gian được tìm thấy chủ yếu ở Đông Nam Á, Trung Đông và Địa Trung Hải. Hiện nay, có khoảng 5% dân số thế giới là người mang gen bệnh α-thalassemia, phân bố khác nhau ở từng quốc gia, chủng tộc [1].
Trung Quốc, người mang gen α-thalassmia chiếm 5-15% dân số [2], Hong Kong 4% [3], Thailand 15-30% [4], Lào 43% [5], Việt Nam 5% [6]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 Thalassemia là một vấn đề toàn cầu. Trong khoảng 20 năm tới, ước tính sẽ có khoảng 900,000 trẻ sinh ra mắc bệnh thalassemia, trong đó 95% số trẻ này thuộc về các nước Châu Á, Ấn Độ, và Trung Đông. Ngày nay, dịch tễ học của bệnh thalassemia đã thay đổi một cách đáng kể so với trước đây.
Thalassemia hiện nay là nhóm bệnh không thuần nhất với sự khác nhau về tính chủng tộc, kiểu hình, kiểu gen, và cách thức điều trị [16, 17]. Cụm gen globin Cụm gen α globin bao gồm các gen chức năng là hai gen α (α2, α1) và một gen phôi (δ2), 3 giả gen (ψδ1, ψα2, ψα1), và 1 gen chưa xác định được chức năng (θ1). Các gen này sắp xếp theo trình tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ như sau: 5’- δ2 - ψδ1 - ψα2 - ψα1 - α2 - α1 - θ1 - 3’ [18]. Cụm gen bình thường được ký hiệu là αα, có chiều dài khoảng 25-65 kb.
Phía đầu nguồn của cụm gen có 4 trình tự không mã hóa có tính bảo tồn cao, hay còn gọi là trình tự bảo tồn đa loài (Multispicies conserved sequence - MCS), gọi là MCS-R1 đến -R4, là những trình tự tham gia vào quá trình điều hòa gen α globin. Cho đến nay, chỉ có MCS-R2, hay còn được biết đến với tên gọi HS-40 là được chứng minh rằng có vai trò quan trọng cho sự biểu hiện của gen α globin [19]. HS-40 là một đoạn trình tự DNA có chiều dài khoảng 40kb nằm ở đầu nguồn của cụm gen α globin, là một vùng DNA có tính nhạy cảm cao và là vị trí gắn với các yếu tố trong quá trình sao mã. Sự toàn vẹn của vùng HS-40 là yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện của gen α globin, nhiều bằng chứng đầy đủ đã chỉ ra rằng mất đoạn vùng HS-40 làm mất hoàn toàn khả năng biểu hiện của cụm gen α globin phía hạ nguồn, và có biểu hiện như một người mang gen α-thalassemia [19].
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nhóm gen globin và và sự t ng hợp hemoglobin ở các giai đoạn phát triển [20, 21] 1. Gen globin Có 2 gen α globin, α1 và α2, với tổng chiều dài khoảng từ 1 đến 2kb. Mỗi gen gồm 3 exon (vùng mã hóa protein), và 2 introns - IVS (vùng không mã hóa) [15].
Gen α1 và α2 có chiều dài 850bp, cùng mã hóa cho chuỗi α globin gồm 141 acid amin, là thành phần cấu tạo nên phân tử Hb của cơ thể.
