Nghiên cứu Sản Xuất Vắc Xin Phòng Bệnh Than do Bacillus anthracis Quy Mô Phòng Thí Nghiệm

Luận văn thạc sĩ tập trung nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm. Phân tích các yếu tố ảnh

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Bảo
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Trọng Tuyên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan nghiên cứu sản xuất vắc xin bệnh than

Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis là lĩnh vực trọng yếu trong y tế dự phòng. Bệnh than là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có thể gây tử vong cao ở người và động vật. Vắc xin hiện hành trên thế giới chủ yếu dựa trên nguyên lý giảm độc lực hoặc hấp phụ độc tố. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu nội địa hóa quy trình sản xuất nhằm đảm bảo nguồn cung, kiểm soát chất lượng và giảm chi phí là cần thiết. Công trình này tập trung vào quy mô phòng thí nghiệm, đặt nền móng cho sản xuất công nghiệp. Mục tiêu chính là tuyển chọn chủng vi khuẩn phù hợp, xây dựng quy trình lên men, tinh chế và đánh giá hiệu quả bảo hộ trên động vật thực nghiệm. Đây là bước đi chiến lược hướng tới an ninh sinh học quốc gia.

1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus anthracis

Bacillus anthracis là trực khuẩn gram dương, hiếu khí, có khả năng sinh bào tử. Bào tử có sức đề kháng cao trong môi trường, là yếu tố chính gây bệnh và cũng là kháng nguyên quan trọng trong vắc xin. Vi khuẩn tạo vỏ nhày (capsule) và độc tố than gồm 3 thành phần: EF, LF, PA. Yếu tố bảo vệ (PA) là kháng nguyên chủ đạo kích thích miễn dịch bảo hộ. Các plasmid pXO1 và pXO2 quyết định khả năng sinh độc tố và vỏ nhày, là đích để nghiên cứu giảm độc lực cho chủng vắc xin.

1.2. Các loại vắc xin bệnh than trên thế giới

Vắc xin bệnh than được phân thành hai nhóm chính: vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin hấp phụ. Vắc xin sống từ chủng Sterne (34F2) được dùng rộng rãi cho động vật, có ưu điểm kích đáp ứng miễn dịch mạnh nhưng còn lo ngại về an toàn. Vắc xin hấp phụ từ chủng V770-NP1-R của Hoa Kỳ được cấp phép cho người, dựa trên thành phần PA đã tinh chế, có tính an toàn cao hơn. Các nước như Liên bang Nga, Trung Quốc cũng có sản phẩm bào tử sống. Sự đa dạng này phản ánh nhu cầu về vắc xin vừa an toàn vừa hiệu quả bền vững.

II. Thách thức trong sản xuất vắc xin bệnh than

Sản xuất vắc xin bệnh than đối mặt với nhiều thách thức kỹ thuật và an toàn sinh học. Chủng vi khuẩn sử dụng phải được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo tính giảm độc lực ổn định qua các thế hệ. Quy trình lên men đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt để vi khuẩn phát triển tốt và sinh bào tử hoặc kháng nguyên đạt hiệu suất cao. Bào tử của B. anthracis có sức chịu đựng cao, gây khó khăn trong khâu khử khuẩn và an toàn lao động. Việc tinh chế các thành phần kháng nguyên như PA đòi hỏi công nghệ cao để loại bỏ tạp chất và độc tố còn sót lại. Đánh giá hiệu quả trên động vật thực nghiệm tốn kém thời gian và nguồn lực. Những rào cản này đòi hỏi nghiên cứu tỉ mỉ và đầu tư trang thiết bị chuyên dụng.

2.1. Vấn đề về độc lực và tính an toàn của chủng sản xuất

Chủng sản xuất vắc xin sống phải mất khả năng gây bệnh nhưng vẫn duy trì tính kháng nguyên. Phương pháp cổ điển dựa trên việc loại bỏ plasmid pXO2 (mất vỏ nhày) như ở chủng Sterne. Tuy nhiên, nguy cơ đột biến hồi phục độc lực hay nhiễm chéo vẫn là mối quan ngại. Đối với vắc xin hấp phụ, chủng sản xuất cần có năng suất sinh PA cao và ổn định. Việc tuyển chọn và kiểm định chủng đòi hỏi các xét nghiệm phân tử và sinh học phức tạp để đảm bảo an toàn tuyệt đối trước khi đưa vào sản xuất quy mô lớn.

2.2. Kỹ thuật lên men và tinh chế kháng nguyên

Quy trình lên men ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng bào tử hoặc kháng nguyên. Điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, oxy, nồng độ dinh dưỡng phải được tối ưu hóa. Đối với vắc xin bào tử, quá trình sinh bào tử cần được kiểm soát. Với vắc xin hấp phụ, mục tiêu là tối đa hóa sản lượng PA tiết ra môi trường. Sau lên men, khâu tinh chế là then chốt. Các phương pháp sắc ký (ion exchange, gel filtration) được áp dụng để cô lập PA. Quy trình phải loại bỏ endotoxin và tạp chất, đảm bảo độ tinh khiết và an toàn cho sản phẩm cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm nhiều giai đoạn tuần tự. Đầu tiên là tuyển chọn và kiểm định chủng vi khuẩn có tiềm năng. Tiếp theo là xây dựng và tối ưu quy trình lên men trong bình thí nghiệm. Các thông số như thời gian, thành phần môi trường, tốc độ khuấy trộn được khảo sát kỹ lưỡng. Sản phẩm lên men được thu hoạch và xử lý. Đối với vắc xin bào tử, bào tử được thu, tinh chế và khử tạp. Đối với vắc xin hấp phụ, PA được tinh chế từ dịch lên men. Cuối cùng, sản phẩm được bào chế thành dạng vắc xin hoàn chỉnh và đánh giá tính an toàn, sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm (chuột, thỏ). Quy trình này đặt nền tảng vững chắc cho việc chuyển giao công nghệ lên quy mô pilot.

3.1. Tuyển chọn chủng và tối ưu hóa quy trình lên men

Tuyển chọn chủng bắt đầu bằng việc thu thập các chủng B. anthracis từ ngân hàng chủng hoặc từ dịch tễ. Các chủng được đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa, và quan trọng nhất là tính giảm độc lực trên động vật. Chủng tiềm năng được kiểm tra bằng PCR để xác định sự hiện diện của plasmid. Quy trình lên men được tối ưu bằng phương pháp thử nghiệm từng yếu tố hoặc thiết kế thực nghiệm. Môi trường lỏng và đặc được thử nghiệm, các yếu tố như nguồn carbon, nitrogen, ion kim loại được điều chỉnh để đạt sinh khối và sản lượng bào tử/PA cao nhất.

3.2. Kỹ thuật tinh chế và đánh giá sản phẩm vắc xin

Đối với vắc xin bào tử, bào tử được thu bằng ly tâm, rửa nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ tế bào dinh dưỡng và mảnh vỡ. Bào tử sau đó được đếm, kiểm tra độ tinh khiết và bảo quản. Đối với vắc xin hấp phụ, dịch lên men được lọc, siêu lọc để cô đặc, sau đó tinh chế bằng sắc ký. Sản phẩm PA được định lượng bằng phương pháp Bradford, kiểm tra độ tinh khiết bằng SDS-PAGE. Thành phẩm vắc xin được trộn với tá dược (như nhôm hydroxide) và đánh giá an toàn qua LD50, tính sinh miễn dịch qua kháng thể huyết thanh trên động vật thí nghiệm.

IV. Kết luận và triển vọng ứng dụng nghiên cứu

Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình sản xuất vắc xin bệnh than ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình tuyển chọn chủng, lên men, tinh chế và bào chế vắc xin được xây dựng và kiểm chứng. Các sản phẩm vắc xin thử nghiệm cho thấy tính an toàn và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên động vật thực nghiệm. Đây là kết quả quan trọng, chứng minh tính khả thi của việc nội địa hóa công nghệ sản xuất. Nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc để phát triển lên quy mô pilot và tiến tới sản xuất thương mại. Ứng dụng của vắc xin này sẽ góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, phòng chống dịch bệnh có chủ đích và đảm bảo an ninh sinh học quốc gia.

4.1. Giá trị khoa học và thực tiễn của công trình

Về mặt khoa học, công trình đã làm sáng tỏ nhiều đặc điểm sinh học của các chủng B. anthracis trong nước, tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất vắc xin. Về thực tiễn, nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu và quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh, có thể áp dụng tại các cơ sở sản xuất vắc xin trong nước. Việc chủ động nguồn vắc xin giúp giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, tiết kiệm ngoại tệ và đáp ứng nhanh trong tình huống khẩn cấp. Kết quả cũng là nguồn tài liệu quý giá cho đào tạo và nghiên cứu sau này.

4.2. Hướng phát triển và chuyển giao công nghệ

Bước tiếp theo là nhân rộng quy trình lên quy mô pilot để đánh giá tính ổn định và hiệu quả kinh tế. Cần hoàn thiện quy trình tinh chế để đạt tiêu chuẩn dược phẩm. Các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế miễn dịch, thử nghiệm lâm sàng trên người (nếu có) sẽ là hướng đi dài hạn. Chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất vắc xin là mục tiêu cuối cùng. Sự hợp tác giữa viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp sẽ là chìa khóa để đưa sản phẩm từ phòng thí nghiệm ra thị trường, phục vụ công tác phòng chống dịch bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than (Anthrax) do trực khuẩn Bacillus anthracis gây ra là một nhiệm vụ mang tính chiến lược sinh học, y tế dự phòng và an ninh quốc phòng trọng yếu. Bacillus anthracis được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 (Risk Group 3) với khả năng tồn tại ngoại cảnh hàng thập kỷ nhờ cấu trúc nội bào tử kháng nhiệt, đồng thời tiềm ẩn nguy cơ cao bị lạm dụng làm vũ khí khủng bố sinh học (Bioterrorism). Tại Việt Nam, dịch than lưu hành rải rác nhưng dai dẳng ở các tỉnh miền núi phía Bắc (như Điện Biên, Hà Giang, Sơn La, Lai Châu), chủ yếu ở thể da (>95% tổng số ca mắc) và có nguy cơ lan rộng sang thể tiêu hóa hoặc hô hấp với tỷ lệ tử vong từ 50% đến trên 80-90% nếu không được can thiệp kịp thời.

Mặc dù vắc xin thú y đã được triển khai, Việt Nam hoàn toàn chưa tự chủ được công nghệ sản xuất vắc xin phòng bệnh than dùng cho người, phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn viện trợ hoặc nhập khẩu vốn gặp nhiều rào cản pháp lý và chuỗi cung ứng quốc tế. Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở việc chưa có một đánh giá hệ thống và đối đầu trực tiếp (head-to-head comparison) giữa hai trường phái vắc xin kinh điển: vắc xin sống giảm độc lực toàn tế bào (TTB - Whole-cell spore vaccine) và vắc xin tiểu phần hấp phụ (VHP - Adsorbed Protective Antigen vaccine) dựa trên chủng bản địa và chủng dự tuyển trong điều kiện sản xuất phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Bảo đặt ra các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học cụ thể:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Chủng vi khuẩn than dự tuyển B. anthracis BaVCM1167 có đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn sinh học phân tử (mang plasmid pXO1 chứa gene pagA, khuyết thiếu hoàn toàn plasmid pXO2 chứa chùm gene capA, capB, capC) để đảm bảo an toàn tuyệt đối và hiệu suất biểu hiện kháng nguyên bảo vệ (PA83) ổn định hay không?
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Quy trình công nghệ lên men, bán tinh sạch bằng tủa phân đoạn ethanol, sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose và rây phân tử Biogel P100 có tối ưu hóa được hoạt tính miễn dịch của kháng nguyên PA83 cho vắc xin hấp phụ (VHP) hay không?
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Sự khác biệt về mức độ an toàn phi đặc hiệu, động học hiệu giá kháng thể trung bình nhân (Geometric Mean Titres - GMT) kháng PA83 và hiệu lực bảo vệ sinh mạng (protective efficacy) trên mô hình động vật cảm nhiễm (chuột nhắt trắng, chuột lang, thỏ) giữa vắc xin VHP và vắc xin TTB là gì?

Khung lý thuyết của nghiên cứu tích hợp mô hình độc tố nhị phân A/B (Binary Toxin Model), học thuyết giảm độc tính tự nhiên do khuyết plasmid pXO2 (Plasmid Curing & Attenuation Theory của Sterne và Pasteur), cùng nguyên lý miễn dịch dịch thể trung hòa độc lực (Antibody-mediated Toxin Neutralization). Nghiên cứu đã xác lập quy trình công nghệ tạo thành công hai ứng viên vắc xin đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm nghiêm ngặt, mở đường cho việc chủ động sản xuất sinh phẩm dự phòng bệnh than cấp quốc gia.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu bệnh than ghi nhận các dấu mốc dịch tễ học và miễn dịch học sâu rộng. Theo ước tính dịch tễ của Glassman, thế giới từng ghi nhận hàng chục nghìn ca bệnh than hàng năm tại các vùng nông nghiệp và công nghiệp chế biến thuộc da, len dạ. Các thảm họa dịch tễ điển hình như vụ dịch tại Zimbabwe (1979-1985) làm hơn 10.000 người mắc, hay tai nạn phát tán bào tử tại Sverdlovsk (Liên Xô, 1979) làm 68 người tử vong do thể phổi cấp tính đã chứng minh độc tính hủy diệt của trực khuẩn này (Meselson et al., 1994). Về mặt sinh thái học vi sinh vật, Van Ness (1971) đã chứng minh giả thuyết về sự tồn lưu của bào tử than trong các vùng đất đen giàu hữu cơ và canxi (chernozem, mollisol) với pH > 6.0, nơi nhiệt độ môi trường vượt quá 15,5°C tạo thành các ổ dịch lưu niên tự nhiên.

Trên bình diện công nghệ vắc xin toàn cầu, tồn tại cuộc tranh luận kéo dài giữa hai trường phái tiếp cận:

• Trường phái vắc xin sống giảm độc lực (Live Attenuated Spore Vaccine): Tiêu biểu là chủng Sterne 34F2 (chế tạo bởi Max Sterne, 1937) và chủng STI-1 tại Liên Xô / Nga hoặc chủng 16R tại Trung Quốc. Trường phái này dựa trên cơ chế trực khuẩn mang kiểu hình $\text{pXO1}^+ / \text{pXO2}^-$, không sinh vỏ poly-D-glutamic acid nên bị bạch cầu tiêu diệt nhanh chóng nhưng vẫn phóng thích đủ kháng nguyên kích thích miễn dịch toàn diện. Ưu điểm nổi bật là quy trình nuôi cấy đơn giản, giá thành thấp, kích thích đáp ứng miễn dịch nhanh chỉ sau 1–2 liều qua đường rạch da hoặc tiêm dưới da. Tuy nhiên, nhược điểm là độc tính tồn dư (residual virulence), nguy cơ phản ứng tại chỗ và toàn thân cao, khó loại bỏ triệt để tạp chất ngoại độc tố.
• Trường phái vắc xin tiểu phần hấp phụ (Acellular / Subunit Adsorbed Vaccine): Đại diện là vắc xin AVA (BioThrax, Hoa Kỳ - chủng V770-NP1-R) và AVP (Vương quốc Anh - chủng Sterne 34F kết tủa phèn nhôm). Các vắc xin này tập trung tinh sạch kháng nguyên bảo vệ PA83 (Protective Antigen, 83 kDa), loại bỏ hoàn toàn yếu tố gây phù (EF - Edema Factor, 89 kDa) và yếu tố gây chết (LF - Lethal Factor, 90 kDa), hấp phụ trên tá chất nhôm hydroxide hoặc nhôm phosphate. Ưu điểm là độ an toàn vượt trội, không có nguy cơ hồi phục độc lực, ít phản ứng phụ, nhưng đòi hỏi công nghệ tinh sạch phức tạp và phác đồ tiêm nhiều mũi nhắc lại (phác đồ 3–6 liều trong 6–18 tháng).

Luận án định vị chính xác tại điểm giao thoa công nghệ này: Lần đầu tiên tại Việt Nam, một nghiên cứu thực nghiệm đồng thời thiết lập quy trình chế tạo cả hai dạng vắc xin (VHP từ kháng nguyên PA tinh sạch và TTB từ bào tử chủng BaVCM1167 đông khô), so sánh trực tiếp với các tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Dược điển quốc tế, giải quyết triệt để sự thiếu hụt sinh phẩm bảo vệ cho các lực lượng nguy cơ cao và đơn vị quân đội làm nhiệm vụ tại địa bàn trọng điểm.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án củng cố và phát triển sâu sắc mô hình tương tác phân tử của hệ độc tố ba thành phần (Tripartite Exotoxin Paradigm) được khởi xướng bởi Smith & Stoner (1967) và Pezard et al. Cụ thể:

1. Mở rộng lý thuyết tương tác cấu trúc PA83: PA hoàn chỉnh (83 kDa, 735 amino acid) đóng vai trò là "chìa khóa" vận chuyển trung tâm. Sau khi bị protease nội bào (furin) cắt đoạn 20 kDa ở vị trí chuỗi Arg164-Lys165-Lys166-Arg167, phần còn lại 63 kDa liên kết tạo vòng heptamer $(\text{PA63})_7$. Vòng heptamer này chèn vào màng tế bào tạo kênh dẫn truyền, cho phép EF (calmodulin-dependent adenylate cyclase) chuyển hóa ATP thành cAMP gây rối loạn tính thấm tế bào, và LF (zinc-metalloprotease) cắt đầu N của protein kinase kinase (MAPKK 1 và 2), vô hiệu hóa dòng truyền tín hiệu MAPK và kích hoạt quá trình chết tế bào đại thực bào theo chương trình (apoptosis).
2. Lý thuyết tối ưu hóa biểu hiện kháng nguyên đơn phần: Luận án chứng minh rằng việc sử dụng chủng mất plasmid pXO2 loại bỏ hoàn toàn vỏ bao poly-D-glutamic acid, giúp kháng nguyên PA83 được giải phóng tối đa vào môi trường ngoại bào mà không bị phong bế hay tương tác bất lợi với các chuỗi polypeptide của nang vi khuẩn.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết nền tảng sinh học:

• Lý thuyết di truyền học plasmid vi khuẩn: Nhận diện sự hiện diện của locus pagA (2319 bp) trên pXO1 (182 kb) và sự tiêu biến của operon capBCADE trên pXO2 (93 kb) bằng hệ mồi PCR chuyên biệt.
• Lý thuyết hóa sinh tách chiết protein: Phối hợp cân bằng hóa lý giữa hằng số điện ly tá chất và điểm đẳng điện của PA83 qua sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose kết hợp rây phân tử gel Biogel P100.
• Lý thuyết miễn dịch học bảo vệ động vật thực nghiệm: Đánh giá hiệu lực trung hòa qua động học chuẩn độ kháng thể đặc hiệu kháng PA83 (ELISA) liên kết với tỷ lệ sống sót trước liều thử thách chí mạng $\text{LD}_{100}$ của chủng B. anthracis độc lực hoàn chỉnh 4NS.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ triết lý thực nghiệm khách quan (Positivist Paradigm), sử dụng thiết kế thực nghiệm song song có đối chứng (Controlled Parallel Experimental Design). Đối tượng nghiên cứu bao gồm:

• Chủng sản xuất vắc xin: Chủng B. anthracis BaVCM1167 được tuyển chọn kỹ lưỡng, xác minh kiểu hình và kiểu gene.
• Chủng thử thách độc lực cao: Chủng B. anthracis 4NS phân lập tại Việt Nam, mang đầy đủ hai plasmid pXO1 và pXO2, có giá trị $\text{LD}_{50}$ trên chuột lang được chuẩn hóa chính xác.
• Mô hình động vật thí nghiệm:
  • Thỏ New Zealand thuần chủng (trọng lượng 2,0–2,5 kg) dùng để đánh giá tính an toàn sinh nhiệt (chất gây sốt) và động học tạo kháng thể.
  • Chuột lang khỏe mạnh (trọng lượng 300–350 g) dùng để đánh giá hiệu lực bảo vệ sinh mạng trước liều thử thách độc lực.
  • Chuột nhắt trắng dòng Swiss/Balb/c (18–20 g) dùng để xác định độc tính cấp, liều chết $\text{LD}{50}$ và $\text{LD}{100}$.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Định danh sinh học phân tử: Sử dụng hệ thống kit API 50CHB/E kết hợp phản ứng PCR đa mồi khuếch đại gene nhiễm sắc thể Ba813, gene kháng nguyên pagA trên pXO1, và các gene tổng hợp vỏ capA, capB, capC trên pXO2. Trình tự vùng gene pagA được giải mã và so sánh bằng phần mềm sinh học phân tử MEGA5.
2. Công nghệ sản xuất vắc xin hấp phụ (VHP): Nuôi cấy lên men chủng BaVCM1167 trong môi trường chuyên biệt dạng lỏng ở 37°C trong điều kiện kỵ khí/vi hiếu khí nhằm tối ưu hóa lượng PA83 tiết ra. Dịch nuôi cấy được ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn, kết tủa phân đoạn bằng cồn lạnh (ethanol), sau đó tinh sạch qua hệ thống sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose và rây phân tử Biogel P100. Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE 12,6% và xác nhận tính đặc hiệu bằng Western Blot lai màng PVDF với kháng thể đơn dòng kháng PA và kháng Thioredoxin. PA tinh chế được phối trộn hấp phụ trên tá chất nhôm.
3. Công nghệ sản xuất vắc xin toàn tế bào (TTB): Nuôi cấy chủng BaVCM1167 trên môi trường đặc tạo điều kiện hình thành bào tử tối đa (>90% bào tử tự do). Thu hoạch bào tử, tinh chế qua các chu kỳ rửa ly tâm, phối trộn dung dịch bảo quản và tiến hành đông khô theo chu trình nhiệt độ âm sâu có kiểm soát tại Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt.
4. Giao thức kiểm định an toàn và hiệu lực:
   • Đánh giá chất gây sốt trên thỏ theo Dược điển Việt Nam.
   • Thử nghiệm độc tính phi đặc hiệu trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm phúc mạc (IP).
   • Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa anti-PA83 bằng kỹ thuật ELISA qua các mốc thời gian: tuần 0 (trước tiêm), tuần 6, tuần 8 và tuần 10.
   • Thử nghiệm công kích độc lực (Challenge test): Tiêm phúc mạc liều thử thách chủng 4NS độc lực cao trên các lô chuột lang đã được gây miễn dịch bằng vắc xin VHP và TTB, theo dõi tỷ lệ sống sót trong 14 ngày.

Data và phân tích

Dữ liệu định lượng được phân tích thống kê sinh học chuyên sâu:

• Nồng độ kháng thể kháng PA83 được quy đổi và tính toán theo giá trị hiệu giá trung bình nhân (Geometric Mean Titres - GMT) kèm khoảng tin cậy 95% (95% CI) và độ lệch chuẩn (SD).
• So sánh sự khác biệt giữa các lô can thiệp và các mốc thời gian bằng kiểm định phi tham số hoặc Student's t-test cặp đôi (paired t-test) và phân tích phương sai ANOVA một chiều/hai chiều.
• Giá trị $\text{LD}_{50}$ được tính toán chính xác theo phương pháp kinh điển Reed-Muench hoặc Karber.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác lập chính xác đặc tính di truyền chủng sản xuất BaVCM1167: Kết quả điện di sản phẩm PCR khẳng định chủng BaVCM1167 mang đoạn gene Ba813 đặc trưng của loài B. anthracis và gene pagA (kích thước ~2,3 kb), nhưng hoàn toàn âm tính với các gene capA, capB, capC. Điều này chứng minh chủng đã loại bỏ bền vững plasmid pXO2 ($\text{pXO1}^+ / \text{pXO2}^-$), loại bỏ hoàn toàn khả năng tổng hợp vỏ nhày gây bệnh trong cơ thể vật chủ.
2. Độ tương đồng di truyền tuyệt đối của gene pagA bản địa: Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng pagA của chủng BaVCM1167 với 3 chủng B. anthracis độc lực phân lập tại các ổ dịch thực địa ở Việt Nam thông qua phần mềm MEGA5 cho thấy độ tương đồng đạt từ 99,8% đến 100%, bảo toàn các epitope kháng nguyên quan trọng ở vùng Domain 4 chịu trách nhiệm gắn kết thụ thể tế bào.
3. Đạt độ tinh sạch cao của protein kháng nguyên bảo vệ PA83: Trên điện di SDS-PAGE 12,6%, phân đoạn protein PA sau sắc ký DEAE-cellulose và Biogel P100 cho một vạch sắc gọn duy nhất tại vị trí 83 kDa. Phản ứng Western Blot trên màng lai PVDF xác nhận phản ứng gắn kết đặc hiệu tuyệt đối với kháng thể kháng PA, không bị nhiễm tạp chất protein gây độc LF hay EF.
4. Tính an toàn sinh học tuyệt đối trên động vật thử nghiệm: Vắc xin VHP và TTB thành phẩm đều đạt tiêu chuẩn an toàn vô trùng, không chứa tạp khuẩn, không gây sốt trên thỏ (tổng nhiệt độ tăng của đàn thỏ thử nghiệm luôn nằm trong ngưỡng an toàn cho phép của Dược điển), không làm chuột nhắt trắng giảm trọng lượng hay tử vong ở liều kiểm tra an toàn phi đặc hiệu.
5. Động học sinh kháng thể và hiệu lực bảo vệ vượt trội:
   • Trước tiêm phòng (tuần 0), hiệu giá kháng thể anti-PA83 ở cả hai lô thỏ đều ở mức nền âm tính.
   • Tại tuần thứ 6, 8 và 10, hiệu giá GMT kháng PA83 ở cả hai lô tiêm vắc xin VHP và TTB đều tăng mạnh có ý nghĩa thống kê ($p < 0,001$). Vắc xin VHP kích thích tạo hiệu giá GMT cao và bền vững qua các tuần, trong khi vắc xin TTB tạo đáp ứng kháng thể sớm.
   • Thử nghiệm công kích độc lực bằng chủng than 4NS chứng minh vắc xin VHP và TTB bảo vệ sống sót 100% số chuột lang thí nghiệm, trong khi 100% chuột lang ở lô đối chứng (không tiêm vắc xin) tử vong trong vòng 24–72 giờ với bệnh cảnh nhiễm khuẩn huyết và hoại tử nội tạng điển hình.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết sinh học: Công trình cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc về khả năng tạo miễn dịch bảo vệ đầy đủ của kháng nguyên PA83 đơn thuần khi được hấp phụ trên tá chất khoáng, củng cố học thuyết miễn dịch trung hòa độc tố mà không nhất thiết phải cần đến sự hiện diện của toàn bộ thành phần tế bào vi khuẩn.
• Về mặt công nghệ sinh học: Thiết lập hoàn chỉnh sơ đồ công nghệ từ nuôi cấy, phân tách phân đoạn cồn lạnh, đến sắc ký làm sạch hai bước có thể mở rộng (scale-up) lên quy mô pilot và công nghiệp tại các nhà máy vắc xin sinh phẩm trong nước.
• Về mặt thực tiễn y tế và an ninh y tế: Giúp hệ thống y tế dự phòng và quân y Việt Nam hoàn toàn chủ động ứng phó trong các tình huống bùng phát dịch than tự nhiên ở các vùng biên giới, vùng sâu vùng xa, cũng như chuẩn bị sẵn sàng phương án phòng vệ sinh học quốc gia trước các hiểm họa khủng bố sinh học.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả có tính đột phá, công trình vẫn tồn tại một số giới hạn nghiên cứu cần được tiếp tục hoàn thiện:

• Quy mô sản xuất: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (laboratory scale) với các mẻ lên men dung tích nhỏ, cần được tối ưu hóa các thông số kỹ thuật động học dòng chảy và chuyển khối oxy ở quy mô nồi lên men công nghiệp (bioreactor 100–500 lít).
• Mô hình linh trưởng: Hiệu lực bảo vệ mới được khảo sát trên động vật gặm nhấm (chuột nhắt, chuột lang, thỏ); chưa được thử nghiệm thử thách khí dung (aerosol challenge) trên mô hình linh trưởng không phải người (non-human primates) để đánh giá toàn diện khả năng bảo vệ thể phổi.
• Thời gian theo dõi độ bền miễn dịch: Động học kháng thể mới được theo dõi đến tuần thứ 10; cần các nghiên cứu dài hạn 12–24 tháng để xác định chính xác thời điểm cần tiêm mũi nhắc lại (booster dose).

Chương trình nghiên cứu tiếp nối cần tập trung:

1. Phát triển công nghệ biểu hiện PA83 tái tổ hợp (recombinant PA - rPA) trên hệ thống vi khuẩn Bacillus subtilis hoặc nấm men Pichia pastoris nhằm nâng cao hiệu suất và loại bỏ hoàn toàn các nguy cơ tiềm ẩn từ chủng gốc.
2. Thử nghiệm các hệ tá chất tiên tiến mới (như nano-adjuvant, tá chất kích thích thụ thể TLR) nhằm chuyển đổi đường tiêm bắp/dưới da sang dạng vắc xin xịt mũi hoặc hạt vi bao khô khí dung qua đường hô hấp.
3. Đánh giá tính ổn định nhiệt và hạn dùng của chế phẩm đông khô ở điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng phục vụ tác chiến dã ngoại.

Tác động và ảnh hưởng

• Giá trị học thuật: Kết quả luận án đóng góp nguồn dữ liệu phân tử và miễn dịch học quý giá cho hệ thống cơ sở dữ liệu vi sinh vật học Việt Nam, tạo tiền đề cho các công bố quốc tế về dịch tễ phân tử và công nghệ vắc xin phòng chống vi khuẩn nguy hiểm nhóm 3.
• Chuyển giao công nghệ sinh học: Quy trình đông khô vắc xin vi khuẩn than sống giảm độc lực đã được thử nghiệm thành công tại Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt, khẳng định tính khả thi của việc tiếp nhận và vận hành công nghệ sản xuất vắc xin than tại các cơ sở đạt chuẩn GMP trong nước.
• An ninh y tế cộng đồng: Cung cấp luận cứ khoa học để Bộ Y tế và Cục Quân y xây dựng phác đồ dự phòng phối hợp vắc xin và kháng sinh (như Ciprofloxacin, Doxycycline) cho các đối tượng phơi nhiễm cao, giảm thiểu tối đa nguy cơ tử vong và chi phí y tế phát sinh do dịch bệnh than.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và nhà khoa học chuyên ngành Vi sinh - Miễn dịch: Tiếp cận hệ phương pháp chuẩn hóa về định danh phân tử plasmid vi khuẩn than, quy trình tinh sạch kháng nguyên ngoại bào và thiết kế thử nghiệm thử thách độc lực nghiêm ngặt.
• Các nhà hoạch định chiến lược Y tế và Quốc phòng: Có trong tay cơ sở khoa học xác thực để đề xuất đầu tư dây chuyền sản xuất vắc xin phòng chống tác nhân sinh học quốc gia.
• Các đơn vị quân đội đóng quân tại địa bàn Tây Bắc: Lực lượng cán bộ, chiến sĩ và nhân viên quân y được bảo vệ chủ động khi thực hiện nhiệm vụ tại các vùng lưu hành dịch than tự nhiên.
• Cộng đồng dân cư vùng đồng bào dân tộc thiểu số miền núi: Giảm thiểu triệt để nguy cơ bùng phát dịch than thể da và thể tiêu hóa từ việc mổ thịt, tiếp xúc gia súc chết bệnh.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Luận án mở rộng trực tiếp lý thuyết độc tố nhị phân (Binary Toxin Paradigm) của Smith & Stoner (1967) và Pezard et al., chứng minh rằng chỉ cần sử dụng đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA83 thuần khiết được hấp phụ trên nhôm hydroxit là đủ để kích hoạt hệ miễn dịch sinh kháng thể dịch thể trung hòa hiệu lực cao. Kháng thể này ức chế hoàn toàn khả năng gắn của PA vào thụ thể màng tế bào vật chủ, từ đó triệt tiêu đường xâm nhập của hai enzym độc lực EF và LF, mang lại hiệu lực bảo vệ sinh mạng 100% trước chủng vi khuẩn than độc lực hoàn chỉnh mà không cần sự hiện diện của các thành phần kháng nguyên vỏ hay độc tố phụ trợ khác.

2. Sự đổi mới về phương pháp luận của nghiên cứu khi so sánh với các công trình quốc tế?

So với quy trình sản xuất vắc xin AVA của Hoa Kỳ (sử dụng chủng V770-NP1-R) hay vắc xin AVP của Anh (sử dụng chủng Sterne 34F kết tủa thô bằng phèn), nghiên cứu này đã tích hợp quy trình làm sạch hai bước tiên tiến: tủa phân đoạn cồn lạnh kết hợp sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose và rây phân tử Biogel P100. Phương pháp này cho phép loại bỏ triệt để các mảnh vỡ tế bào và các ngoại enzym không mong muốn, tạo ra chế phẩm PA83 có độ tinh sạch cao, được kiểm chứng chặt chẽ bằng Western Blot với kháng thể đặc hiệu trên màng PVDF. Đồng thời, nghiên cứu thực hiện đối đầu song song (head-to-head) với vắc xin bào tử đông khô TTB trên cùng một mô hình động vật cảm nhiễm chuẩn hóa.

3. Phát hiện bất ngờ và có ý nghĩa thực nghiệm lớn nhất là gì?

Phát hiện thực nghiệm quan trọng nhất là mức độ bảo toàn trình tự nucleotide của gene pagA đạt 100% giữa chủng dự tuyển BaVCM1167 và các chủng B. anthracis hoang dại độc lực cao phân lập tại các ổ dịch thực tế ở miền núi phía Bắc Việt Nam. Điều này bác bỏ các lo ngại trước đây về nguy cơ trôi dạt kháng nguyên (antigenic drift) làm giảm hiệu lực của vắc xin tiểu phần, chứng minh rằng vắc xin VHP sản xuất từ chủng dự tuyển hoàn toàn có khả năng bảo vệ chéo tuyệt đối trước mọi chủng than đang lưu hành tại Việt Nam.

4. Luận án có cung cấp giao thức tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số kỹ thuật có thể tái lập hoàn toàn: nồng độ cơ chất môi trường lên men, điều kiện nhiệt độ 37°C và kiểm soát khí trường kỵ khí/vi hiếu khí; nồng độ cồn lạnh trong tủa phân đoạn; thông số đệm ly giải và rửa cột sắc ký DEAE / Biogel P100; công thức tá chất hấp phụ phèn nhôm; cùng chu trình đông khô bào tử với bảng kiểm soát áp suất và nhiệt độ âm sâu theo chuẩn GMP.

5. Chương trình nghị sự nghiên cứu 10 năm (10-Year Research Agenda) được định hình ra sao?

Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo bao gồm: (1) Nâng cấp công nghệ sản xuất PA83 tái tổ hợp trên vi khuẩn B. subtilis nhằm loại bỏ việc nuôi cấy mầm bệnh sống; (2) Phát triển dạng bào chế khí dung vi hạt phân phối qua đường niêm mạc hô hấp; (3) Hoàn thiện hồ sơ tiền lâm sàng mở rộng trên linh trưởng; (4) Triển khai thử nghiệm lâm sàng Giai đoạn 1 và 2 trên người tình nguyện khỏe mạnh thuộc nhóm nguy cơ cao; (5) Xây dựng kho dự trữ vắc xin phòng thủ sinh học quốc gia (National Biodefense Stockpile).

Kết luận

1. Nghiên cứu đã tuyển chọn, định danh và xác lập thành công ngân hàng chủng vi khuẩn than Bacillus anthracis BaVCM1167 mang kiểu gene $\text{pXO1}^+ / \text{pXO2}^-$, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn sinh học phân tử khắt khe để sản xuất vắc xin phòng bệnh than an toàn.
2. Thiết lập thành công quy trình công nghệ sản xuất hai dạng vắc xin ở quy mô phòng thí nghiệm: vắc xin hấp phụ VHP (dựa trên kháng nguyên PA83 tinh chế) và vắc xin toàn tế bào TTB (dạng bào tử sống đông khô).
3. Khẳng định tính an toàn phi đặc hiệu tuyệt đối và khả năng không sinh nhiệt của cả hai ứng viên vắc xin trên mô hình chuột nhắt trắng và thỏ New Zealand theo đúng tiêu chuẩn Dược điển.
4. Chứng minh động học sinh kháng thể trung hòa anti-PA83 tăng cao bền vững (xác định bằng ELISA) và hiệu lực bảo vệ sinh mạng đạt 100% trên chuột lang trước liều thử thách công kích của chủng vi khuẩn than độc lực cao 4NS.
5. Mở ra hướng đi tự chủ hoàn toàn công nghệ sinh phẩm y học dự phòng và an ninh quốc phòng, tạo nền tảng vững chắc để chuyển giao sản xuất quy mô công nghiệp phục vụ phòng chống dịch bệnh than tại Việt Nam và sẵn sàng ứng phó với các nguy cơ khủng bố sinh học trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh than (anthrax) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do nhiễm vi khuẩn than Bacillus anthracis. Vi khuẩn than thường gây bệnh cho các loại động vật móng guốc, ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da, lông. Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh cảnh lâm sàng và đường lây đa dạng, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngoài môi trường. Vi khuẩn than hay được sử dụng làm vũ khí sinh học vi: giá thành sản xuất rẻ và dễ sản xuất và tàng trữ.

anthracis thường được một số nước sử dụng như loại vũ khí bí mật trong phòng chống và đánh trả, luôn có nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [5]. Phòng chống bệnh than luôn là vấn đề mang tính cấp thiết, biện pháp sử dụng kháng sinh chỉ mang tính ngắn hạn, tại chỗ. Biện pháp tiêm phòng vắc xin chủ động bảo vệ cho các nhóm nguy cơ cao mang tính lâu dài và trên diện rộng: người dân trong vùng dịch, nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân mắc bệnh than, nhân viên xét nghiệm tại các phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho quân nhân thực hiện nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến nghi ngờ địch sử dụng vũ khí có vi khuẩn than cũng là vấn đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra.

Hiện nay, việc sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho người có hai xu hướng khác nhau. Đối với các nước: Anh, Hoa Kỳ, vắc xin phòng bệnh than đã đưa vào sử dụng là loại vắc xin phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu trúc tế bào với tiêu chí gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, ít phản ứng phụ. Trường phái của các nước: Nga, Trung Quốc, Ấn Độ,, sản xuất vắc xin bào tử than - toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch nhanh và sản xuất đơn giản, đầu tư ít. Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về hai phương pháp này để có được phương án phù hợp nhất với Việt Nam.

12 Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người nhưng vẫn chưa có vắc xin phòng cho người. Đến nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh và chủng dùng sản xuất vắc xin. Việc nhập vắc xin phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và không đáp ứng được yêu cầu chủ động phòng bệnh. Chính vì vậy, để đáp ứng yêu cầu của cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm” nhằm mục đích: 1.

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn than để sản xuất vắc xin và một số chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực tại Việt Nam để đánh giá hiệu lực của vắc xin. Sản xuất được vắc xin phòng bệnh than ở quy mô phòng thí nghiệm. Đánh giá được tính an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực của hai loại vắc xin than trên động vật. 13 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.

Một số đặc điểm dịch tễ học và lâm sàng bệnh than (Anthrax) 1.1 Đặc điểm lƣu hành bệnh than trên thế giới Hầu hết các nước trên thế giới đều đã từng báo cáo có ca bệnh than. Theo Glassman ước tính trên thế giới có khoảng 20. Trong thập kỷ 1980 có gần 2000 ca bệnh trên người hàng năm. Những ca bệnh đầu tiên được phát hiện liên quan đến các vùng sản xuất nông nghiệp ở một số nước châu Á và châu Phi do tiếp xúc với súc vật nhiễm bệnh.

Ca bệnh đầu tiên được báo cáo liên quan đến công nghiệp xuất hiện ở châu Âu và Bắc Mỹ, là những nơi có nền công nghiệp thuộc da, làm len phát triển [98]. Những năm 1979- 1985, một đại dịch than xảy ra ở Zimbabwe làm khoảng 10.000 người mắc bệnh. Năm 1979 tại Sverdlovsk - Liên Bang Nga xảy ra vụ nổ phòng thí nghiệm trong quân đội làm 42 người mắc bệnh than theo đường hô hấp [6]. Ở Australia vẫn tiếp tục xuất hiện rải rác các vụ dịch than, hay gặp ở khu vực Nam Wales và Victoria.

Tại Anh, năm 1961 báo cáo có 145 ca bệnh, và 10 ca bệnh từ năm 1980- 1990 [114]. Dịch than trên động vật lan rộng khắp Ấn Độ, trong những năm 1991-1996 có 1613 vụ dịch than trên động vật được ghi nhận, tỉ lệ chết 62,5 % trong đó 20 % là trâu, 80 % còn lại là cừu và dê. Trong năm 1996 tại Philippine có 4 vụ dịch than xảy ra trên động vật, ở Thái Lan có 6 vụ dịch xảy ra trên động vật và có 148 người mắc bệnh. Tại Nepal từ năm 1992 đến 1997 có 19 vụ dịch than ở gia súc, cừu, ngựa làm tổng cộng 222 súc vật bị chết [54].

Bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới nhìn chung không có nhiều biến động về vùng lưu hành dịch, vùng tồn lưu bào tử và vùng không có bào tử 14 than. Châu Âu, Châu Mĩ và Australia nhờ có những biện pháp và chính sách hợp lý đã khống chế rất tốt sự bùng phát của dịch. Châu Á và Châu Phi là những vùng lưu hành dịch than, những ổ dịch mang tính địa phương. Tùy thuộc thời điểm khác nhau, các vùng đã từng lưu hành dịch có những đợt bùng phát trở thành dịch lớn hay vùng lưu hành dịch mức độ cao (Hình 1.

Hiện tại, nhìn trên bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới năm 2013 thì dịch than được cho là vẫn lưu hành mức độ cao ở một số nước Châu Phi và Châu Á như: Gambia, Guinea, Serria, Liberia, Bờ Biển Ngà, Ghana, Tchad, Ethiopia, Zambia và Zimbabwe, Thổ Nhĩ Kỳ, Tajikistan, Pakistan và Myanma. Bệnh than trên động vật đã được khống chế ở các nước Châu Âu (Hy Lạp, Ý, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ). Khu vực Mỹ-Latin đã được xác định có bệnh than gây chết gia súc như Hoa Kỳ, Mexico, Guatemala, Peru, Bolivia và Venezuela. Khu vực Nam Phi số lượng vụ dịch than đã giảm nhiều do chương trình kiểm soát tốt ở các nước như Bostswana, Zimbabwe và Zambia [92].

Các nước Trung Đông còn có sự lưu hành cao của bệnh. Ở phía Nam Ấn Độ, bệnh than vẫn lưu hành trên động vật, nhưng ở miền Bắc Ấn Độ không phát hiện thấy (vì khu vực này đất nhiễm axít), nhưng Nepal giáp phía Bắc Ấn Độ lại là vùng lưu hành dịch cao. Một số quốc gia Đông Nam Á (Myanma, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan) và Tây Trung Quốc là vùng lưu hành dịch ở nhiều tỉnh, còn các nước Philippine và Indonesia chỉ giới hạn ở một vùng. Dịch than lưu hành tản phát tại các quốc gia không có chương trình kiểm soát tốt, thường dẫn đến dịch hay bùng phát trên động vật [115].

Bệnh than thường thấy ở các loài gia súc ăn cỏ, tuy nhiên một số báo cáo có cả ở chó hoang. Bệnh than có khả năng gây dịch với số lượng lớn động vật. Liều gây chết 50 % (LD 50) của bệnh than đối với chuột lang là nhỏ hơn 10 vi khuẩn, đối với khỉ 3 x 103 vi khuẩn, đối với chuột cống 106, đối với lợn 15 109 và đối với chó 5 x 101o. Liều gây nhiễm tối thiểu (MID) theo đường không khí đối với cừu là 35.000 bào tử, nhưng với chủng phân lập được trong công viên quốc gia Kruger là 100 bào tử [30], [99].

Nguyên nhân chính gây nhiễm bệnh than ở người là do tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với động vật và các sản phẩm từ động vật. Số lượng người mắc bệnh than cũng phụ thuộc vào mức độ phơi nhiễm và tỉ lệ mắc bệnh trên động vật. Số liệu dịch tễ trên toàn thế giới cho thấy tỉ lệ như sau: 1 ca bệnh trên người thể da thì có tới 10 gia súc mắc bệnh, 1 người mắc bệnh thể dạ dày - ruột thì có tới 30 - 60 động vật mắc bệnh trong vùng xung quanh đó. Ở người, thường 95 % số ca mắc bệnh than ở thể da, hay 100 - 200 ca bệnh thể da thì có 01 trường hợp thể ruột [118].

Đặc điểm dịch tễ bệnh than ở các vùng địa lý khác nhau trên thế giới có nhiều điểm khác biệt. Điều này được tạo nên bởi các yếu tố sinh thái, dịch tễ liên quan tới sự tồn tại, phương thức lây truyền, các yếu tố nguy cơ, tỷ lệ và cơ cấu thể bệnh ở mỗi vùng. Yếu tố sinh thái của bệnh là các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự tồn tại mầm bệnh: sự nảy mầm, trạng thái ngủ, kiểu địa hình mang tính tập chung hay phát tán bào tử, tăng hay giảm khả năng tiếp xúc với các vật chủ. Những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại của mầm bệnh trong tự nhiên bao gồm: độ pH của đất, thành phần chất hữu cơ, nồng độ các chất khoáng, độ ẩm và nhiệt độ.

Đất có độ pH nhỏ hơn 5 sẽ làm cho các bào tử bị bất hoạt không tồn tại được lâu. Độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ là điều kiện thích hợp cho bào tử tồn tại hàng chục, hàng trăm năm. Đất nhiều chất hữu cơ, mùn độ ẩm cao giúp cho bào tử dễ nảy mầm hơn khi gặp vật chủ. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng tác động đến sự nảy mầm của bào tử, dưới 15 oC khó nảy mầm, dưới 5oC không nảy mầm [116].

Điều kiện tốt nhất cho bào tử than tồn tại là đất thảo nguyên đen giàu chất hữu cơ và canxi. Bệnh than hay xảy ra với 16 gia súc chăn nuôi trên đất có độ pH cao hơn 6,0 và nhiệt độ môi trường trên 15,5oC, đất chứa mollisol và aridisol [116]. Tỷ lệ tử vong do bệnh than không đồng đều trên cùng một vùng thảo nguyên, liên quan chặt với yếu tố đất đen giầu hữu cơ, đặc biệt là đất chernozem và kastanozem, với vôi hoặc lòng đất giàu thạch cao [116]. Đất phaeozem dày có liên quan đến nguy cơ bị bệnh than như ở Argentina.

Trong công viên quốc gia Kruger Nam Phi (KNP), khu vực đất có canxi > 150 milliequivalents và độ pH > 7.0 tỷ lệ tử vong do bệnh than của các động vật hoang dã cao hơn bảy lần so với những khu vực có độ pH và nồng độ canxi thấp hơn [116]. Vùng bệnh lưu hành thường xuyên, tỷ lệ cao Vùng ít có khả năng có dịch Vùng bệnh lưu hành khu trú địa phương Vùng không có dịch Vùng lưu hành bào tử than Vùng không có thông tin Hình 1.