Luận án tiến sĩ về đặc điểm kháng sinh và gen ở các chủng Salmonella đa kháng

Luận án tiến sĩ phân tích đặc điểm kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng, góp phần nâng cao hiểu biết về vi sinh vật.

• Tác giả: Nguyễn Thanh Việt
• Người hướng dẫn: GS. Nghiêm Ngọc Minh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Kháng Kháng Sinh Và Gen Liên Quan Ở Các Chủng Salmonella Đa Kháng
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella
• 1.2. Hình thái
• 1.3. Tính chất nuôi cấy
• 1.4. Tính chất hóa sinh
• 1.5. Kháng nguyên
• 1.5.1. Kháng nguyên O
• 1.5.2. Kháng nguyên H
• 1.5.3. Kháng nguyên Vi
• 1.6. Đặc điểm hệ gen của Salmonella
• 1.7. Cấu trúc hệ gen
• 1.8. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella
• 1.8.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside
• 1.8.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam
• 1.8.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol
• 1.8.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone
• 1.8.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline
• 1.8.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim
• 1.9. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn
• 1.10. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc
• 1.11. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc
• 1.12. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella
• 1.13. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm
• 1.13.1. Trên thế giới
• 1.13.2. Tại Việt Nam
• 1.14. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen
• 1.14.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR)
• 1.14.2. Real-time PCR (qPCR)
• 1.14.3. Giải trình tự thế hệ mới
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit
• 2.1.2. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002
• 2.1.3. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ
• 2.1.4. Kháng sinh
• 2.1.5. Thiết bị nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.2.2. Định danh Salmonella
• 2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc
• 2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc
• 2.2.2.3. Quy trình khẳng định
• 2.2.3. Kháng sinh đồ
• 2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới
• 2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học
• 2.2.5.1. Kiểm tra chất lượng trình tự
• 2.2.5.2. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57]
• 2.2.5.3. Lắp ráp de novo
• 2.2.5.4. Chú thích hệ gen biểu hiện
• 2.2.5.5. Xác định các gen kháng kháng sinh
• 2.2.5.6. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh
• 2.2.5.7. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger
• 2.2.6. Xử lý thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu
• 3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella
• 3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được
• 3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập
• 3.2.3. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập
• 3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh
• 3.2.5. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh
• 3.2.5.1. Số lượng trình tự đọc (read)
• 3.2.5.2. Lắp ráp de novo
• 3.2.5.3. Chú thích chức năng các gen
• 3.2.5.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu
• 3.2.5.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh
• 3.2.5.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone
• 3.2.5.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump)
• 3.2.5.4.4. Nhóm gen độc lực
• 3.2.5.4.5. Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar
• 3.2.5.4.6. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS) và thành tế bào
• 3.2.5.4.7. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc
• 3.2.5.4.8. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage
• 3.2.5.4.9. Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC
• 3.2.5.5. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 6. NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đặc điểm sinh học của Salmonella

Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại. Hình thái của Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân. Hầu hết Salmonella đều di động và không có vỏ, không sinh bào tử. Tính chất nuôi cấy của Salmonella cho thấy chúng dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí, phát triển tốt trên các môi trường nuôi cấy thông thường với nhiệt độ thích hợp là 37oC. Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5, với pH tối ưu là 6,5-7,5. Trên môi trường thích hợp, khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có khả năng sống trong môi trường khô và có thể tồn tại nhiều năm trong rác thải. Chúng nhạy cảm với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên.

II. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella

Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella rất đa dạng và phức tạp. Các nhóm kháng sinh như aminoglycoside, β-lactam, phenicol, quinolone và tetracycline đều có cơ chế kháng riêng. Đặc biệt, Salmonella có khả năng phát triển các kênh bơm thải thuốc, cho phép chúng loại bỏ kháng sinh ra khỏi tế bào. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển tính kháng. Nghiên cứu cho thấy rằng sự đột biến gen có thể dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc của các protein bơm thải, từ đó làm giảm hiệu quả của kháng sinh. Việc hiểu rõ cơ chế này không chỉ giúp trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc kiểm soát sự lây lan của Salmonella kháng kháng sinh.

III. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm

Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Salmonella là một trong bốn nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy. Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ Salmonella kháng kháng sinh đang gia tăng, gây khó khăn trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn. Việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là cần thiết để cung cấp thông tin cho việc dự phòng và kiểm soát bệnh tật. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về dịch tễ học phân tử của Salmonella mà còn có thể phát hiện các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

IV. Phân tích gen ở các chủng Salmonella đa kháng

Phân tích gen ở các chủng Salmonella đa kháng là một phần quan trọng trong nghiên cứu này. Các gen liên quan đến kháng kháng sinh, độc lực và kênh bơm thải thuốc được xác định và phân tích. Việc sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới cho phép xác định các nhóm gen và đột biến gen kháng kháng sinh. Kết quả cho thấy rằng có sự liên quan chặt chẽ giữa các đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở Salmonella. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về cơ chế kháng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong chuỗi cung ứng thực phẩm tươi sống và sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh (Multidrug Resistance - MDR) đang là mối đe dọa nghiêm trọng đối với an ninh y tế công cộng toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 550 triệu người mắc các bệnh tiêu chảy do tiêu thụ thực phẩm không an toàn, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi. Trực khuẩn Gram âm đường ruột Salmonella enterica là một trong bốn tác nhân căn nguyên hàng đầu gây bùng phát các vụ ngộ độc thực phẩm và nhiễm khuẩn tiêu hóa trên quy mô toàn cầu. Tại Việt Nam, sự bùng nổ nhu cầu tiêu thụ đạm động vật—với mức tiêu thụ thịt lợn tăng gấp 3 lần, thịt bò tăng 6 lần và thịt gia cầm tăng gấp 7 lần trong giai đoạn 1993–2015 theo số liệu từ Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc (FAO)—đã tạo ra áp lực chăn nuôi quy mô lớn đi kèm thói quen lạm dụng kháng sinh phòng ngừa, dẫn đến nguy cơ lây truyền các chủng vi khuẩn kháng thuốc dọc chuỗi từ nông trại đến bàn ăn.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) trọng yếu tại Việt Nam nằm ở chỗ: các nghiên cứu trước đây (như nghiên cứu dịch tễ học của Võ Thị Bích Thủy et al., 2009; Nguyễn Thị Nhung et al., 2014) chủ yếu dừng lại ở việc khảo sát dịch tễ học mô tả kiểu hình đề kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch truyền thống hoặc PCR đơn gen. Cho đến trước khi công trình này được thực hiện, hoàn toàn chưa có một nghiên cứu toàn diện nào ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) kết hợp hệ phiên mã (transcriptome) để phân tích đồng thời hồ sơ biểu hiện gen kháng thuốc, hệ thống bơm tống xuất (efflux pumps), các đột biến cấu trúc điểm trên các vùng quyết định kháng kháng sinh (QRDR) và mạng lưới yếu tố độc lực ở các chủng Salmonella MDR phân lập từ thực phẩm bán lẻ tại Việt Nam.

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thanh Việt (Chuyên ngành Vi sinh vật học, mã số: 9 42 01 07; bảo vệ tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2020) được thiết kế nhằm trả lời 3 câu hỏi nghiên cứu cốt lõi:

1. RQ1: Thực trạng nhiễm, tỷ lệ hiện diện và đặc điểm phân bố các serovar của Salmonella trong các loại thịt lợn, thịt bò và thịt gà lưu thông tại các chợ bán lẻ truyền thống khu vực nội và ngoại thành Hà Nội là gì?
2. RQ2: Mức độ nhạy cảm và mô hình đa kháng kháng sinh (MDR phenotype) của các chủng phân lập đối với các nhóm kháng sinh ưu tiên điều trị lâm sàng và thú y diễn ra như thế nào?
3. RQ3: Mối liên hệ ở cấp độ hệ gen biểu hiện giữa kiểu hình đề kháng với các nhóm gen kháng thuốc (ARGs), đột biến điểm cấu trúc phân tử (gyrA, parC), hệ thống kênh bơm thải thuốc đa cơ chất, các đảo sinh bệnh học (SPIs) và yếu tố di truyền vận động (MGEs) là gì?

Hệ thống giả thuyết nghiên cứu bao gồm:

• H1: Tỷ lệ nhiễm Salmonella và mức độ đa kháng trên thịt gia cầm và thịt gia súc bán lẻ tại Hà Nội ở mức cao do quá trình nhiễm chéo trong khâu giết mổ và lưu thông truyền thống.
• H2: Kiểu hình kháng ciprofloxacin và nhóm quinolone ở các chủng Salmonella đa kháng có mối liên hệ trực tiếp với các đột biến tích lũy trên gen mã hóa topoisomerase IV (parC) và DNA gyrase (gyrA).
• H3: Tính chất đa kháng kháng sinh không chỉ được thúc đẩy bởi các enzyme phân giải đặc hiệu plasmid-mediated mà còn bởi sự đồng biểu hiện của mạng lưới bơm tống xuất đa họ (RND, MFS, MATE, ABC) cùng các đảo di truyền ngoại lai (GI).

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên sự tích hợp giữa Thuyết chọn lọc tiến hóa phân tử vi sinh vật dưới áp lực chọn lọc kháng sinh (Darwinian Evolutionary Pressure), Thuyết phân loại kháng nguyên Kauffmann-White, và Khung phân loại cấu trúc men phân giải β-lactamase của Ambler. Quy mô nghiên cứu bao gồm 90 mẫu thịt tươi sống (30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt bò, 30 mẫu thịt gà) được thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ đại diện thuộc Hà Nội, kết hợp công nghệ giải trình tự hệ gen thế hệ mới Illumina HiSeq 4000 và kiểm chứng Sanger sequencing, mang lại đóng góp đột phá trong việc vạch rõ cơ chế phân tử của tính đa kháng tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu dịch tễ học và sinh học phân tử về Salmonella trên thế giới đã trải qua hơn một thế kỷ phát triển, từ khi Salmon (1884) lần đầu tiên phân lập trực khuẩn từ ruột lợn, cho đến các công trình kinh điển của Kauffmann và White phân lập hơn 2.600 serovar dựa trên kháng nguyên thân O (LPS) và kháng nguyên lông H. Trong những thập kỷ gần đây, làn sóng đề kháng kháng sinh của Salmonella đã trở thành tâm điểm của y học toàn cầu.

Trong y văn quốc tế, hiện tượng đa kháng kháng sinh ở Salmonella được ghi nhận diễn biến rất phức tạp. Nghiên cứu của Niyomdecha et al. (2016) tại Bangkok (Thái Lan) trên 120 mẫu thực phẩm ghi nhận tỷ lệ nhiễm Salmonella đạt 82% ở thịt lợn, 62% ở thịt bò, với các chủng chiếm ưu thế đề kháng cực cao đối với ampicillin, chloramphenicol, axit nalidixic, trimethoprim/sulfamethoxazole và tetracycline. Tại Trung Quốc, Cai et al. (2016) khảo sát chuỗi giết mổ và bán lẻ tại tỉnh Giang Tô cho thấy 71,8% mẫu thịt lợn ở lò mổ và 70,9% mẫu tại chợ bán lẻ nhiễm Salmonella, chứng minh sự lây truyền liên tục của các chủng kháng tetracycline dọc theo chuỗi cung ứng. Ngược lại, tại Nhật Bản, Katoh et al. (2015) theo dõi thịt gà bán lẻ tại Tokyo trong 20 năm (1992–2012) ghi nhận tỷ lệ nhiễm là 29,8%, nhưng có tới 89,9% chủng kháng thuốc và 90,2% là đa kháng (MDR), tập trung cao ở streptomycin (81,8%) và tetracycline (77,8%). Ở châu Âu, nghiên cứu của Tirziu et al. (2015) tại Romania phát hiện tỷ lệ nhiễm ở thịt gà là 13,2%, trong đó tetracycline có tỷ lệ kháng cao nhất, nhưng 100% các chủng vẫn duy trì tính nhạy cảm hoàn toàn với cephalosporin thế hệ 3 như cefotaxime và ceftazidime.

Tại Việt Nam, các công bố trước đó của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới và Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU) chỉ ra rằng dòng Salmonella enterica serovar Typhi H58 đa kháng đã lan tràn mạnh mẽ, với tỷ lệ kháng nalidixic acid tăng vọt từ 4% năm 1993 lên 97% năm 2005 (Wain et al., 2008). Đối với các chủng không gây thương hàn (NTS) từ thực phẩm, các khảo sát của Vo et al. (2009) tại Hà Nội trên thịt bò ghi nhận 39,9% nhiễm Salmonella với 46% là MDR; Thai et al. (2012) ghi nhận 39,6% thịt lợn và 42,9% thịt gà nhiễm Salmonella tại miền Bắc; và Tran et al. (2015) ghi nhận tỷ lệ nhiễm từ 58,3% đến 69,7% trên thịt gia súc, gia cầm tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Trong y văn tồn tại hai trường phái tranh luận lớn về cơ chế chủ đạo chi phối kiểu hình đa kháng ở vi khuẩn Gram âm đường ruột:

• Trường phái thứ nhất (Plasmid & Acquired ARGs): Cho rằng việc nhận các gen kháng thuốc ngoại lai thông qua chuyển gen ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT) qua plasmid, transposon và integron (ví dụ: các họ gen blaTEM, tetA/B, floR, sul1/2/3, aadA) là động lực quyết định tuyệt đối tính đề kháng lâm sàng.
• Trường phái thứ hai (Efflux Pumps & Epistasis Mutations): Dẫn đầu bởi các nghiên cứu của Nikaido (2009) và Piddock (2006), lập luận rằng sự điều hòa tăng biểu hiện của các kênh bơm tống xuất nội tại (như phức hợp RND: AcrAB-TolC) kết hợp với các đột biến tích lũy trên các gen điều hòa đích tác động mới là nền tảng tiên quyết giúp vi khuẩn sống sót ở nồng độ kháng sinh thấp, tạo tiền đề tích lũy các đột biến kháng mức độ cao.

Luận án này định vị chính xác vào điểm giao thoa của hai luồng quan điểm trên. Bằng việc phân tích toàn diện transcriptome biểu hiện gen thông qua NGS trên các chủng phân lập từ thực tế tại Hà Nội, luận án cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc chứng minh tính đa kháng ở Salmonella thực phẩm là kết quả hiệp đồng chặt chẽ: vi khuẩn vừa biểu hiện các gen kháng thuốc chuyên biệt thu nhận qua HGT, vừa kích hoạt mạng lưới bơm tống xuất đa cơ chất (RND, MFS, MATE, ABC) và tích lũy đột biến điểm amino acid trên các vùng bảo tồn phân tử (parC).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và đóng góp sâu sắc cho ba lý thuyết sinh học phân tử và vi sinh học kinh điển:

1. Mở rộng Thuyết Tiến hóa Kháng sinh Phân tử (Molecular Evolution of Antimicrobial Resistance): Khẳng định cơ chế tích lũy đột biến gen cấu trúc kết hợp với biểu hiện bù trừ hệ gen. Cụ thể, nghiên cứu làm sáng tỏ đột biến điểm trên gen parC (mã hóa tiểu đơn vị của Topoisomerase IV) đóng vai trò then chốt làm biến đổi cấu trúc không gian của đích gắn kháng sinh quinolone/fluoroquinolone, qua đó minh chứng cơ chế tiến hóa vi mô của vi khuẩn dưới áp lực đào thải trong môi trường chăn nuôi.
2. Bổ sung và củng cố Thuyết Bơm Tống xuất Đa Cơ chất (Multidrug Efflux Transport Paradigm của Nikaido): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về sự biểu hiện đồng thời của nhiều họ kênh bơm thải thuốc khác nhau—bao gồm họ RND (acrA, acrB, acrD, acrE, acrF, mdtA, mdtB, mdtC, mdsA, mdsB), họ MFS (emrA, emrB, mdfA), họ MATE (mdtK), và họ ABC (macA, macB) cùng protein liên kết màng ngoài tolC—ở các chủng Salmonella MDR thực phẩm ngay cả khi nuôi cấy trong điều kiện invitro thông thường.
3. Phát triển Khung Đảo Sinh học và Yếu tố Di truyền Vận động (Pathogenicity & Genomic Islands Theory): Làm rõ mối liên hệ giữa độc lực vi khuẩn và tính kháng thuốc thông qua việc phát hiện sự đồng biểu hiện của các hệ gen tiết Loại III (T3SS) thuộc các đảo sinh bệnh học (SPI-1, SPI-2) cùng với các prophage và transposon chèn đoạn, định hình mô hình tiến hóa đồng thời giữa "Độc lực - Kháng thuốc" (Virulence-Resistance Co-evolution).

Khung phân tích độc đáo

Luận án xây dựng khung phân tích đa chiều tích hợp ba trục phương pháp luận:

• Trục 1 - Kiểu hình Vi sinh Chuẩn mực: Ứng dụng quy chuẩn quốc tế ISO 6579:2002 về phân lập định danh Salmonella kết hợp định type huyết thanh theo bảng phân loại Kauffmann-White (46 kháng nguyên O và 85 kháng nguyên H) và đánh giá độ nhạy cảm kháng sinh theo tiêu chuẩn CLSI-2015.
• Trục 2 - Hệ gen học Biểu hiện (Transcriptomics/Functional Genomics): Ứng dụng giải trình tự RNA-Seq bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina HiSeq 4000, lắp ráp de novo transcriptome để khảo sát toàn diện không định kiến (unbiased) hàng nghìn gen đang phiên mã liên quan đến đề kháng, độc lực, sinh tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS), cấu trúc lông (flagella) và các protein sốc môi trường.
• Trục 3 - Xác thực Di truyền Đích (Molecular Targeted Validation): Kiểm chứng lại các đột biến phát hiện từ NGS bằng phản ứng khuếch đại gen PCR chuyên biệt và giải trình tự gen chuẩn Sanger trên máy Mastercycler pro, thiết lập độ tin cậy tuyệt đối cho các phát hiện biến dị phân tử.

Điều kiện biên (Boundary Conditions): Khung phân tích được áp dụng cho các chủng Salmonella enterica phân lập từ thực phẩm thịt tươi sống (lợn, bò, gà) tại thị trường bán lẻ nhiệt đới, trong điều kiện không chịu áp lực kháng sinh trực tiếp tại thời điểm nuôi cấy phân tích biểu hiện RNA.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng theo lập trường triết học thực chứng (Positivism) với thiết kế định lượng thực nghiệm nghiêm ngặt. Phương pháp tiếp cận đa tầng (Multi-level experimental design) kết hợp giữa vi sinh học cổ điển, kháng sinh đồ lâm sàng và sinh học phân tử hệ gen học chức năng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Thu thập mẫu và Địa bàn: 90 mẫu thịt tươi sống được lấy ngẫu nhiên tại 10 chợ dân sinh lớn trên địa bàn Hà Nội, gồm: Long Biên, Cầu Giấy, Đống Đa, Nguyễn Công Trứ, Mai Động, Tân Mai, Trương Định, Tứ Liên, Kim Giang, và Hà Đông. Mỗi chợ thu thập 3 mẫu thịt gà (TG), 3 mẫu thịt lợn (TL), 3 mẫu thịt bò (TB).
2. Quy trình Nuôi cấy và Phân lập Chuẩn hóa (ISO 6579:2002):
   • Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc: 25g mẫu thịt được đồng nhất trong 225ml nước Peptone đệm (BPW, Oxoid, CM0509), ủ ở 37°C trong 18 ± 2 giờ.
   • Tăng sinh chọn lọc: Chuyển dịch tăng sinh sang môi trường bán lỏng Rappaport-Vassiliadis biến đổi (MSRV, Oxoid, CM1112) bổ sung novobiocin (0,01 g/l), ủ ở 41,5°C trong 24 giờ; và canh thang Muller-Kauffmann Tetrathionate-novobiocin (MKTTn, Oxoid, CM1048), ủ ở 37°C trong 24 giờ.
   • Phân lập trên môi trường chọn lọc: Cấy ria từ dịch tăng sinh lên đĩa thạch Xylose Lysine Deoxycholate (XLD, Oxoid, CM0469) và thạch Salmonella Shigella (SS, Oxoid, CM0099), ủ ở 37°C trong 24 giờ. Khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch XLD có tâm đen, viền đỏ do tạo kết tủa H2S và chuyển hóa decarboxylase lysine.
   • Khẳng định sinh hóa: Kiểm tra phản ứng trên thạch Kligler (lactose/glucose/H2S/sinh hơi), dung dịch Ure (kiểm tra men urease), dung dịch L-Lysine decarboxylase (LDC), phản ứng Voges-Proskauer (VP), phản ứng tạo Indole bằng thuốc thử Kovacs, và phép thử ONPG.
   • Định type huyết thanh: Sử dụng bộ kháng huyết thanh chuẩn O và H đơn giá và đa giá của hãng Denka Seiken Co. (Tokyo, Nhật Bản).
3. Thử nghiệm Kháng sinh đồ (Antibiogram):
   • Thực hiện theo kỹ thuật khuếch tán khoanh giấy kháng sinh trên thạch Mueller-Hinton (Biolife, Italy, N0401740 BE-0) theo khuyến nghị của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI-2015).
   • Danh mục 8 kháng sinh khảo sát: Ampicillin (AM 10µg), Ceftazidime (CAZ 30µg), Gentamicin (GN 10µg), Streptomycin (STR 10µg), Ciprofloxacin (CIP 5µg), Chloramphenicol (C 30µg), Tetracycline (TE 30µg), Trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT 1.25/23.75µg) do hãng BD Diagnostics cung cấp.
4. Chiết tách RNA và Giải trình tự Thế hệ mới NGS:
   • Tách chiết RNA tổng số từ các chủng đa kháng bằng thuốc thử TRIzol Reagent (Invitrogen, Cat. 15596026) kết hợp tinh sạch bằng RNase-free DNase Set (QIAGEN, Cat. 79254) để loại bỏ hoàn toàn DNA bộ gen.
   • Định lượng và kiểm định độ tinh sạch RNA qua tỷ số A260/A280 trên máy quang phổ NanoDrop ND-1000 và đo chỉ số toàn vẹn RNA (RIN) trên hệ thống Agilent 2100 Bioanalyzer.
   • Thư viện cDNA được tạo lập bằng bộ kit TruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit / TruSeq Stranded mRNA Kit (Illumina).
   • Giải trình tự thế hệ mới trên nền tảng Illumina HiSeq 4000 tại Phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen.

Data và phân tích

Dữ liệu thô (raw reads) từ máy Illumina HiSeq 4000 được xử lý qua chuỗi tin sinh học chuẩn hóa:

• Kiểm soát chất lượng: Đánh giá điểm chất lượng Phred score ($Q \ge 30$, độ chính xác đạt 99,9%). Loại bỏ adapter và lọc các đoạn đọc chất lượng thấp bằng phần mềm Trimmomatic.
• Lắp ráp de novo và Chú giải: Lắp ráp hệ phiên mã de novo sử dụng phần mềm Geneious (hỗ trợ bởi TS. Moreland Gibbs, New Zealand). Đánh giá các chỉ số contig: Độ dài contig dài nhất (Longest Contig Size - LCS), độ dài ngắn nhất (SCS), kích thước trung bình (Mean Sequence Size - MSS) và số lượng contig (NC).
• Khai phá dữ liệu chức năng:
  • Định danh các gen kháng thuốc (ARGs) qua đối chiếu cơ sở dữ liệu CARD và ResFinder.
  • Phân loại các họ gen bơm tống xuất (Efflux pumps: RND, MFS, MATE, ABC) và kênh vận chuyển ABC.
  • Phân tích các cụm gen độc lực, đảo sinh bệnh học (SPIs), gen tổng hợp kháng nguyên lông (flagellar), cụm gen tổng hợp lipopolysaccharide (LPS) và màng ngoài tế bào.
  • Phát hiện các yếu tố di truyền chuyển vị, integron, phage và prophage tích hợp.
• Xác thực Đột biến bằng PCR và Sanger: Sử dụng máy PCR Mastercycler®pro (Eppendorf, Đức) khuếch đại gen đích parC và gyrA, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự Sanger để xác định chính xác các đột biến sai nghĩa (missense mutation) thay đổi amino acid.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

[!IMPORTANT] Dữ liệu thực nghiệm cốt lõi:

1. "Kết quả phân lập và định danh từ 90 mẫu thịt tươi sống thu thập tại các chợ bán lẻ Hà Nội đã phát hiện tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mức cao đáng báo động, phân bố trên cả ba nguồn thịt: thịt gà, thịt lợn và thịt bò."
2. "Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của các chủng phân lập tập trung cao ở các kháng sinh truyền thống và quan trọng: Tetracycline (TE), Ampicillin (AM), Streptomycin (STR), Sulfamethoxazole/Trimethoprim (SXT) và Chloramphenicol (C)."
3. "Giải trình tự thế hệ mới NGS và kiểm chứng Sanger đã chứng minh kiểu hình kháng ciprofloxacin và quinolone ở các chủng Salmonella đa kháng gắn liền với đột biến cấu trúc điểm trên gen parC dẫn đến sự thay đổi amino acid đặc hiệu tại vị trí quyết định kháng thuốc."

1. Thực trạng ô nhiễm và đa dạng serovar phân lập: Tỷ lệ phân lập Salmonella dương tính cao tại các chợ bán lẻ Hà Nội cho thấy thịt tươi sống là nguồn chứa vi khuẩn lớn. Sự hiện diện đa dạng của các serovar thuộc loài Salmonella enterica subspecies enterica (dưới loài I) khẳng định nguy cơ lây nhiễm chéo phổ biến trong điều kiện vệ sinh quầy sạp truyền thống.
2. Hồ sơ đa kháng kháng sinh (MDR Profile) nghiêm trọng: Phần lớn các chủng phân lập biểu hiện tính đa kháng (kháng đồng thời từ 3 nhóm kháng sinh trở lên). Kiểu hình kháng phổ biến nhất là sự kết hợp giữa nhóm Aminopenicillin (AM), Tetracycline (TE), Phenicol (C), Sulfonamide/Trimethoprim (SXT) và Aminoglycoside (STR/GN). Sự xuất hiện của các chủng giảm nhạy cảm hoặc kháng ciprofloxacin—kháng sinh fluoroquinolone đầu tay trong điều trị nhiễm khuẩn đường tiêu hóa—đặt ra cảnh báo lâm sàng khẩn cấp.
3. Giải mã toàn diện hệ phiên mã (Transcriptome) của các chủng MDR:
   • Gen kháng kháng sinh chuyên biệt: Phát hiện sự biểu hiện mạnh mẽ của các gen mã hóa men β-lactamase nhóm blaTEM, các gen kháng tetracycline nhóm tetA/tetB, gen bơm xuất chloramphenicol floR, và các gen kháng sulfonamide sul1, sul2.
   • Mạng lưới Bơm tống xuất (Efflux Pumps): Xác định sự biểu hiện đồng thời của hàng loạt gen bơm tống xuất thuộc 4 họ chính: Họ RND (acrA, acrB, acrD, acrEF, mdtABC, mdsAB), Họ MFS (emrAB, mdfA), Họ MATE (mdtK), và Họ ABC (macAB), kết hợp chặt chẽ với kênh màng ngoài tolC.
   • Hệ thống Độc lực và Cấu trúc Bề mặt: Ghi nhận sự phiên mã của các gen cấu trúc flagella (fliC, fljB), cụm gen sinh tổng hợp vỏ LPS, protein màng ngoài (OMP) và các gen hiệu ứng độc lực nằm trên đảo sinh học SPI-1, SPI-2, giúp vi khuẩn vừa chống chịu kháng sinh vừa tăng khả năng xâm lấn tế bào vật chủ.
4. Phát hiện đột biến điểm kháng Quinolone trên gen parC: Phân tích dữ liệu NGS kết hợp giải trình tự Sanger đã xác nhận đột biến nucleotide dẫn đến biến đổi amino acid trong miền QRDR của tiểu đơn vị Topoisomerase IV mã hóa bởi gen parC. Đây là bằng chứng phân tử trực tiếp giải thích cơ chế đề kháng fluoroquinolone ở các chủng Salmonella MDR thực phẩm tại miền Bắc Việt Nam.

Implications đa chiều

• Về Lý thuyết và Khoa học: Công trình chứng minh rằng khả năng kháng thuốc của Salmonella trong chuỗi thực phẩm không phải là hiện tượng đơn lẻ mà là một hệ thống thích ứng phối hợp phức tạp giữa đột biến gen cấu trúc phân tử, hoạt hóa bơm tống xuất nội tại đa họ và tiếp nhận gen đề kháng ngoại lai.
• Về Phương pháp luận: Thiết lập quy trình chuẩn mực kết hợp giữa phương pháp vi sinh tiêu chuẩn (ISO, CLSI) với công nghệ NGS Illumina và giải trình tự Sanger, tạo hình mẫu phân tích dịch tễ học phân tử thế hệ mới cho các nghiên cứu an toàn thực phẩm tại các nước đang phát triển.
• Về Ứng dụng Thực tiễn và Thú y: Cung cấp cơ sở khoa học thuyết phục yêu cầu cơ quan quản lý đình chỉ việc lạm dụng tetracycline, ampicillin và chloramphenicol trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm cắt đứt chuỗi tích lũy gen kháng.
• Về Y tế Công cộng và Chính sách (One Health): Cung cấp bằng chứng thực địa cho Bộ Y tế và Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn trong việc xây dựng Chiến lược Quốc gia về Phòng chống Kháng thuốc (National Action Plan on AMR), thúc đẩy giám sát liên ngành từ trang trại đến chợ dân sinh.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những phát hiện mang tính đột phá, luận án thẳng thắn thừa nhận các giới hạn nghiên cứu:

1. Phạm vi Địa lý và Cỡ mẫu: Nghiên cứu thu thập 90 mẫu thịt tại 10 chợ thuộc địa bàn Hà Nội. Quy mô này mang tính đại diện cao cho khu vực đô thị miền Bắc nhưng chưa bao phủ toàn diện các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau (như Đồng bằng sông Cửu Long hoặc miền Trung).
2. Môi trường Nuôi cấy Biểu hiện Gen: Dữ liệu giải trình tự RNA-Seq được thực hiện sau khi vi khuẩn được phục hồi và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn (in vitro), chưa phản ánh hoàn toàn động học biểu hiện transcriptome tức thời (in situ) của Salmonella khi đang cư trú trực tiếp trên bề mặt mô thịt hoặc trong lòng ruột động vật.
3. Phân tích Chức năng Knockout: Luận án chưa thực hiện các thử nghiệm gây bất hoạt gen (gene knockout) có định hướng đối với từng kênh bơm thải thuốc hoặc tái tạo đột biến điểm parC trên chủng chuẩn để đo lường chính xác sự thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Định hướng nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Mở rộng giám sát hệ gen vi khuẩn (Whole Genome Sequencing - WGS) trên quy mô toàn quốc theo khung chương trình Một Sức Khỏe (One Health), tích hợp mẫu từ người bệnh, động vật nuôi và môi trường nước thải.
• Ứng dụng kỹ thuật Metatranscriptomics trực tiếp trên mẫu thực phẩm mà không cần qua bước nuôi cấy tăng sinh nhằm ghi nhận bức tranh biểu hiện gen nguyên bản.
• Nghiên cứu sâu cơ chế điều hòa biểu hiện của hệ thống hai thành phần (Two-component regulatory systems: MarA-SoxS-Rob) trong việc kiểm soát hoạt động của phức hợp bơm AcrAB-TolC.
• Thử nghiệm các hợp chất tự nhiên và phân tử nhỏ có hoạt tính ức chế bơm tống xuất (Efflux Pump Inhibitors - EPIs) nhằm tái nhạy cảm hóa các chủng Salmonella MDR với các kháng sinh thông thường.

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng Học thuật (Academic Impact): Luận án là một trong những công trình tiên phong tại Việt Nam áp dụng công nghệ NGS HiSeq 4000 vào nghiên cứu hệ gen biểu hiện của vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm. Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành quốc tế uy tín và tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước, đóng góp dữ liệu quý giá vào ngân hàng gen quốc tế (NCBI).
• Tác động Ngành Thực phẩm và Chăn nuôi: Cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh chuẩn xác để các doanh nghiệp chăn nuôi, giết mổ và chế biến thực phẩm tái cấu trúc quy trình kiểm soát mối nguy theo tiêu chuẩn HACCP và ISO 22000, kiểm soát chặt chẽ nguy cơ nhiễm chéo tại quầy bán lẻ.
• Tác động Chính sách và Xã hội: Dữ liệu thực chứng của luận án là luận cứ khoa học quan trọng phục vụ Cục An toàn Thực phẩm (Bộ Y tế) và Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp) trong việc siết chặt quản lý kê đơn kháng sinh thú y, nâng cao nhận thức cộng đồng về an toàn vệ sinh thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới Học thuật (Vi sinh / Công nghệ Sinh học): Tiếp cận một khung phương pháp luận kết hợp chuẩn mực giữa nuôi cấy cổ điển và tin sinh học NGS hiện đại; mở ra các hướng đề tài mới về cơ chế kháng thuốc mức độ phân tử.
• Bác sĩ Lâm sàng và Cán bộ Vi sinh Y tế: Nắm bắt được xu hướng đa kháng và các đột biến gen kháng ciprofloxacin của Salmonella lưu hành trong cộng đồng để lựa chọn phác đồ kháng sinh kinh nghiệm hiệu quả, hạn chế thất bại điều trị.
• Cơ quan Quản lý An toàn Thực phẩm và Thú y: Sở hữu bằng chứng khoa học cụ thể về tỷ lệ nhiễm và mức độ nguy hại của các chủng MDR tại chợ truyền thống để ban hành các quy chuẩn kỹ thuật về điều kiện vệ sinh quầy sạp và giết mổ.
• Các Nhà sản xuất Thuốc Thú y và Chế phẩm Sinh học: Định hướng nghiên cứu phát triển các chế phẩm thay thế kháng sinh (Probiotics, Bacteriophage therapy, Kháng thể lòng đỏ IgY, Efflux Pump Inhibitors) phục vụ nền chăn nuôi an toàn sinh học.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc làm sáng tỏ cơ chế đa kháng đa tầng (Multi-layered MDR mechanism) ở Salmonella enterica thực phẩm, mở rộng Thuyết Bơm Tống xuất Đa Cơ chất (Nikaido) và Thuyết Tiến hóa Kháng thuốc Phân tử. Luận án chứng minh tính đa kháng không đơn thuần phụ thuộc vào các gen sinh men phân giải thu nhận qua plasmid, mà là sự đồng hiệp đồng giữa việc kích hoạt đồng thời 4 họ kênh bơm tống xuất (RND, MFS, MATE, ABC) cùng kênh tolC, kết hợp với sự biến đổi cấu trúc protein đích qua đột biến điểm trên vùng QRDR của gen parC.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận cốt lõi so với các nghiên cứu trước đây?

So với các nghiên cứu trước tại Việt Nam và khu vực (như Vo et al., 2009; Thai et al., 2012; Cai et al., 2016) vốn chỉ dùng kháng sinh đồ khoanh giấy và PCR đơn gen, luận án đã tạo bước nhảy vọt khi:

• Chuẩn hóa quy trình phân lập theo ISO 6579:2002 và định type huyết thanh Kauffmann-White đầy đủ.
• Tiên phong ứng dụng hệ thống giải trình tự thế hệ mới Illumina HiSeq 4000 để phân tích toàn bộ hệ phiên mã de novo.
• Ứng dụng quy trình kiểm chứng kép (Dual-validation protocol): phát hiện đột biến bằng NGS transcriptome và tái khẳng định chuẩn xác bằng giải trình tự Sanger chuyên biệt.

3. Phát hiện bất ngờ nhất về mặt dữ liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là sự đồng biểu hiện mạnh mẽ của các cụm gen bơm tống xuất đa cơ chất (đặc biệt là họ RND và MFS) cùng mạng lưới gen đảo độc lực (SPI-1, SPI-2) ngay trong điều kiện nuôi cấy in vitro chuẩn không có mặt kháng sinh. Điều này chứng minh các chủng Salmonella MDR lưu hành tại chợ bán lẻ đã hình thành trạng thái sinh lý thích ứng cao độ (primed state), luôn sẵn sàng đề kháng và duy trì độc lực cao khi xâm nhập vào vật chủ.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản nghiên cứu (Replication Protocol) không?

Có. Luận án mô tả chi tiết từng bước quy trình kỹ thuật: từ hàm lượng hóa chất, môi trường chuẩn (BPW, MSRV, MKTTn, XLD, SS, BHI, Mueller-Hinton theo chuẩn ISO và CLSI), nồng độ khoanh kháng sinh, quy trình chiết tách RNA bằng TRIzol và DNase on-column của QIAGEN, kiểm chuẩn chất lượng Bioanalyzer, thông số chạy máy Illumina HiSeq 4000, cho đến bộ tham số tin sinh học (Trimmomatic, Geneious) và các cặp mồi PCR kiểm chứng Sanger.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm (10-year research agenda) được vạch ra như thế nào?

Chương trình 10 năm hướng tới: (1) Xây dựng cơ sở dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) quốc gia cho các chủng vi khuẩn lây truyền qua thực phẩm; (2) Giải mã tương tác biểu sinh (Epigenetics) và vai trò của các RNA không mã hóa (sRNA) trong điều hòa bơm tống xuất; (3) Sàng lọc và thử nghiệm tiền lâm sàng các chất ức chế bơm tống xuất (EPIs); (4) Phát triển liệu pháp thực khuẩn thể (Phage therapy) đặc hiệu để tiêu diệt các dòng Salmonella MDR trong chuỗi chăn nuôi khép kín.

Kết luận

1. Luận án đã phân lập, định danh và xác định chính xác tỷ lệ lưu hành cùng sự đa dạng serovar của Salmonella enterica trên 90 mẫu thịt lợn, thịt bò và thịt gà tại 10 chợ bán lẻ trên địa bàn Hà Nội theo tiêu chuẩn quốc tế ISO 6579:2002 và phân loại Kauffmann-White.
2. Thiết lập bức tranh dịch tễ học kháng kháng sinh chi tiết theo tiêu chuẩn CLSI-2015, chứng minh tỷ lệ đa kháng (MDR) ở mức rất cao, tập trung vào các kháng sinh chủ lực: tetracycline, ampicillin, streptomycin, chloramphenicol và sulfamethoxazole/trimethoprim.
3. Tiên phong giải trình tự toàn diện hệ phiên mã (Transcriptome) của các chủng Salmonella MDR bằng công nghệ NGS Illumina HiSeq 4000, chú giải thành công hệ thống gen kháng thuốc chuyên biệt (blaTEM, tet, floR, sul) và mạng lưới bơm tống xuất đa họ (RND, MFS, MATE, ABC) liên kết với kênh màng ngoài tolC.
4. Phát hiện và kiểm chứng thành công bằng giải trình tự Sanger các đột biến điểm gây biến đổi amino acid trên gen cấu trúc parC, cung cấp bằng chứng phân tử giải thích cơ chế kháng ciprofloxacin và nhóm quinolone ở Salmonella thực phẩm tại Việt Nam.
5. Chứng minh mối liên hệ đồng tiến hóa giữa tính đa kháng kháng sinh và biểu hiện độc lực (SPI-1, SPI-2, flagella, LPS), khẳng định nguy cơ y tế công cộng to lớn của các dòng vi khuẩn lưu hành.
6. Mở ra 3 nhánh nghiên cứu chuyên sâu mới: Dịch tễ học hệ gen học chức năng vi sinh vật thực phẩm (Food Microbial Functional Genomics), Sinh học phân tử về cơ chế điều hòa bơm tống xuất vi khuẩn, và Nghiên cứu phát triển các phân tử ức chế kháng thuốc (EPIs) phục vụ chiến lược Một Sức Khỏe (One Health) tại Việt Nam và trên trường quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn.

Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm 1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S. Ở thời kỳ đó, hai loài S. Typhimurium được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã được công nhận rộng rãi.

Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng rộng rãi trên thế giới [1]. Đặc điểm sinh học của Salmonella Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2]. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S.

Hầu hết Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2]. Tính chất nuôi cấy Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC.

Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên 3 luan an môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen (ngoại trừ loại không sinh H2S) [2].

Tính chất hóa sinh Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi, đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính, lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase, và deoxyribonuclease. Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên.

Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số Salmonella khác [2].

Sức đề kháng Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối.

Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên [3]. Kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi.

Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Kháng nguyên O Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên khác nhau.

Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O, Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2]. Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1].

Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính. Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc N- acetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một. Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46 kháng nguyên O của Salmonella.

Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5]. Kháng nguyên H Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động.

Một số Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Paratyphi B có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động.

Tuy nhiên, chúng 5 luan an không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán huyết thanh [2]. Kháng nguyên Vi Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt.

Kháng nguyên Vi là polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này chỉ có ở S.

Phân loại Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật khác nhau.

Vì thế, các loài mới phát hiện được đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất. Tuy nhiên đề xuất này không được chấp nhận vì cách phân loại truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa thực tiễn riêng [2]. Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S.

enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). Hiện nay, người ta đã phát hiện được 2.610 serovar khác nhau (hình 1. Salmonella được phân thành các serovar bằng cách sử dụng hệ thống phân loại cổ điển của Kauffman. Các serovar được xác định nhờ sự kết hợp của 46 kháng nguyên O 6 luan an và 85 kháng nguyên H (bao gồm kháng nguyên H1 và H2).

Sự kết hợp này tạo ra khoảng 1. enterica subspecies enterica và khoảng 1.000 serovar trong các phân loài khác của S. Phân loại Salmonella [6]. Chú thích: Salmonella được phân thành hai loài là S.

Salmonella còn được chia thành dưới loài, trong đó, S. enterica gồm 6 dưới loài là I, II, IIIa, IIIb, IV và VI. bongori thuộc dưới loài V với 23 serovar. Salmonella dưới loài I có số lượng lớn nhất (1.547 serovar) trong đó 99% gây nhiễm trùng ở người và động vật.

Đặc điểm hệ gen của Salmonella 1. Cấu trúc hệ gen Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau, dao động từ 3,39 Mb đến 5,59 Mb. Số gen trung bình của Salmonella là 4.742 (dao động từ 3. Không có mối liên quan giữa kích thước hệ gen và số lượng gen.

Ngoài ra, Salmonella còn sở hữu từ 1 đến 2 plasmid. Các plasmid của Salmonella có kích thước rất khác nhau, dao động từ 2 kb đến 200 kb. Tuy nhiên, hầu hết Salmonella enterica không có plasmid. Ví dụ, các serovar như S.

Infantis và hầu hết các serovar độc khác thường không có plasmid. Ngược lại, các Salmonella thường xuyên gây bệnh ở người và động vật, ví dụ, S. Abortus-ovis thường sở hữu plasmid. enterica cần khoảng 3.

bongori cần khoảng 3.368 gen để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình thường [7]. So sánh trình tự protein ở Salmonella enterica người ta thấy rằng chúng có độ tương đồng từ 65% đến 99%. Hệ gen của Salmonella có tính bảo thủ cao và sự biến đổi trong hệ gen thường chỉ tập trung vào một số vùng đặc biệt.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng số họ gen của tất cả các serovar là khoảng 10. Salmonella có số lượng lớn các gen có tính bảo thủ cao, bên cạnh đó, số lượng các gen thu được trong quá trình sống cũng rất phong phú, bao gồm các Salmonella Pathogenicity Islands (SPI), các yếu tố di truyền chuyển vị, thực khuẩn thể, và plasmid (hình 1.

Các gen thu được này thường biến đổi, phong phú và khác nhau giữa các serovar [8]. 8 luan an Hình 1. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8]. Chú thích: hình bông hoa thể hiện gen chung và các gen riêng ở các serovar khác nhau.

Salmonella có khoảng 2. Cấu trúc hệ gen của S. Chú thích: vòng tròn ngoài cùng thể hiện vị trí các vùng gen khác nhau. Vòng tròn thứ hai từ ngoài vào thể hiện kích thước của hệ gen.

Vòng tròn thứ 9 luan an ba và thứ tư thể hiện vị trí của các vùng gen mã hóa theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ. Vòng tròn thứ năm thể hiện vị trí của các gen giả. Vòng tròn số 6 là gen chung với S. Vòng tròn số 8 là các gen chung với S.

Vòng tròn số 7 là gen riêng so với S. Vòng tròn số 9 là gen riêng so với S. Vòng tròn số 10 là vị trí các rRNA (màu đỏ). Hệ gen của Salmonella rất giống với hệ gen của E.

coli nhưng có thêm một số lượng lớn các gen độc tố.