MỞ ĐẦU L-asparaginase (EC.1; L-asparagine amino-hydrolase) là enzyme phân hủy L-asparagine - một chất dinh dưỡng quan trọng của tế bào ung thư. Thuốc L- asparaginase đã chứng minh hiệu quả lâm sàng trong bệnh bạch cầu cấp đặc biệt là bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, u lympho ác tính và sarcoma lympho. L- asparaginase thủy phân nguồn asparagine ở bên ngoài tế bào buộc các tế bào dựa hoàn toàn vào những gì chúng có thể tự tổng hợp được. Tế bào bình thường gần như không cần nhiều asparagine để tồn tại và có thể tự tổng hợp được asparagine nhờ asparagine synthetase do đó bị ảnh hưởng ít hơn.
Trong khi đó tế bào ung thư nhất là ung thư máu không có asparagine synthetase để tổng hợp asparagine, hơn nữa chúng lại cần rất nhiều asparagine cho sự phát triển khổng lồ của chúng do đó chúng dễ dàng bị tiêu diệt khi điều trị bằng L-asparaginase. Với tốc độ tăng nhanh, ung thư đang là gánh nặng toàn cầu, phòng ngừa và chữa trị ung thư là một trong những thách thức sức khỏe cộng đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21. Năm 2018, ước tính có khoảng 18 triệu trường hợp ung thư trên toàn thế giới trong đó bệnh ung thư máu chiếm khoảng 581 nghìn người. Ung thư máu là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em với ba phần tư trường hợp bệnh là ở loại bạch cầu lympho cấp.
L-asparaginase là một trong những ứng viên hàng đầu trong điều trị ung thư máu ở người. Hiện tại L-asparaginase là thuốc không thể thiếu trong phác đồ hóa trị liệu bạch cầu cấp dòng lympho cho trẻ em cũng như người lớn. L-asparaginase có trong vi khuẩn, nấm, thực vật và cả trong mô động vật nhưng không tìm thấy ở người. Hiện tại chỉ có ba chế phẩm L-asparaginase được sử dụng trong điều trị ung thư: một là L-asparaginase từ Escherichia coli, hai là dạng enzyme này được gắn thêm polyethylene glycol, ba là L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi (Dickeya chrysanthemi).
coli sản xuất ra hai loại L-asparaginase I và L-asparaginase II. Loại I được tìm thấy trong tế bào chất trong khi loại II tồn tại trong khoang chu chất (periplasmic) của màng tế bào vi khuẩn và có ái lực với L- luan an 2 asparagine cao hơn. Chỉ có L-asparaginase II được sử dụng trong ứng dụng lâm sàng. L-asparaginase II từ E.
coli và từ Erw. chrysanthemi có cùng một cơ chế chống lại các tế bào khối u, tuy nhiên dược động học, ái lực với cơ chất và mức độ nhạy cảm với bộ máy miễn dịch là khác nhau. Do đó, L-asparaginase từ Erw. chrysanthemi là một lựa chọn quan trọng cho những bệnh nhân có đáp ứng dị ứng với L-asparaginase từ E.
Tuy nhiên việc sử dụng L-asparaginase vẫn còn phải đối mặt với một số thách thức như có một số loại phản ứng dị ứng xảy ra do tính miễn dịch cao cũng như do độc tính lâm sàng; đời sống enzyme ngắn; sản lượng L-asparaginase thấp do gene biểu hiện thấp dẫn đến chi phí của thuốc kháng u này khá cao. Sử dụng công nghệ tái tổ hợp trong sản xuất L-asparaginase đang ngày càng được quan tâm bởi đã biết rõ về đặc tính sinh học, ít gây tác dụng phụ, ái lực cao với cơ chất và độc tính thấp. Bên cạnh đó sử dụng công nghệ tái tổ hợp còn giúp tăng năng suất sản lượng enzyme làm giảm chi phí sản xuất sản phẩm cuối cùng để chúng ta có có thể tiếp cận với nguyên liệu L-asparaginase tốt hơn trong điều trị. Chính vì thế đề tài “Biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ máu của enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi” được chúng tôi tiến hành thực hiện với mục tiêu.
Biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw. chrysanthemi có hoạt tính ức chế sinh trưởng với tế bào ung thư máu trong hệ biểu hiện E. coli với năng suất cao. Nội dung nghiên cứu đƣợc đặt ra 1) Thiết kế hệ biểu hiện gene aspg mã hóa L-asparaginase II từ Erw.
coli có hoạt tính enzyme cao; 2) Tối ưu điều kiện biểu hiện và thành phần môi trường để năng suất sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp đạt cao nhất; 3) Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp; nhận diện enzyme tái tổ hợp bằng MALDI_TOF luan an 3 4) Xác định động học enzyme, nhiệt độ, pH tối ưu, độ bền nhiệt, độ bền pH, ảnh hưởng của ion kim loại, chất hữu cơ chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme; 5) Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng của L-asparaginase tái tổ hợp trên một số dòng tế bào ung thư máu và ung thư rắn của người và chuột. 6) Đánh giá ảnh hưởng của L-asparaginase tái tổ hợp tới tế bào thường. Những đóng góp mới của luận án đạt đƣợc (1) Đã thiết kế, biểu hiện và thu nhận thành công trong E. coli L-asparaginase tái tổ hợp có hoạt độ cao đạt 354 IU/mg dựa trên trình tự gene gốc có mã số X12746 trên GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ Erw.
(2) L-asparaginase tái tổ hợp thu được có khả năng ức chế sinh trưởng của sáu dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu. Trong đó dòng tế bào ung thư tủy xương chuột SP2/0-Ag14, P3X63Ag8 và tế bào ung thư bạch huyết P388 giá trị IC50 đạt xấp xỉ 50 µg/ml. Nhạy cảm nhất với dòng tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp của người HL60 với IC 50 đạt 1,14 µg/ml mạnh hơn chế phẩm thương mại ONCOGINASE. Với dòng ung thư bạch cầu lympho người Jurkat enzyme cũng thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng tương đương với chế phẩm thương mại ONCOGINASE.
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về L-asparaginase 1. Định nghĩa L-asparaginase (EC.1; L-asparagine amino-hydrolase) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân L-asparagine thành aspartic acid (Hình1. L-asparaginase L-asparagine L-aspartic acid Hình 1.
Phản ứng xúc tác của enzyme L-asparaginase (Nguồn: Zuo et al., 2015) (Zuo et al., 2015) L-asparaginase có nguồn gốc từ sinh vật khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau dao động trong khoảng 140 – 150 kDa (Wikman et al. Khối lượng phân tử của L-asparaginase từ vi khuẩn E. coli là 133 – 144 kDa: được cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị có khối lượng phân tử khoảng 35,6 kDa (Marlborough et al., 1975), hằng số Michaelis-Menten Km= 1,25 x 10-5 điểm đẳng điện ở pH 4,9 (Wriston et al., 1973), L-asparaginase tinh sạch luôn có khoảng 2- 4% hoạt tính glutaminase và 5% hoạt tính D- asparaginase. 5-diazon-4-oxo-L- norvalin-chất tương tự cơ chất L-asparagine của enzyme là chất ức chế enzyme hoạt động (Jackson et al.
Phân loại Dựa trên tính chất hóa học và tinh thể, L-asparaginase được chia thành 3 họ: L-asparaginase vi khuẩn, L-asparaginase thực vật và L-asparaginase tương tự như L-asparaginase Rhizobium etli asparaginase. Enzyme được phân loại dựa vào số luan an 5 phản ứng xúc tác kể cả phản ứng trong quá trình sinh tổng hợp protein (Oinonen et al. L-asparaginase L-asparaginase từ L-asparaginase từ L-asparaginase từ thực vật Rhizobium etli vi khuẩn Aspartyglucosaminidase L-asparaginase Loại I Loại II thực vật Lysophospholipase Tiểu đơn vị Glu-Adt α Hình 1. Phân loại L-asparaginase (Nguồn: Borek et al., 2001) (Borek et al., 2001) Hai isozyme của L-asparaginase trong đó xúc tác thủy phân L-asparagine thành L-aspartate và ammonia, được sản xuất bởi E.
coli là: L-asparaginase I (EcAI) và L-asparaginase II (EcAII). Mặc dù hai enzyme này xúc tác cho một phản ứng giống nhau, nhưng chúng có thể được phân biệt bởi tính tan trong dung dịch amoni sulfat và độ nhạy cảm với nhiệt độ kích hoạt. EcAI có ở trong tế bào chất và xúc tác quá trình thủy phân cả L-asparagine và L-glutamine. Trong khi EcAII tồn tại trong điều kiện yếm khí trong khoang chu chất (periplasmic) của màng tế bào vi khuẩn và có tính đặc hiệu cao cho sự thủy phân của L-asparaginase (Cedar et al.
EcAII khác với EcAI do có dải pH tối ưu rộng hơn và EcAII có ái lực với asparagine (Km= 11, 5 µM) cao hơn nhiều EcAI (Km = 5 mM). EcAI thường dễ bị loại trong quá trình tinh sạch. Trình tự amino acid của L-asparaginase dạng I và luan an 6 dạng II về căn bản khác nhau nhưng hầu hết những trình tự amino acid quanh trung tâm hoạt động đều bảo thủ (Bonthron et al. Sự khác nhau ở cấu trúc 3D của L-asparaginase giải thích tại sao dạng I có ái lực với asparagine thấp hơn so với dạng II (Sanches et al.
Cấu trúc L-asparaginase Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu để làm sáng tỏ cấu trúc của L-asparaginase ở cấp độ phân tử. Thông thường, L-asparaginase tồn tại như một tetramer nhưng dạng hexamer, dimer và monomer cũng được tìm thấy khi phân lập ở những nguồn khác. Phần lớn L-asparaginase từ vi khuẩn tồn tại ở dạng tetramer. Cấu trúc của L-asparaginase từ E.
coli và Erwinia sp. đã được các nhà khoa học làm sáng tỏ, cả hai có cấu trúc ba chiều tương tự nhau. L-asparaginase từ Erw. carotovora bao gồm hai tetramer (ABCD và EFGH) tạo thành tám monomer giống hệt nhau (A đến H).
Mỗi monomer gồm 327 amino acid với 14 chuỗi alpha, 8 xoắn beta (Kozak et al., 2000) và hai domain, một domain lớn đầu N và một domain nhỏ đầu C (Aghaiypour et al. Vị trí hoạt động được đặt ở giữa hai monomer cạnh nhau (A và C; B và D). Các tetramer bao gồm bốn tiểu đơn vị giống hệt nhau. Toàn bộ phân tử được coi là một dimer của dimer (Jaskolski et al., 2001; Sanches et al.
Mỗi vị trí hoạt động được định hình bởi chỗ nối chuyển các amino acid trong hai monomer liền kề. Các amino acid sau tạo thành vị trí hoạt động: Thr15, Tyr29, Ser62, Glu63, Thr95, Asp 96, Ala120, và Lys168, trong đó chỉ có một amino acid Ser254 trong monomer liền kề (Ramya et al., 2011; Sanches et al. Thr15 và Thr95 chịu trách nhiệm cho các hoạt động xúc tác của enzyme. L-asparaginase tách từ E.
coli hoạt động như một tetramer của 4 tiểu đơn vị giống hệt nhau, gồm 222 đối xứng và có 4 vị trí hoạt động. Mỗi đơn vị có khối lượng phân tử khoảng 35,6 kDa, chứa hai miền α/β nối với nhau bởi một trình tự 191-212 (Swain et al. Cơ chế hoạt động của enzyme liên quan đến hai bộ ba. Bộ ba đầu tiên Thr12-Tyr25-Glu283 hoạt động trong bước acyl hóa tạo ra liên luan an 7 kết hóa trị với enzyme.
Bộ ba thứ hai, Thr89-Lys162-Asp90, hoạt động bằng cách kích hoạt một phân tử nước tạo ra các sản phẩm thông qua phản ứng với ái nhân thứ hai (Sanches et al. Thr12-Tyr25 Tiểu đơn vị A Tiểu đơn vị C Tiểu đơn vị B Tiểu đơn vị D Đầu C Đầu N A B Hình 1. Cấu trúc tetramer (A) và mononer (B) của L-asparaginase (Nguồn: Sanches, 2007) 1. Cơ chế phản ứng của L-asparaginase Cơ chế hoạt động của L-asparaginase được so sánh với lớp serine-protease, trung tâm hoạt động là bộ ba amino acid truyền thống Ser-His-Asp được gọi là bộ ba xúc tác.