Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của dịch chiết thân lá loài gừng orlow distichochlamys orlowii

Khóa luận nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của dịch chiết thân lá loài gừng Orlowii, cung cấp thông tin quý giá.

• Tác giả: Lê Thị Hồng
• Người hướng dẫn: TS. Lê Hồng Luyến
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Và Thành Phần Hóa Học Của Dịch Chiết Gừng Orlow
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về cây
• 1.1.1. Tổng quan về họ gừng (Zingibeaceae)
• 1.1.2. Tổng quan về Chi Distichochlamys
• 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Distichochlamys orlowii
• 1.2. Tổng quan về chiết xuất
• 1.2.1. Khái niệm chiết xuất
• 1.2.2. Các kỹ thuật chiết xuất
• 1.3. Tổng quan về oxy hóa
• 1.3.1. Gốc tự do
• 1.3.2. Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể
• 1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất sử dụng
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết soxhlet
• 2.4.2. Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết lắc
• 2.4.3. Chiết xuất thân lá Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) bằng phương pháp chiết siêu âm
• 2.4.4. Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
• 2.4.5. Xác định khả năng quét gốc tự do ABTS
• 2.4.6. Xác định hàm lượng phenolic tổng và flavonoid tổng có trong cao chiết thân lá loài D.
• 2.4.7. Sắc ký khí - Khối phổ (GC-MS)
• 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Hiệu suất chiết
• 3.2. Khả năng chống oxy hóa in vitro của các cao chiết thân lá Distichochlamys orlowii
• 3.2.1. Khả năng quét gốc tự do DPPH
• 3.2.2. Khả năng quét gốc tự do ABTS
• 3.3. Thành phần hóa học của dịch chiết thân lá loài Distichochlamys orlowii
• 3.3.1. Hàm lượng phenolic toàn phần, flavonoid toàn phần của thân lá Distichochlamys orlowii
• 3.3.2. Xác định thành phần tinh dầu trong cao chiết thân lá D.
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về hiệu suất chiết
• 4.2. Về khả năng chống oxy hóa
• 4.2.1. Khả năng quét gốc tự do DPPH
• 4.2.2. Khả năng quét gốc tự do ABTS
• 4.3. Về thành phần hóa học
• 4.3.1. Tổng hàm lượng phenolic và tổng hàm lượng Flavonoid
• 4.3.2. Đánh giá các thành phần tinh dầu trong dịch chiết thân lá loài D.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của gừng Orlow

Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực y học và dược phẩm. Gừng Orlow không chỉ là một loại gia vị phổ biến mà còn chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ gừng Orlow có khả năng quét gốc tự do, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tác động tiêu cực của stress oxy hóa. Việc tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của gừng Orlow sẽ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của gừng Orlow

Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) là một loài cây thảo nhỏ, thường mọc ở các khu vực rừng ẩm ướt. Loài này có đặc điểm nhận diện dễ dàng với lá dài và cụm hoa màu vàng. Sự phân bố của gừng Orlow chủ yếu tập trung ở Việt Nam, nơi có điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của loài cây này.

1.2. Tầm quan trọng của gừng trong y học cổ truyền

Gừng đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều loại bệnh như viêm khớp, rối loạn tiêu hóa và bệnh tim mạch. Các hợp chất trong gừng như phenolic và flavonoid được cho là có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp cải thiện sức khỏe tổng thể.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của gừng, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định chính xác các thành phần hóa học và cơ chế hoạt động của chúng. Việc phân tích các hợp chất trong dịch chiết gừng Orlow cần sử dụng các phương pháp hiện đại như GC-MS để đảm bảo độ chính xác và tin cậy. Ngoài ra, việc tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất cũng là một vấn đề quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc chiết xuất và phân tích

Quá trình chiết xuất các hợp chất từ gừng Orlow có thể gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất có trong cây. Việc lựa chọn dung môi và phương pháp chiết xuất phù hợp là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu suất chiết xuất.

2.2. Thiếu thông tin về thành phần hóa học

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về gừng, nhưng thông tin về thành phần hóa học của gừng Orlow vẫn còn hạn chế. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ ràng các hợp chất có trong dịch chiết và tác dụng của chúng đối với sức khỏe.

III. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của gừng Orlow

Để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết gừng Orlow, các phương pháp như chiết xuất Soxhlet, chiết xuất siêu âm và phân tích GC-MS được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định khả năng quét gốc tự do và thành phần hóa học của dịch chiết. Kết quả từ các phương pháp này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về hiệu quả của gừng Orlow trong việc chống lại stress oxy hóa.

3.1. Phương pháp chiết xuất Soxhlet

Phương pháp chiết xuất Soxhlet được sử dụng để thu được dịch chiết có nồng độ cao các hợp chất có hoạt tính. Phương pháp này cho phép chiết xuất hiệu quả các hợp chất từ gừng Orlow, đảm bảo giữ lại các thành phần có lợi.

3.2. Phân tích thành phần hóa học bằng GC MS

Sử dụng phương pháp GC-MS giúp xác định chính xác các hợp chất có trong dịch chiết gừng Orlow. Phân tích này không chỉ cung cấp thông tin về thành phần hóa học mà còn giúp đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất này.

IV. Kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của gừng Orlow

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết gừng Orlow có khả năng quét gốc tự do DPPH và ABTS cao, cho thấy tác dụng chống oxy hóa tự nhiên của nó. Hàm lượng phenolic và flavonoid trong dịch chiết cũng được xác định ở mức cao, góp phần vào khả năng chống oxy hóa của gừng Orlow. Những kết quả này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ gừng Orlow.

4.1. Khả năng quét gốc tự do DPPH

Dịch chiết gừng Orlow cho thấy khả năng quét gốc tự do DPPH với IC50 thấp, cho thấy hiệu quả cao trong việc ngăn chặn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể.

4.2. Hàm lượng phenolic và flavonoid

Hàm lượng phenolic và flavonoid trong dịch chiết gừng Orlow được xác định cao, cho thấy tiềm năng của gừng trong việc phát triển các sản phẩm chống oxy hóa tự nhiên.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu gừng Orlow

Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và thành phần hóa học của gừng Orlow đã chỉ ra rằng loài cây này có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ gừng Orlow sẽ góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loài cây này trong y học và dược phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu gừng Orlow

Nghiên cứu về gừng Orlow cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều ứng dụng trong y học và dược phẩm. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các sản phẩm chiết xuất từ gừng Orlow với hiệu quả cao hơn.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng để xác định rõ ràng tác dụng của gừng Orlow đối với sức khỏe con người. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và ngành công nghiệp cũng sẽ giúp thúc đẩy việc phát triển các sản phẩm từ gừng Orlow.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề thời vụ thu hái để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất.2 Các kỹ thuật chiết xuất Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng), chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa,…tùy yêu cầu, điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Các phương pháp chiết gồm có ngâm và ngấm kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong một lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm chiết được lặp lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu.

Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hoà ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.

Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosid, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol.) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do,…) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên ra, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao…đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất [14].

Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 kHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hoà tan của chất tan vào dung môi và 8 tăng quá trình khuếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể tăng quá trình khuyếch tán chất tan.

Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết [14]. Ưu điểm: chiết xuất với sự trợ giúp của siêu âm thể hiện sự hiệu quả, đơn giản và ít tốn kém so với các kỹ thuật chiết xuất thông thường. Ưu điểm chính của phương pháp này là làm tăng khối lượng chiết xuất và động học của quá trình chiết xuất cũng nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chiết xuất. Siêu âm cũng có thể làm giảm nhiệt độ chiết xuất, cho phép chiết xuất các hợp chất kém bền với nhiệt.

So với chiết xuất bằng vi sóng và siêu tới hạn thì thiết bị chiết siêu âm rẻ hơn và tiến hành dễ dàng hơn. Hơn nữa, trong chiết xuất siêu âm có thể sử dụng nhiều loại dung môi để chiết xuất một khoảng rộng các hoạt chất [15]. Nhược điểm: siêu âm trong chiết xuất có thể làm biến đổi các chất chiết do nhiệt độ tăng cao và sự hình thành hydroqeroxyl, nhất là dung môi có nước. Một số hoạt chất trong dược liệu khi sử dụng siêu âm dễ bị phân hủy.

Vì vậy phải cẩn thận khi chọn điều kiện chiết xuất cũng như phương pháp phát hiện sản phẩm phân hủy [15]. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vùng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hoà tan các chất vào dung môi.

Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá huỷ cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hoà tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết nhiều tạp chất hơn [14]. 9 Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá giới hạn hoặc chất lỏng siêu tới hạn (Super-critical fluid extraction, SFE) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi.

Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Trong phòng thí nghiệm, SFE được dùng để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ độc hại trong môi trường,…[14] Chiết dưới áp suất cao Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết xuất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction, PLE). Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều và nhiệt độ.

Khi nhiệt độ tăng khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa.

Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng sưới áp suất [14].3 Tổng quan về oxy hóa 1.1 Gốc tự do Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có 1 điện tử lẻ ở quỹ đạo điện tử ngoài cùng [16], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện tử chẵn ở lớp ngoài cùng [17, 18]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của mình [18]. Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể 10 phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA.

Những gốc tự do này tấn công các phân tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào [16]. Cấu tạo gốc tự do [19] Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy (Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do).

Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính [20] O2. OH Hydroxyl Gốc tự do NO. Nitric Oxide NO2. Nitrogen dioxid H2O2 Hydrogen peroxid Các dẫn xuất không Hypochlorous acid HOCl phải là các gốc tự do ONOO- Peroxy nitrit 11 ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương mô.

Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều ROS sẽ gây ra stress oxy hóa. ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch, tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh …[21]. Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có thể gây hại cho hệ thống sống.

Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá hủy các enzym chuyển hóa bằng phản ứng với superoxid, peroxynitrit [20]. Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [20, 22]. Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ [22]: + Điều hòa phân ly tế bào + Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,.) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm.

+ Điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên [22]: + Đột biến ở DNA + Biến tính protein + Oxy hóa lipid 1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể Chất chống oxy hóa là những phân tử ổn định đủ để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và trung hòa chúng, do đó làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của ROS [23].