Nghiên cứu Sản Xuất Vắc Xin Phòng Bệnh Than do Bacillus anthracis Quy Mô Phòng Thí Nghiệm

Luận văn thạc sĩ tập trung nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm. Phân tích các yếu tố ảnh

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Bảo
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Trọng Tuyên
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan nghiên cứu sản xuất vắc xin bệnh than

Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis là lĩnh vực trọng yếu trong y tế dự phòng. Bệnh than là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có thể gây tử vong cao ở người và động vật. Vắc xin hiện hành trên thế giới chủ yếu dựa trên nguyên lý giảm độc lực hoặc hấp phụ độc tố. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu nội địa hóa quy trình sản xuất nhằm đảm bảo nguồn cung, kiểm soát chất lượng và giảm chi phí là cần thiết. Công trình này tập trung vào quy mô phòng thí nghiệm, đặt nền móng cho sản xuất công nghiệp. Mục tiêu chính là tuyển chọn chủng vi khuẩn phù hợp, xây dựng quy trình lên men, tinh chế và đánh giá hiệu quả bảo hộ trên động vật thực nghiệm. Đây là bước đi chiến lược hướng tới an ninh sinh học quốc gia.

1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus anthracis

Bacillus anthracis là trực khuẩn gram dương, hiếu khí, có khả năng sinh bào tử. Bào tử có sức đề kháng cao trong môi trường, là yếu tố chính gây bệnh và cũng là kháng nguyên quan trọng trong vắc xin. Vi khuẩn tạo vỏ nhày (capsule) và độc tố than gồm 3 thành phần: EF, LF, PA. Yếu tố bảo vệ (PA) là kháng nguyên chủ đạo kích thích miễn dịch bảo hộ. Các plasmid pXO1 và pXO2 quyết định khả năng sinh độc tố và vỏ nhày, là đích để nghiên cứu giảm độc lực cho chủng vắc xin.

1.2. Các loại vắc xin bệnh than trên thế giới

Vắc xin bệnh than được phân thành hai nhóm chính: vắc xin sống giảm độc lực và vắc xin hấp phụ. Vắc xin sống từ chủng Sterne (34F2) được dùng rộng rãi cho động vật, có ưu điểm kích đáp ứng miễn dịch mạnh nhưng còn lo ngại về an toàn. Vắc xin hấp phụ từ chủng V770-NP1-R của Hoa Kỳ được cấp phép cho người, dựa trên thành phần PA đã tinh chế, có tính an toàn cao hơn. Các nước như Liên bang Nga, Trung Quốc cũng có sản phẩm bào tử sống. Sự đa dạng này phản ánh nhu cầu về vắc xin vừa an toàn vừa hiệu quả bền vững.

II. Thách thức trong sản xuất vắc xin bệnh than

Sản xuất vắc xin bệnh than đối mặt với nhiều thách thức kỹ thuật và an toàn sinh học. Chủng vi khuẩn sử dụng phải được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo tính giảm độc lực ổn định qua các thế hệ. Quy trình lên men đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt để vi khuẩn phát triển tốt và sinh bào tử hoặc kháng nguyên đạt hiệu suất cao. Bào tử của B. anthracis có sức chịu đựng cao, gây khó khăn trong khâu khử khuẩn và an toàn lao động. Việc tinh chế các thành phần kháng nguyên như PA đòi hỏi công nghệ cao để loại bỏ tạp chất và độc tố còn sót lại. Đánh giá hiệu quả trên động vật thực nghiệm tốn kém thời gian và nguồn lực. Những rào cản này đòi hỏi nghiên cứu tỉ mỉ và đầu tư trang thiết bị chuyên dụng.

2.1. Vấn đề về độc lực và tính an toàn của chủng sản xuất

Chủng sản xuất vắc xin sống phải mất khả năng gây bệnh nhưng vẫn duy trì tính kháng nguyên. Phương pháp cổ điển dựa trên việc loại bỏ plasmid pXO2 (mất vỏ nhày) như ở chủng Sterne. Tuy nhiên, nguy cơ đột biến hồi phục độc lực hay nhiễm chéo vẫn là mối quan ngại. Đối với vắc xin hấp phụ, chủng sản xuất cần có năng suất sinh PA cao và ổn định. Việc tuyển chọn và kiểm định chủng đòi hỏi các xét nghiệm phân tử và sinh học phức tạp để đảm bảo an toàn tuyệt đối trước khi đưa vào sản xuất quy mô lớn.

2.2. Kỹ thuật lên men và tinh chế kháng nguyên

Quy trình lên men ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng bào tử hoặc kháng nguyên. Điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, oxy, nồng độ dinh dưỡng phải được tối ưu hóa. Đối với vắc xin bào tử, quá trình sinh bào tử cần được kiểm soát. Với vắc xin hấp phụ, mục tiêu là tối đa hóa sản lượng PA tiết ra môi trường. Sau lên men, khâu tinh chế là then chốt. Các phương pháp sắc ký (ion exchange, gel filtration) được áp dụng để cô lập PA. Quy trình phải loại bỏ endotoxin và tạp chất, đảm bảo độ tinh khiết và an toàn cho sản phẩm cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm nhiều giai đoạn tuần tự. Đầu tiên là tuyển chọn và kiểm định chủng vi khuẩn có tiềm năng. Tiếp theo là xây dựng và tối ưu quy trình lên men trong bình thí nghiệm. Các thông số như thời gian, thành phần môi trường, tốc độ khuấy trộn được khảo sát kỹ lưỡng. Sản phẩm lên men được thu hoạch và xử lý. Đối với vắc xin bào tử, bào tử được thu, tinh chế và khử tạp. Đối với vắc xin hấp phụ, PA được tinh chế từ dịch lên men. Cuối cùng, sản phẩm được bào chế thành dạng vắc xin hoàn chỉnh và đánh giá tính an toàn, sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm (chuột, thỏ). Quy trình này đặt nền tảng vững chắc cho việc chuyển giao công nghệ lên quy mô pilot.

3.1. Tuyển chọn chủng và tối ưu hóa quy trình lên men

Tuyển chọn chủng bắt đầu bằng việc thu thập các chủng B. anthracis từ ngân hàng chủng hoặc từ dịch tễ. Các chủng được đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa, và quan trọng nhất là tính giảm độc lực trên động vật. Chủng tiềm năng được kiểm tra bằng PCR để xác định sự hiện diện của plasmid. Quy trình lên men được tối ưu bằng phương pháp thử nghiệm từng yếu tố hoặc thiết kế thực nghiệm. Môi trường lỏng và đặc được thử nghiệm, các yếu tố như nguồn carbon, nitrogen, ion kim loại được điều chỉnh để đạt sinh khối và sản lượng bào tử/PA cao nhất.

3.2. Kỹ thuật tinh chế và đánh giá sản phẩm vắc xin

Đối với vắc xin bào tử, bào tử được thu bằng ly tâm, rửa nhiều lần bằng nước cất để loại bỏ tế bào dinh dưỡng và mảnh vỡ. Bào tử sau đó được đếm, kiểm tra độ tinh khiết và bảo quản. Đối với vắc xin hấp phụ, dịch lên men được lọc, siêu lọc để cô đặc, sau đó tinh chế bằng sắc ký. Sản phẩm PA được định lượng bằng phương pháp Bradford, kiểm tra độ tinh khiết bằng SDS-PAGE. Thành phẩm vắc xin được trộn với tá dược (như nhôm hydroxide) và đánh giá an toàn qua LD50, tính sinh miễn dịch qua kháng thể huyết thanh trên động vật thí nghiệm.

IV. Kết luận và triển vọng ứng dụng nghiên cứu

Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình sản xuất vắc xin bệnh than ở quy mô phòng thí nghiệm. Quy trình tuyển chọn chủng, lên men, tinh chế và bào chế vắc xin được xây dựng và kiểm chứng. Các sản phẩm vắc xin thử nghiệm cho thấy tính an toàn và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên động vật thực nghiệm. Đây là kết quả quan trọng, chứng minh tính khả thi của việc nội địa hóa công nghệ sản xuất. Nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc để phát triển lên quy mô pilot và tiến tới sản xuất thương mại. Ứng dụng của vắc xin này sẽ góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, phòng chống dịch bệnh có chủ đích và đảm bảo an ninh sinh học quốc gia.

4.1. Giá trị khoa học và thực tiễn của công trình

Về mặt khoa học, công trình đã làm sáng tỏ nhiều đặc điểm sinh học của các chủng B. anthracis trong nước, tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất vắc xin. Về thực tiễn, nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu và quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh, có thể áp dụng tại các cơ sở sản xuất vắc xin trong nước. Việc chủ động nguồn vắc xin giúp giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, tiết kiệm ngoại tệ và đáp ứng nhanh trong tình huống khẩn cấp. Kết quả cũng là nguồn tài liệu quý giá cho đào tạo và nghiên cứu sau này.

4.2. Hướng phát triển và chuyển giao công nghệ

Bước tiếp theo là nhân rộng quy trình lên quy mô pilot để đánh giá tính ổn định và hiệu quả kinh tế. Cần hoàn thiện quy trình tinh chế để đạt tiêu chuẩn dược phẩm. Các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế miễn dịch, thử nghiệm lâm sàng trên người (nếu có) sẽ là hướng đi dài hạn. Chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất vắc xin là mục tiêu cuối cùng. Sự hợp tác giữa viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp sẽ là chìa khóa để đưa sản phẩm từ phòng thí nghiệm ra thị trường, phục vụ công tác phòng chống dịch bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh than (anthrax) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do nhiễm vi khuẩn than Bacillus anthracis. Vi khuẩn than thường gây bệnh cho các loại động vật móng guốc, ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da, lông. Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh cảnh lâm sàng và đường lây đa dạng, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngoài môi trường. Vi khuẩn than hay được sử dụng làm vũ khí sinh học vi: giá thành sản xuất rẻ và dễ sản xuất và tàng trữ.

anthracis thường được một số nước sử dụng như loại vũ khí bí mật trong phòng chống và đánh trả, luôn có nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [5]. Phòng chống bệnh than luôn là vấn đề mang tính cấp thiết, biện pháp sử dụng kháng sinh chỉ mang tính ngắn hạn, tại chỗ. Biện pháp tiêm phòng vắc xin chủ động bảo vệ cho các nhóm nguy cơ cao mang tính lâu dài và trên diện rộng: người dân trong vùng dịch, nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân mắc bệnh than, nhân viên xét nghiệm tại các phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó, sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho quân nhân thực hiện nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến nghi ngờ địch sử dụng vũ khí có vi khuẩn than cũng là vấn đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra.

Hiện nay, việc sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho người có hai xu hướng khác nhau. Đối với các nước: Anh, Hoa Kỳ, vắc xin phòng bệnh than đã đưa vào sử dụng là loại vắc xin phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu trúc tế bào với tiêu chí gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, ít phản ứng phụ. Trường phái của các nước: Nga, Trung Quốc, Ấn Độ,, sản xuất vắc xin bào tử than - toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch nhanh và sản xuất đơn giản, đầu tư ít. Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về hai phương pháp này để có được phương án phù hợp nhất với Việt Nam.

12 Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người nhưng vẫn chưa có vắc xin phòng cho người. Đến nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh và chủng dùng sản xuất vắc xin. Việc nhập vắc xin phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và không đáp ứng được yêu cầu chủ động phòng bệnh. Chính vì vậy, để đáp ứng yêu cầu của cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm” nhằm mục đích: 1.

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn than để sản xuất vắc xin và một số chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực tại Việt Nam để đánh giá hiệu lực của vắc xin. Sản xuất được vắc xin phòng bệnh than ở quy mô phòng thí nghiệm. Đánh giá được tính an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực của hai loại vắc xin than trên động vật. 13 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.

Một số đặc điểm dịch tễ học và lâm sàng bệnh than (Anthrax) 1.1 Đặc điểm lƣu hành bệnh than trên thế giới Hầu hết các nước trên thế giới đều đã từng báo cáo có ca bệnh than. Theo Glassman ước tính trên thế giới có khoảng 20. Trong thập kỷ 1980 có gần 2000 ca bệnh trên người hàng năm. Những ca bệnh đầu tiên được phát hiện liên quan đến các vùng sản xuất nông nghiệp ở một số nước châu Á và châu Phi do tiếp xúc với súc vật nhiễm bệnh.

Ca bệnh đầu tiên được báo cáo liên quan đến công nghiệp xuất hiện ở châu Âu và Bắc Mỹ, là những nơi có nền công nghiệp thuộc da, làm len phát triển [98]. Những năm 1979- 1985, một đại dịch than xảy ra ở Zimbabwe làm khoảng 10.000 người mắc bệnh. Năm 1979 tại Sverdlovsk - Liên Bang Nga xảy ra vụ nổ phòng thí nghiệm trong quân đội làm 42 người mắc bệnh than theo đường hô hấp [6]. Ở Australia vẫn tiếp tục xuất hiện rải rác các vụ dịch than, hay gặp ở khu vực Nam Wales và Victoria.

Tại Anh, năm 1961 báo cáo có 145 ca bệnh, và 10 ca bệnh từ năm 1980- 1990 [114]. Dịch than trên động vật lan rộng khắp Ấn Độ, trong những năm 1991-1996 có 1613 vụ dịch than trên động vật được ghi nhận, tỉ lệ chết 62,5 % trong đó 20 % là trâu, 80 % còn lại là cừu và dê. Trong năm 1996 tại Philippine có 4 vụ dịch than xảy ra trên động vật, ở Thái Lan có 6 vụ dịch xảy ra trên động vật và có 148 người mắc bệnh. Tại Nepal từ năm 1992 đến 1997 có 19 vụ dịch than ở gia súc, cừu, ngựa làm tổng cộng 222 súc vật bị chết [54].

Bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới nhìn chung không có nhiều biến động về vùng lưu hành dịch, vùng tồn lưu bào tử và vùng không có bào tử 14 than. Châu Âu, Châu Mĩ và Australia nhờ có những biện pháp và chính sách hợp lý đã khống chế rất tốt sự bùng phát của dịch. Châu Á và Châu Phi là những vùng lưu hành dịch than, những ổ dịch mang tính địa phương. Tùy thuộc thời điểm khác nhau, các vùng đã từng lưu hành dịch có những đợt bùng phát trở thành dịch lớn hay vùng lưu hành dịch mức độ cao (Hình 1.

Hiện tại, nhìn trên bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới năm 2013 thì dịch than được cho là vẫn lưu hành mức độ cao ở một số nước Châu Phi và Châu Á như: Gambia, Guinea, Serria, Liberia, Bờ Biển Ngà, Ghana, Tchad, Ethiopia, Zambia và Zimbabwe, Thổ Nhĩ Kỳ, Tajikistan, Pakistan và Myanma. Bệnh than trên động vật đã được khống chế ở các nước Châu Âu (Hy Lạp, Ý, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ). Khu vực Mỹ-Latin đã được xác định có bệnh than gây chết gia súc như Hoa Kỳ, Mexico, Guatemala, Peru, Bolivia và Venezuela. Khu vực Nam Phi số lượng vụ dịch than đã giảm nhiều do chương trình kiểm soát tốt ở các nước như Bostswana, Zimbabwe và Zambia [92].

Các nước Trung Đông còn có sự lưu hành cao của bệnh. Ở phía Nam Ấn Độ, bệnh than vẫn lưu hành trên động vật, nhưng ở miền Bắc Ấn Độ không phát hiện thấy (vì khu vực này đất nhiễm axít), nhưng Nepal giáp phía Bắc Ấn Độ lại là vùng lưu hành dịch cao. Một số quốc gia Đông Nam Á (Myanma, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan) và Tây Trung Quốc là vùng lưu hành dịch ở nhiều tỉnh, còn các nước Philippine và Indonesia chỉ giới hạn ở một vùng. Dịch than lưu hành tản phát tại các quốc gia không có chương trình kiểm soát tốt, thường dẫn đến dịch hay bùng phát trên động vật [115].

Bệnh than thường thấy ở các loài gia súc ăn cỏ, tuy nhiên một số báo cáo có cả ở chó hoang. Bệnh than có khả năng gây dịch với số lượng lớn động vật. Liều gây chết 50 % (LD 50) của bệnh than đối với chuột lang là nhỏ hơn 10 vi khuẩn, đối với khỉ 3 x 103 vi khuẩn, đối với chuột cống 106, đối với lợn 15 109 và đối với chó 5 x 101o. Liều gây nhiễm tối thiểu (MID) theo đường không khí đối với cừu là 35.000 bào tử, nhưng với chủng phân lập được trong công viên quốc gia Kruger là 100 bào tử [30], [99].

Nguyên nhân chính gây nhiễm bệnh than ở người là do tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với động vật và các sản phẩm từ động vật. Số lượng người mắc bệnh than cũng phụ thuộc vào mức độ phơi nhiễm và tỉ lệ mắc bệnh trên động vật. Số liệu dịch tễ trên toàn thế giới cho thấy tỉ lệ như sau: 1 ca bệnh trên người thể da thì có tới 10 gia súc mắc bệnh, 1 người mắc bệnh thể dạ dày - ruột thì có tới 30 - 60 động vật mắc bệnh trong vùng xung quanh đó. Ở người, thường 95 % số ca mắc bệnh than ở thể da, hay 100 - 200 ca bệnh thể da thì có 01 trường hợp thể ruột [118].

Đặc điểm dịch tễ bệnh than ở các vùng địa lý khác nhau trên thế giới có nhiều điểm khác biệt. Điều này được tạo nên bởi các yếu tố sinh thái, dịch tễ liên quan tới sự tồn tại, phương thức lây truyền, các yếu tố nguy cơ, tỷ lệ và cơ cấu thể bệnh ở mỗi vùng. Yếu tố sinh thái của bệnh là các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sự tồn tại mầm bệnh: sự nảy mầm, trạng thái ngủ, kiểu địa hình mang tính tập chung hay phát tán bào tử, tăng hay giảm khả năng tiếp xúc với các vật chủ. Những yếu tố ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại của mầm bệnh trong tự nhiên bao gồm: độ pH của đất, thành phần chất hữu cơ, nồng độ các chất khoáng, độ ẩm và nhiệt độ.

Đất có độ pH nhỏ hơn 5 sẽ làm cho các bào tử bị bất hoạt không tồn tại được lâu. Độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ là điều kiện thích hợp cho bào tử tồn tại hàng chục, hàng trăm năm. Đất nhiều chất hữu cơ, mùn độ ẩm cao giúp cho bào tử dễ nảy mầm hơn khi gặp vật chủ. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng tác động đến sự nảy mầm của bào tử, dưới 15 oC khó nảy mầm, dưới 5oC không nảy mầm [116].

Điều kiện tốt nhất cho bào tử than tồn tại là đất thảo nguyên đen giàu chất hữu cơ và canxi. Bệnh than hay xảy ra với 16 gia súc chăn nuôi trên đất có độ pH cao hơn 6,0 và nhiệt độ môi trường trên 15,5oC, đất chứa mollisol và aridisol [116]. Tỷ lệ tử vong do bệnh than không đồng đều trên cùng một vùng thảo nguyên, liên quan chặt với yếu tố đất đen giầu hữu cơ, đặc biệt là đất chernozem và kastanozem, với vôi hoặc lòng đất giàu thạch cao [116]. Đất phaeozem dày có liên quan đến nguy cơ bị bệnh than như ở Argentina.

Trong công viên quốc gia Kruger Nam Phi (KNP), khu vực đất có canxi > 150 milliequivalents và độ pH > 7.0 tỷ lệ tử vong do bệnh than của các động vật hoang dã cao hơn bảy lần so với những khu vực có độ pH và nồng độ canxi thấp hơn [116]. Vùng bệnh lưu hành thường xuyên, tỷ lệ cao Vùng ít có khả năng có dịch Vùng bệnh lưu hành khu trú địa phương Vùng không có dịch Vùng lưu hành bào tử than Vùng không có thông tin Hình 1.