Luận án tiến sĩ về đặc điểm kháng sinh và gen ở các chủng Salmonella đa kháng

Luận án tiến sĩ phân tích đặc điểm kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng, góp phần nâng cao hiểu biết về vi sinh vật.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Việt
• Người hướng dẫn: GS. Nghiêm Ngọc Minh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Kháng Kháng Sinh Và Gen Liên Quan Ở Các Chủng Salmonella Đa Kháng
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella
• 1.2. Hình thái
• 1.3. Tính chất nuôi cấy
• 1.4. Tính chất hóa sinh
• 1.5. Kháng nguyên
• 1.5.1. Kháng nguyên O
• 1.5.2. Kháng nguyên H
• 1.5.3. Kháng nguyên Vi
• 1.6. Đặc điểm hệ gen của Salmonella
• 1.7. Cấu trúc hệ gen
• 1.8. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella
• 1.8.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside
• 1.8.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam
• 1.8.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol
• 1.8.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone
• 1.8.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline
• 1.8.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim
• 1.9. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn
• 1.10. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc
• 1.11. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc
• 1.12. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella
• 1.13. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm
• 1.13.1. Trên thế giới
• 1.13.2. Tại Việt Nam
• 1.14. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen
• 1.14.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR)
• 1.14.2. Real-time PCR (qPCR)
• 1.14.3. Giải trình tự thế hệ mới
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit
• 2.1.2. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002
• 2.1.3. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ
• 2.1.4. Kháng sinh
• 2.1.5. Thiết bị nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.2.2. Định danh Salmonella
• 2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc
• 2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc
• 2.2.2.3. Quy trình khẳng định
• 2.2.3. Kháng sinh đồ
• 2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới
• 2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học
• 2.2.5.1. Kiểm tra chất lượng trình tự
• 2.2.5.2. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57]
• 2.2.5.3. Lắp ráp de novo
• 2.2.5.4. Chú thích hệ gen biểu hiện
• 2.2.5.5. Xác định các gen kháng kháng sinh
• 2.2.5.6. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh
• 2.2.5.7. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger
• 2.2.6. Xử lý thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu
• 3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella
• 3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập
• 3.2.3. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập
• 3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh
• 3.2.5. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh
• 3.2.5.1. Số lượng trình tự đọc (read)
• 3.2.5.2. Lắp ráp de novo
• 3.2.5.3. Chú thích chức năng các gen
• 3.2.5.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu
• 3.2.5.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh
• 3.2.5.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone
• 3.2.5.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump)
• 3.2.5.4.4. Nhóm gen độc lực
• 3.2.5.4.5. Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar
• 3.2.5.4.6. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS) và thành tế bào
• 3.2.5.4.7. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc
• 3.2.5.4.8. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage
• 3.2.5.4.9. Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC
• 3.2.5.5. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 6. NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đặc điểm sinh học của Salmonella

Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại. Hình thái của Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân. Hầu hết Salmonella đều di động và không có vỏ, không sinh bào tử. Tính chất nuôi cấy của Salmonella cho thấy chúng dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí, phát triển tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường với nhiệt độ thích hợp là 37oC. Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5, với pH tối ưu là 6,5-7,5. Trên môi trường thích hợp, khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có khả năng sống trong môi trường khô và có thể tồn tại nhiều năm trong rác thải. Chúng nhạy cảm với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên.

II. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella

Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella rất đa dạng và phức tạp. Các nhóm kháng sinh như aminoglycoside, β-lactam, phenicol, quinolone và tetracycline đều có cơ chế kháng riêng. Đặc biệt, Salmonella có khả năng phát triển các kênh bơm thải thuốc, cho phép chúng loại bỏ kháng sinh ra khỏi tế bào. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển tính kháng. Nghiên cứu cho thấy rằng sự đột biến gen có thể dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc của các protein bơm thải, từ đó làm giảm hiệu quả của kháng sinh. Việc hiểu rõ cơ chế này không chỉ giúp trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc kiểm soát sự lây lan của Salmonella kháng kháng sinh.

III. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm

Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Salmonella là một trong bốn nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy. Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ Salmonella kháng kháng sinh đang gia tăng, gây khó khăn trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn. Việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là cần thiết để cung cấp thông tin cho việc dự phòng và kiểm soát bệnh tật. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về dịch tễ học phân tử của Salmonella mà còn có thể phát hiện các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

IV. Phân tích gen ở các chủng Salmonella đa kháng

Phân tích gen ở các chủng Salmonella đa kháng là một phần quan trọng trong nghiên cứu này. Các gen liên quan đến kháng kháng sinh, độc lực và kênh bơm thải thuốc được xác định và phân tích. Việc sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới cho phép xác định các nhóm gen và đột biến gen kháng kháng sinh. Kết quả cho thấy rằng có sự liên quan chặt chẽ giữa các đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở Salmonella. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về cơ chế kháng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng nhiễm khuẩn do Salmonella qua đường thực phẩm là nguyên nhân phổ biến gây bệnh tiêu chảy trên phạm vi toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 550 triệu người mắc tiêu chảy do sử dụng thực phẩm không an toàn, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi; Salmonella là một trong bốn tác nhân chính. Vi khuẩn này có hơn 2.500 serovar khác nhau, phân bố rộng và đều có khả năng gây bệnh cho người. Cùng với sự gia tăng tiêu thụ các loại thịt gia súc, gia cầm tại Việt Nam, tình trạng vi khuẩn Salmonella kháng kháng sinh và đa kháng kháng sinh (Multidrug Resistance - MDR) đang phát triển phức tạp, gây trở ngại cho công tác kiểm soát nhiễm khuẩn, phòng ngừa và điều trị lâm sàng.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ ra là: phần lớn các công trình nghiên cứu về Salmonella tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung vào khía cạnh dịch tễ học và kiểu hình kháng kháng sinh. Các nghiên cứu chuyên sâu ở mức độ phân tử còn hạn chế. Đến thời điểm thực hiện đề tài, chưa có công trình nào tại Việt Nam phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng phân lập từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS). Luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống này thông qua cách tiếp cận sinh học phân tử kết hợp tin sinh học.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội.
2. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được.
3. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.

Nội dung nghiên cứu:

1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập tại các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella.
2. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.
3. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan.
4. Xác nhận một số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt tươi sống (thịt gà, thịt lợn, thịt bò).
• Phạm vi không gian: 10 chợ bán lẻ trên địa bàn thành phố Hà Nội (Long Biên, Cầu Giấy, Đống Đa, Nguyễn Công Trứ, Mai Động, Tân Mai, Trương Định, Tứ Liên, Kim Giang, Hà Đông).
• Quy mô mẫu: 90 mẫu thịt tươi sống (gồm 30 mẫu thịt gà, 30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt bò).
• Thời gian hoàn thành: Năm 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lịch sử nghiên cứu ghi nhận Salmonella được Salmon phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng vào năm 1884 với tên gọi Bacillus choleraesuis. Năm 1900, Lignières đổi tên thành Salmonella Choleraesuis. Đến năm 1918, Buchanan xác định các đặc tính sinh hóa cơ bản của chi này (lactose âm tính, glucose dương tính, sinh acid và CO2). Năm 1960, tên chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae chính thức được công nhận và sử dụng thống nhất trên toàn thế giới.

Tác giả luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu dịch tễ về ô nhiễm và tính kháng thuốc của Salmonella trên thế giới và tại Việt Nam:

Trên thế giới:

• Niyomdecha và cộng sự (2016): Nghiên cứu 120 mẫu thực phẩm (40 thịt lợn, 40 thịt gà, 40 rau diếp) tại Bangkok, Thái Lan; ghi nhận tỷ lệ nhiễm Salmonella ở thịt lợn là 82%, thịt bò là 62%, rau diếp là 20%. Mức độ đề kháng cao đối với ampicillin, chloramphenicol, nalidixic acid, sulfamethoxazole/trimethoprim và tetracycline.
• Cai và cộng sự (2016): Khảo sát tại Dương Châu, Giang Tô, Trung Quốc; phát hiện 71,8% mẫu thịt lợn ở lò giết mổ và 70,9% mẫu thịt bán lẻ nhiễm Salmonella, trong đó kháng sinh nhóm tetracycline bị đề kháng nhiều nhất.
• Katoh và cộng sự (2015): Thu thập mẫu thịt gà bán lẻ tại Tokyo từ 1992 đến 2012; ghi nhận tỷ lệ nhiễm 29,8%, tỷ lệ đề kháng kháng sinh là 89,9%, trong đó 90,2% là đa kháng; kháng streptomycin (81,8%) và tetracycline (77,8%).
• Tirziu và cộng sự (2015): Khảo sát thịt gà tại Romania; tỷ lệ nhiễm là 13,2%, tetracycline bị đề kháng cao nhất, không phát hiện chủng kháng cefotaxime và ceftazidime.
• Dữ liệu NARMS (Hoa Kỳ): Giai đoạn 2005–2006 ghi nhận 84% chủng Salmonella không gây sốt thương hàn (NTS) phân lập trên lâm sàng mang kiểu hình đa kháng, đồng thời xuất hiện các chủng kháng nalidixic acid và ceftriaxone.

Tại Việt Nam:

• Nghiên cứu năm 1994 ghi nhận các chủng S. Typhi phân lập ở miền Nam mang tính đa kháng, tỷ lệ kháng nalidixic acid tăng từ 4% (năm 1993) lên 97% (năm 2005).
• Nghiên cứu năm 2007 về vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm cho thấy 50,5% Salmonella đề kháng với ít nhất một loại kháng sinh.
• Khảo sát thịt bò bán lẻ tại Hà Nội năm 2009 cho thấy tỷ lệ nhiễm là 39,9%; 58,7% chủng đề kháng ít nhất một kháng sinh và 46,0% đa kháng (kháng cao với tetracycline 46,0%, sulphonamide 39,7%, ampicillin 31,7%, streptomycin 30,2%).
• Khảo sát thịt lợn và thịt gà tại miền Bắc năm 2012 xác định tỷ lệ nhiễm tương ứng là 39,6% và 42,9%; tỷ lệ đề kháng ít nhất một kháng sinh đạt 78,4%.
• Nghiên cứu thịt gà sống năm 2014 ghi nhận tỷ lệ nhiễm 48,7%; 73,3% kháng ít nhất một kháng sinh và 17,7% đa kháng.
• Khảo sát tại TP. Hồ Chí Minh giai đoạn 2012–2015 ghi nhận tỷ lệ nhiễm trên thịt lợn (69,7%), thịt gà (65,3%), thịt bò (58,3%); hơn 62,2% chủng đề kháng và 41,1% đa kháng.

Khoảng trống nghiên cứu được lựa chọn: Các công bố tại Việt Nam chủ yếu dừng lại ở việc đánh giá tỷ lệ nhiễm và thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán. Cơ chế phân tử, đặc biệt là các cụm gen kháng thuốc, hệ thống bơm đẩy (efflux pump), các đột biến gen đích kháng quinolone và các gen độc lực liên quan chưa được phân tích toàn diện. Luận án đặt vị trí của mình vào việc ứng dụng giải trình tự transcriptome/RNA-seq thế hệ mới (Illumina HiSeq) kết hợp phân tích tin sinh học để làm sáng tỏ hệ thống các nhóm gen biểu hiện ở các chủng Salmonella đa kháng phân lập từ thịt tại Hà Nội.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các khái niệm sử dụng

• Phân loại sinh học và huyết thanh học: Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, là trực khuẩn Gram âm, kích thước 2–3 × 0,5–1,0 µm, có lông quanh thân (trừ S. Gallinarum và S. Pullorum), không sinh vỏ, không tạo bào tử. Phân loại hiện đại chia thành hai loài: S. enterica (gồm 6 phân loài: I, II, IIIa, IIIb, IV, VI) và S. bongori (phân loài V). Phân loại serovar dựa trên sơ đồ Kauffmann-White thông qua kết hợp 46 kháng nguyên thân O (bản chất Lipopolysaccharide - LPS) và 85 kháng nguyên lông H (protein flagellar), cùng kháng nguyên vỏ Vi (ở S. Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin).
• Đặc điểm hệ gen: Kích thước hệ gen dao động từ 3,39 Mb đến 5,59 Mb, chứa trung bình khoảng 4.742 gen. Hệ gen mang tính bảo thủ cao nhưng có các vùng đa hình di truyền tích hợp như các đảo gây bệnh (Salmonella Pathogenicity Islands - SPI, hiện xác định 23 SPI), các genomic island (GI), prophage và plasmid.
• Cơ chế kháng kháng sinh:
  • Aminoglycoside: Biến đổi thuốc bởi enzyme acetyltransferase (aac), phosphotransferase (aph), nucleotidyltransferase (aad/ant).
  • β-lactam: Thủy phân vòng β-lactam bởi các enzyme phân loại theo Ambler (họ TEM như blaTEM-1, blaTEM-52; AmpC như blaCMY-2; blaOXA).
  • Phenicol: Bơm thải chủ động qua gen floR, enzym chloramphenicol acetyltransferase (cat) hoặc cmlA.
  • Quinolone: Đột biến các gen mã hóa DNA gyrase (gyrA, gyrB) và topoisomerase IV (parC); tăng hoạt động hệ thống bơm thải; gen bảo vệ trên plasmid (qnr).
  • Tetracycline: Bơm thải chủ động (tetA, tetB, tetG...), bảo vệ ribosome (tetM, tetO), phân hủy enzyme (tetX), đột biến rRNA 16S.
  • Sulfonamide và Trimethoprim: Biểu hiện enzyme thay thế dihydropteroate synthetase (sul1, sul2, sul3) và dihydrofolate reductase (dfr, dhfr).
• Hệ thống bơm thải thuốc (Efflux pumps): Bao gồm 4 họ chính ở Salmonella: họ RND (AcrAB-TolC, AcrD, AcrEF, MdtABC, MdsAB), họ MFS (EmrAB, MdfA), họ MATE (MdtK) và họ ABC (MacAB).

Họ kênh vận chuyển	Kênh bơm	Cơ chất kháng sinh và hóa chất đào thải
RND	AcrAB	Quinolone, chloramphenicol, tetracycline, β-lactam, rifampicin, novobiocin, SDS, acriflavine...
	AcrD	Aminoglycoside, oxacillin, carbenicillin, sulbenicillin, deoxycholate...
	AcrEF	Quinolone, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin, acriflavine, SDS...
	MdtABC	Novobiocin, chloramphenicol, cloxacillin, thiamphenicol, deoxycholate...
	MdsAB	Novobiocin, acriflavine, crystal violet, rhodamine 6G, benzalkonium chloride...
MFS	EmrAB	Nalidixic acid, novobiocin, SDS, deoxycholate...
	MdfA	Chloramphenicol, norfloxacin, tetracycline, doxorubicin...
MATE	MdtK	Norfloxacin, doxorubicin, acriflavine...
ABC	MacAB	Macrolide, erythromycin...

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp thu thập mẫu: 90 mẫu thịt tươi sống (30 mẫu thịt gà, 30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt bò) được thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ bán lẻ thuộc thành phố Hà Nội:

STT	Địa điểm lấy mẫu (Chợ)	Nguồn mẫu và số lượng	Ký hiệu mẫu
1	Long Biên	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-1 đến TG-3; TL-1 đến TL-3; TB-1 đến TB-3
2	Cầu Giấy	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-4 đến TG-6; TL-4 đến TL-6; TB-4 đến TB-6
3	Đống Đa	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-7 đến TG-9; TL-7 đến TL-9; TB-7 đến TB-9
4	Nguyễn Công Trứ	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-10 đến TG-12; TL-10 đến TL-12; TB-10 đến TB-12
5	Mai Động	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-13 đến TG-15; TL-13 đến TL-15; TB-13 đến TB-15
6	Tân Mai	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-16 đến TG-18; TL-16 đến TL-18; TB-16 đến TB-18
7	Trương Định	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-19 đến TG-21; TL-19 đến TL-21; TB-19 đến TB-21
8	Tứ Liên	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-22 đến TG-24; TL-22 đến TL-24; TB-22 đến TB-24
9	Kim Giang	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-25 đến TG-27; TL-25 đến TL-27; TB-25 đến TB-27
10	Hà Đông	Gà (3), Lợn (3), Bò (3)	TG-28 đến TG-30; TL-28 đến TL-30; TB-28 đến TB-30

2. Quy trình phân lập và định danh (ISO 6579:2002):

• Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc: Đồng nhất mẫu thịt trong môi trường Nước pepton đệm (Buffered Peptone Water - BPW), ủ ở 37°C trong 16–20 giờ.
• Tăng sinh chọn lọc: Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường thạch bán lỏng MSRV (chứa novobiocin) ủ ở 41,5°C và canh thang MKTTn (chứa novobiocin và dung dịch iodine) ủ ở 37°C.
• Phân lập trên môi trường chọn lọc: Cấy ria lên đĩa thạch XLD (khuẩn lạc đỏ tâm đen do sinh H2S) và thạch SS (Salmonella Shigella agar).
• Giám định hóa sinh khẳng định: Sử dụng các môi trường thạch Kligler (đánh giá lên men glucose/lactose và sinh H2S), thạch Ure (urease âm tính), dung dịch L-Lysine decarboxylation (LDC dương tính), thử nghiệm Voges-Proskauer (VP âm tính), thử nghiệm sinh Indole bằng thuốc thử Kovacs (Indole âm tính) và thử nghiệm ONPG.
• Xác định type huyết thanh: Sử dụng bộ kháng huyết thanh O và H chuẩn của hãng Denka Seiken Co. (Tokyo, Nhật Bản).

3. Phương pháp kháng sinh đồ: Thực hiện theo kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch Mueller Hinton (Biolife, Italy) theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI 2015). Đánh giá mức độ nhạy cảm/đề kháng với 8 loại kháng sinh thuộc 6 nhóm:

STT	Tên kháng sinh	Viết tắt	Nhóm kháng sinh	Hàm lượng khoanh giấy
1	Ampicillin	AM	β-lactam (Penicillin)	10 µg
2	Ceftazidime	CAZ	β-lactam (Cephalosporin thế hệ 3)	30 µg
3	Gentamicin	GN	Aminoglycoside	10 µg
4	Streptomycin	STR	Aminoglycoside	10 µg
5	Ciprofloxacin	CIP	Fluoroquinolone	5 µg
6	Chloramphenicol	C	Phenicol	30 µg
7	Tetracycline	TE	Tetracycline	30 µg
8	Trimethoprim/sulfamethoxazole	SXT	Sulfonamide/Trimethoprim	1,25 / 23,75 µg

Chủng đa kháng kháng sinh (MDR) được định nghĩa là chủng có khả năng đề kháng đồng thời từ 3 nhóm kháng sinh trở lên.

4. Phương pháp sinh học phân tử và tin sinh học:

• Tách chiết và kiểm tra RNA: Chiết tách RNA tổng số từ các chủng Salmonella đa kháng bằng TRIzol Reagent (Invitrogen), loại bỏ DNA tạp nhiễm bằng bộ kit RNase-free DNase Set (QIAGEN). Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng điện di gel agarose 0,8%, máy quang phổ Nanodrop ND-1000 và máy Bioanalyzer 2100.
• Thiết lập thư viện cDNA và giải trình tự thế hệ mới: Sử dụng bộ kít TruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit hoặc TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Kit (Illumina) để tổng hợp cDNA và gắn adapter. Tiến hành giải trình tự trên hệ thống HiSeq4000 (Illumina, Hoa Kỳ).
• Xử lý dữ liệu tin sinh học: Đánh giá chất lượng đọc trình tự dựa trên điểm Phred; loại bỏ adapter và các đoạn đọc chất lượng thấp bằng phần mềm Trimmomatic [57]; lắp ráp hệ gen biểu hiện bằng phương pháp de novo; chú thích chức năng hệ gen; truy vấn cơ sở dữ liệu để xác định các gen kháng kháng sinh, hệ thống bơm đẩy, gen độc lực, gen tổng hợp flagellar, LPS, các gen đáp ứng độc chất và yếu tố di truyền vận động.
• Kiểm chứng giải trình tự Sanger: Khuếch đại PCR đoạn gen đích parC liên quan đến tính kháng quinolone bằng máy PCR Mastercycler pro, tinh sạch sản phẩm và giải trình tự theo phương pháp Sanger để đối chiếu sai khác nucleotide và acid amin.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. TỔNG QUAN

Chương này tổng hợp hệ thống cơ sở lý luận và các kết quả nghiên cứu trước đó về Salmonella:

• Trình bày chi tiết đặc điểm hình thái, sinh hóa, cấu trúc ba loại kháng nguyên (O, H, Vi) và sơ đồ phân loại Kauffmann-White; nêu rõ vai trò của LPS (kháng nguyên O) như một nội độc tố và cơ chế đa dạng hóa chuỗi đường N-acetylglucosamine hoặc galactose.
• Trình bày cấu trúc hệ gen Salmonella với kích thước 3,39–5,59 Mb, vai trò của 23 đảo sinh bệnh học (SPI) và các đảo hệ gen (GI) thu nhận qua chuyển gen ngang, tích hợp gần các vị trí gen tRNA.
• Phân tích cơ chế đề kháng đối với 6 nhóm kháng sinh: biến đổi enzyme trong kháng aminoglycoside (aac, aph, aad); sinh β-lactamase thuộc các lớp Ambler A, B, C, D (đặc biệt là họ blaTEM và blaCMY-2); bơm đẩy qua floR và enzyme cat, cmlA kháng phenicol; đột biến gen đích gyrA, gyrB, parC kháng quinolone; các nhóm gen bơm đẩy và bảo vệ ribosome kháng tetracycline (tổng hợp 46 gen/đột biến liên quan); gen sul và dfr kháng sulfonamide/trimethoprim.
• Cung cấp phân loại và cơ chế của các hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump) thuộc 4 họ protein màng chính (RND, MFS, MATE, ABC) cùng vai trò phối hợp của kênh màng ngoài TolC.
• Tổng kết tình hình ô nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong chuỗi cung ứng thực phẩm tại các quốc gia (Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Romania, Hoa Kỳ) và tại các vùng miền của Việt Nam (Hà Nội, miền Bắc, TP. Hồ Chí Minh).
• So sánh các công nghệ phân tích biểu hiện gen: RT-PCR, Real-time PCR (qPCR), Microarray và công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS - Illumina), làm rõ ưu thế giải trình tự trực tiếp hàng triệu đoạn đọc cDNA không phụ thuộc mẫu chuẩn hay thiết kế đầu dò cố định.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất, môi trường, sinh phẩm, thiết bị và các bước kỹ thuật được áp dụng trong đề tài:

• Lập bảng danh mục và mã hóa 90 mẫu thịt thu thập từ 10 chợ tại Hà Nội (TG-1 đến TG-30 cho thịt gà, TL-1 đến TL-30 cho thịt lợn, TB-1 đến TB-30 cho thịt bò).
• Mô tả công thức pha chế, nguồn gốc xuất xứ của từng môi trường nuôi cấy và hóa chất chuyên biệt theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002 (Nước pepton đệm, MSRV, MKTTn, SS, XLD, Thạch dinh dưỡng, Kligler, Ure, L-Lysine decarboxylation, VP, Tryptone, thuốc thử Kovacs, ONPG).
• Trình bày thành phần môi trường nuôi cấy BHI và môi trường thạch Muller Hinton phục vụ thử nghiệm kháng sinh đồ; quy định nồng độ khoanh giấy 8 loại kháng sinh của hãng BD Diagnostics theo chuẩn CLSI 2015.
• Chi tiết quy trình tách chiết RNA tổng số bằng TRIzol, xử lý DNase, đánh giá chất lượng thư viện cDNA bằng máy Bioanalyzer 2100 và hệ thống giải trình tự HiSeq4000.
• Thiết lập quy trình xử lý dữ liệu tin sinh học: lọc chuỗi bằng Trimmomatic [57], thuật toán lắp ráp de novo, các công cụ chú thích chức năng hệ gen biểu hiện, phương pháp xác định đột biến gen và quy trình đối chứng bằng giải trình tự Sanger gen parC.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả:

• Kết quả phân lập và định danh: Ghi nhận kết quả tăng sinh sơ bộ và chọn lọc từ 90 mẫu thịt; phân lập 25 chủng vi khuẩn nghi ngờ mang đặc tính của Salmonella trên các môi trường chọn lọc; xác nhận đặc tính sinh hóa trên thạch Kligler, ure, LDC, VP, Indole; xác định danh sách các mẫu dương tính và định danh các type huyết thanh (serovar) phân bố theo 3 nguồn thịt (thịt lợn, thịt bò, thịt gà).
• Đặc điểm đề kháng kháng sinh:
  • Đánh giá tỷ lệ đề kháng đối với từng loại trong số 8 loại kháng sinh thử nghiệm (ampicillin, ceftazidime, gentamicin, streptomycin, ciprofloxacin, chloramphenicol, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole).
  • Thống kê mức độ đề kháng theo từng nguồn gốc thịt phân lập, chỉ ra sự khác biệt về tần suất kháng giữa mẫu thịt gà, thịt lợn và thịt bò.
  • Phân tích các kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến và xác định danh sách các chủng mang kiểu hình đa kháng kháng sinh (MDR - kháng đồng thời từ 3 nhóm kháng sinh trở lên) để đưa vào phân tích phân tử chuyên sâu.
• Phân tích transcriptome và các nhóm gen ở các chủng đa kháng (6 mẫu nghiên cứu):
  • Đánh giá số lượng đọc trình tự (reads) thu nhận từ hệ thống Illumina HiSeq4000 và kết quả xử lý bằng phần mềm Trimmomatic.
  • Lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện: xác định số lượng contig (NC - Number of Contigs), kích thước contig dài nhất (LCS - Longest Contig Size), kích thước contig ngắn nhất (SCS - Shortest Contig Size) và kích thước trung bình của trình tự (MSS - Mean Sequence Size).
  • Chú thích chức năng các trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu.
  • Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen kháng thuốc biểu hiện và kiểu hình kháng kháng sinh thực tế của các chủng.
  • Xác định đột biến gen parC liên quan đến cơ chế đề kháng nhóm kháng sinh quinolone (đối chiếu với các gen mã hóa DNA gyrase).
  • Nhận diện hệ thống gen mã hóa các kênh bơm thải thuốc (efflux pump thuộc các họ RND, MFS, MATE, ABC) biểu hiện ở các chủng đa kháng.
  • Đánh giá biểu hiện của các nhóm gen độc lực (thể hiện qua biểu đồ nhiệt Heatmap), nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp lông (flagellar), nhóm gen tổng hợp lipopolysaccharide (LPS) và vách tế bào.
  • Phân tích các nhóm gen đáp ứng với chất gây độc, gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường, các yếu tố di truyền vận động, thực khuẩn thể (phage) và prophage.
  • Xác định các gen thuộc hệ thống kênh vận chuyển ABC.
• Xác nhận đột biến bằng giải trình tự Sanger: Trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen parC, kết quả so sánh trình tự nucleotide và đối chiếu sự thay đổi acid amin tương ứng, khẳng định tính chính xác của đột biến kháng quinolone đã phát hiện qua NGS.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên các nội dung văn bản và phần tự công bố của luận án, các kết quả và đóng góp mới gồm:

1. Dữ liệu dịch tễ học thực phẩm tại Hà Nội: Cung cấp số liệu thực nghiệm về tỷ lệ nhiễm Salmonella, phân bố các serovar và đặc tính kháng kháng sinh đối với 8 loại kháng sinh trên 90 mẫu thịt tươi sống (thịt lợn, thịt bò, thịt gà) tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn Hà Nội theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 6579:2002 và CLSI 2015.
2. Ứng dụng công nghệ NGS phân tích biểu hiện gen vi khuẩn đa kháng: Là công trình đầu tiên tại Việt Nam áp dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Illumina HiSeq) để phân tích toàn diện transcriptome và hệ thống các nhóm gen biểu hiện ở các chủng Salmonella đa kháng phân lập từ thực phẩm thịt bán lẻ.
3. Làm sáng tỏ cơ chế phân tử của tính đa kháng: Xác định danh mục các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các chủng nghiên cứu; chỉ ra mối liên quan giữa kiểu gen kháng thuốc và kiểu hình kháng kháng sinh thực nghiệm; phát hiện các đột biến điểm trên gen parC quy định tính kháng nhóm quinolone và được xác nhận chính xác bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger.
4. Hệ thống hóa các nhóm gen chức năng: Nhận diện và phân tích đồng thời biểu hiện của các nhóm gen mã hóa hệ thống bơm thải thuốc (efflux pumps), gen độc lực, gen tổng hợp flagellar, cấu trúc LPS/thành tế bào, các kênh vận chuyển ABC và các yếu tố di truyền vận động (phage, prophage) liên quan đến khả năng thích nghi và đề kháng của Salmonella.
5. Kiến nghị và giải pháp: Đề xuất sử dụng dữ liệu di truyền học phân tử để giám sát sự lưu hành của các chủng vi khuẩn đa kháng trong chuỗi thực phẩm; kiến nghị siết chặt quy định quản lý việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và điều trị thú y nhằm hạn chế áp lực chọn lọc làm lan truyền các chủng Salmonella đa kháng sang người.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:

  • Phạm vi thu thập mẫu tập trung tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn thành phố Hà Nội với quy mô 90 mẫu thịt tươi sống (30 mẫu/loại thịt), chưa bao quát toàn bộ các cơ sở giết mổ, trang trại chăn nuôi tập trung hoặc chuỗi phân phối siêu thị hiện đại.
  • Số lượng chủng được lựa chọn để giải trình tự thế hệ mới transcriptome còn giới hạn (6 chủng Salmonella đa kháng đại diện), chưa khảo sát toàn bộ các chủng phân lập được.
  • Phân tích tập trung vào mức độ biểu hiện RNA (transcriptome) và đột biến trên gen parC; các đột biến hiếm khác trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid chứa gen kháng thuốc chưa được giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) ở quy mô quần thể lớn.

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng quy mô lấy mẫu dọc theo toàn bộ chuỗi cung ứng thực phẩm từ trang trại, lò mổ đến bàn ăn trên nhiều tỉnh thành khác nhau.
  • Ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) kết hợp giải trình tự transcriptome trên quy mô mẫu lớn hơn để theo dõi đường truyền lây và sự tiến hóa di truyền của các plasmid kháng thuốc.
  • Nghiên cứu sâu chức năng của các đột biến mới và đánh giá vai trò của từng kênh bơm thải thuốc thông qua các thử nghiệm gây bất hoạt gen (gene knockout).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo trong các lĩnh vực:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu quy chuẩn về phương pháp phân lập vi khuẩn theo ISO 6579:2002, thử nghiệm kháng sinh đồ theo CLSI, cùng quy trình thực nghiệm tách chiết RNA vi khuẩn, tạo thư viện cDNA và pipeline phân tích tin sinh học dữ liệu RNA-seq từ máy Illumina.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Cung cấp hệ thống tài liệu tổng quan toàn diện về cấu trúc kháng nguyên, đặc điểm hệ gen (SPI, GI), cơ chế phân tử đề kháng 6 nhóm kháng sinh và hệ thống 4 họ kênh bơm thải thuốc ở Salmonella.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và dịch tễ học thú y: Cung cấp dẫn chứng thực tế về mức độ ô nhiễm và kiểu hình đa kháng kháng sinh của Salmonella trên các loại thịt bán lẻ tại Hà Nội, phục vụ công tác xây dựng chính sách giám sát kháng thuốc và quản lý việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã khảo sát bao nhiêu mẫu thịt và tại những địa bàn nào?
Luận án tiến hành khảo sát tổng cộng 90 mẫu thịt tươi sống, bao gồm 30 mẫu thịt gà, 30 mẫu thịt lợn và 30 mẫu thịt bò. Các mẫu được thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn Hà Nội, gồm: Long Biên, Cầu Giấy, Đống Đa, Nguyễn Công Trứ, Mai Động, Tân Mai, Trương Định, Tứ Liên, Kim Giang và Hà Đông.

2. Tiêu chuẩn và phương pháp nào được sử dụng để định danh Salmonella và thử nghiệm kháng sinh đồ?
Quy trình nuôi cấy, tăng sinh và định danh vi khuẩn được thực hiện theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 6579:2002, kết hợp thử nghiệm sinh hóa (Kligler, Ure, LDC, VP, Indole, ONPG) và ngưng kết với kháng huyết thanh O, H chuẩn của Denka Seiken (Nhật Bản). Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh thực hiện bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch Mueller Hinton theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI 2015).

3. Những loại kháng sinh nào được đưa vào đánh giá mức độ đề kháng trong nghiên cứu?
Nghiên cứu sử dụng 8 loại kháng sinh thuộc 6 nhóm phổ biến: Ampicillin (10 µg), Ceftazidime (30 µg), Gentamicin (10 µg), Streptomycin (10 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Chloramphenicol (30 µg), Tetracycline (30 µg) và Trimethoprim/sulfamethoxazole (1,25/23,75 µg).

4. Công nghệ giải trình tự gen nào được sử dụng để phân tích các chủng đa kháng và gen nào được chọn để kiểm chứng Sanger?
Tác giả sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina trên hệ thống máy HiSeq4000 để giải trình tự transcriptome của 6 mẫu Salmonella đa kháng sau khi xử lý thư viện cDNA bằng bộ kít TruSeq. Để kiểm chứng kết quả đột biến gen liên quan đến tính kháng kháng sinh nhóm quinolone, tác giả tiến hành khuếch đại PCR và giải trình tự gen parC bằng phương pháp Sanger trên máy Mastercycler pro.

5. Những nhóm gen chức năng chính nào được phân tích từ dữ liệu giải trình tự transcriptome của các chủng Salmonella đa kháng?
Các nhóm gen được chú thích và phân tích bao gồm: nhóm gen kháng kháng sinh; các đột biến gen kháng quinolone (parC); nhóm gen mã hóa hệ thống bơm thải thuốc (efflux pump); nhóm gen độc lực; nhóm gen tổng hợp lông (flagellar); nhóm gen tổng hợp LPS và thành tế bào; nhóm gen đáp ứng chất gây độc và điều kiện bất lợi; nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage; và nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thanh Việt đã hoàn thành việc phân lập, định danh và xác định kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng Salmonella từ 90 mẫu thịt tươi sống thu thập tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn Hà Nội. Nghiên cứu đã làm rõ đặc điểm đa kháng kháng sinh đối với các nhóm thuốc thông dụng và xác định được các serovar lưu hành trong nguồn thực phẩm thịt gà, thịt lợn, thịt bò. Điểm mấu chốt của công trình là việc ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina HiSeq4000 để phân tích transcriptome của các chủng đa kháng, làm sáng tỏ các nhóm gen kháng thuốc, hệ thống bơm thải, gen độc lực và khẳng định đột biến gen parC kháng quinolone bằng phương pháp Sanger. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử thực chứng phục vụ công tác giám sát dịch tễ học ô nhiễm thực phẩm và kiểm soát nguy cơ vi khuẩn kháng thuốc lây truyền sang người.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn.

Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm 1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S. Ở thời kỳ đó, hai loài S. Typhimurium được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã được công nhận rộng rãi.

Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng rộng rãi trên thế giới [1]. Đặc điểm sinh học của Salmonella Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2]. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S.

Hầu hết Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2]. Tính chất nuôi cấy Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC.

Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên 3 luan an môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen (ngoại trừ loại không sinh H2S) [2].

Tính chất hóa sinh Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi, đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính, lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase, và deoxyribonuclease. Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên.

Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số Salmonella khác [2].

Sức đề kháng Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối.

Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên [3]. Kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi.

Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Kháng nguyên O Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên khác nhau.

Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O, Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2]. Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1].

Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính. Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc N- acetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một. Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46 kháng nguyên O của Salmonella.

Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5]. Kháng nguyên H Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động.

Một số Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Paratyphi B có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động.

Tuy nhiên, chúng 5 luan an không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán huyết thanh [2]. Kháng nguyên Vi Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt.

Kháng nguyên Vi là polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này chỉ có ở S.

Phân loại Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật khác nhau.

Vì thế, các loài mới phát hiện được đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất. Tuy nhiên đề xuất này không được chấp nhận vì cách phân loại truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa thực tiễn riêng [2]. Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S.

enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). Hiện nay, người ta đã phát hiện được 2.610 serovar khác nhau (hình 1. Salmonella được phân thành các serovar bằng cách sử dụng hệ thống phân loại cổ điển của Kauffman. Các serovar được xác định nhờ sự kết hợp của 46 kháng nguyên O 6 luan an và 85 kháng nguyên H (bao gồm kháng nguyên H1 và H2).

Sự kết hợp này tạo ra khoảng 1. enterica subspecies enterica và khoảng 1.000 serovar trong các phân loài khác của S. Phân loại Salmonella [6]. Chú thích: Salmonella được phân thành hai loài là S.

Salmonella còn được chia thành dưới loài, trong đó, S. enterica gồm 6 dưới loài là I, II, IIIa, IIIb, IV và VI. bongori thuộc dưới loài V với 23 serovar. Salmonella dưới loài I có số lượng lớn nhất (1.547 serovar) trong đó 99% gây nhiễm trùng ở người và động vật.

Đặc điểm hệ gen của Salmonella 1. Cấu trúc hệ gen Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau, dao động từ 3,39 Mb đến 5,59 Mb. Số gen trung bình của Salmonella là 4.742 (dao động từ 3. Không có mối liên quan giữa kích thước hệ gen và số lượng gen.

Ngoài ra, Salmonella còn sở hữu từ 1 đến 2 plasmid. Các plasmid của Salmonella có kích thước rất khác nhau, dao động từ 2 kb đến 200 kb. Tuy nhiên, hầu hết Salmonella enterica không có plasmid. Ví dụ, các serovar như S.

Infantis và hầu hết các serovar độc khác thường không có plasmid. Ngược lại, các Salmonella thường xuyên gây bệnh ở người và động vật, ví dụ, S. Abortus-ovis thường sở hữu plasmid. enterica cần khoảng 3.

bongori cần khoảng 3.368 gen để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình thường [7]. So sánh trình tự protein ở Salmonella enterica người ta thấy rằng chúng có độ tương đồng từ 65% đến 99%. Hệ gen của Salmonella có tính bảo thủ cao và sự biến đổi trong hệ gen thường chỉ tập trung vào một số vùng đặc biệt.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng số họ gen của tất cả các serovar là khoảng 10. Salmonella có số lượng lớn các gen có tính bảo thủ cao, bên cạnh đó, số lượng các gen thu được trong quá trình sống cũng rất phong phú, bao gồm các Salmonella Pathogenicity Islands (SPI), các yếu tố di truyền chuyển vị, thực khuẩn thể, và plasmid (hình 1.

Các gen thu được này thường biến đổi, phong phú và khác nhau giữa các serovar [8]. 8 luan an Hình 1. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8]. Chú thích: hình bông hoa thể hiện gen chung và các gen riêng ở các serovar khác nhau.

Salmonella có khoảng 2. Cấu trúc hệ gen của S. Chú thích: vòng tròn ngoài cùng thể hiện vị trí các vùng gen khác nhau. Vòng tròn thứ hai từ ngoài vào thể hiện kích thước của hệ gen.

Vòng tròn thứ 9 luan an ba và thứ tư thể hiện vị trí của các vùng gen mã hóa theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ. Vòng tròn thứ năm thể hiện vị trí của các gen giả. Vòng tròn số 6 là gen chung với S. Vòng tròn số 8 là các gen chung với S.

Vòng tròn số 7 là gen riêng so với S. Vòng tròn số 9 là gen riêng so với S. Vòng tròn số 10 là vị trí các rRNA (màu đỏ). Hệ gen của Salmonella rất giống với hệ gen của E.

coli nhưng có thêm một số lượng lớn các gen độc tố.