Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu enzyme lasparaginase tái tổ hợp trong ức chế tế bào ung thư máu

• Tác giả: Nguyễn Thị Hiền Trang
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Tuyên
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu của enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về L-asparaginase
• 1.2. Cấu trúc L-asparaginase
• 1.3. Cơ chế phản ứng của L-asparaginase
• 1.4. Các nguồn của L-asparaginase
• 1.5. L-asparaginase trong điều trị ung thư máu
• 1.6. Tổng quan về bệnh ung thư máu
• 1.7. Cơ chế hoạt động của L-asparaginase trong điều trị ung thư
• 1.8. Ứng dụng L-asparaginase trong điều trị bệnh nhân bị ung thư bạch cầu
• 1.9. Các dạng asparaginase hiện tại sử dụng trong điều trị
• 1.10. Các vấn đề liên quan đến ứng dụng lâm sàng của asparaginase từ vi khuẩn
• 1.11. Mẫn cảm với asparaginase từ Escherichia coli và duy trì hiệu quả điều trị sau khi thay thế bằng Erwinia-asparaginase
• 1.12. Tình hình nghiên cứu L-asparaginase trên thế giới
• 1.13. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Các plasmid và mồi
• 2.4. Các chủng vi khuẩn và tế bào
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Hóa chất chính
• 2.7. Thiết bị thí nghiệm
• 2.8. Phương pháp nghiên cứu
• 2.8.1. Thiết kế plasmid biểu hiện
• 2.8.2. Nuôi biểu hiện
• 2.8.3. Xác định hoạt tính L-asparaginase
• 2.8.4. Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố đơn lẻ tới sinh tổng hợp enzyme
• 2.8.5. Tối ưu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
• 2.8.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2.8.7. Nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp MALDI-TOF
• 2.8.8. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme
• 2.8.9. Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với các dòng tế bào ung thư
• 2.8.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nghiên cứu biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi
• 3.1.1. Tối ưu trình tự gene
• 3.1.2. Thiết kế plasmid pE22aspg và biểu hiện trong E.
• 3.1.3. Thiết kế plasmid pE21maspg và biểu hiện trong E.
• 3.1.4. Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis và biểu hiện trong E.
• 3.1.5. Tối ưu điều kiện biểu hiện cho sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp
• 3.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
• 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiếp giống
• 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ampicillin trước khi cảm ứng
• 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường biểu hiện
• 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung
• 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng của ion khoáng bổ sung
• 3.1.12. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện rASPG tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
• 3.1.13. Đánh giá tính chất lý hóa của rASPG không có 6xHis
• 3.1.14. Tinh sạch rASPG từ E. coli/pE21maspg-nonhis
• 3.1.15. Nhận diện enzyme tái tổ hợp bằng phân tích khối phổ MALDI-TOF
• 3.1.16. Động học enzyme
• 3.1.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH phản ứng tới hoạt độ rASPG
• 3.1.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới độ bền của rASPG
• 3.1.19. Ảnh hưởng của EDTA và một số ion kim loại lên hoạt tính của rASPG
• 3.1.20. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG
• 3.1.21. Ảnh hưởng của Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG
• 3.1.22. Nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư của rASPG
• 3.1.22.1. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388
• 3.1.22.2. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8
• 3.1.22.3. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14
• 3.1.22.4. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562
• 3.1.22.5. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60
• 3.1.22.6. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư máu lympho của người Jurkat
• 3.1.22.7. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào ung thư thanh quản của người Hep2
• 3.1.22.8. Ảnh hưởng của rASPG tới tế bào thường
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Nghiên cứu lựa chọn hệ vector biểu hiện L-asparaginase
• 4.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sự sinh tổng hợp rASPG
• 4.3. Đánh giá tính chất của enzyme
• 4.4. Hoạt tính ức chế sinh trưởng của rASPG trên một số dòng tế bào ung thư
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHẦN PHỤ LỤC

I. Giới thiệu về enzyme L asparaginase

Enzyme L-asparaginase (EC.1; L-asparagine amino-hydrolase) là một enzyme quan trọng trong điều trị ung thư máu, đặc biệt là bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Enzyme này có khả năng phân hủy L-asparagine, một chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của tế bào ung thư. Tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào máu, không có khả năng tự tổng hợp L-asparagine do thiếu enzyme asparagine synthetase. Do đó, việc điều trị bằng L-asparaginase giúp làm giảm nồng độ L-asparagine trong cơ thể, từ đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt tế bào ung thư, mở ra hướng điều trị mới cho bệnh nhân ung thư máu.

II. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động của L asparaginase

L-asparaginase có nguồn gốc từ nhiều loại vi khuẩn, trong đó Erwinia chrysanthemi là một trong những nguồn chính. Enzyme này hoạt động bằng cách thủy phân L-asparagine thành aspartate và amoniac, làm giảm nồng độ L-asparagine trong máu. Cơ chế này đặc biệt hiệu quả đối với các tế bào ung thư máu, vì chúng phụ thuộc vào L-asparagine để sinh trưởng. Việc sử dụng L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi đã cho thấy khả năng điều trị tốt hơn cho những bệnh nhân có phản ứng dị ứng với enzyme từ E. coli. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme này có thể cải thiện tỷ lệ sống sót và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân.

III. Ứng dụng lâm sàng của L asparaginase trong điều trị ung thư máu

L-asparaginase đã trở thành một phần không thể thiếu trong phác đồ điều trị ung thư máu, đặc biệt là trong điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ tế bào ung thư trong cơ thể. Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng việc sử dụng L-asparaginase từ Erwinia chrysanthemi có thể mang lại hiệu quả điều trị cao hơn so với các chế phẩm khác. Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme này cũng gặp phải một số thách thức như phản ứng dị ứng và độc tính. Do đó, cần có các nghiên cứu tiếp theo để tối ưu hóa liều lượng và phương pháp sử dụng enzyme này trong điều trị.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư của rASPG

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi (rASPG) có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Các thử nghiệm trên tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388, tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8, và tế bào ung thư máu lympho của người Jurkat cho thấy enzyme này có tác dụng ức chế mạnh mẽ. Kết quả cho thấy rASPG có thể làm giảm tỷ lệ sống sót của tế bào ung thư, mở ra triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động và hiệu quả của enzyme này sẽ giúp cải thiện các phương pháp điều trị ung thư máu trong tương lai.