Khảo Sát Hợp Chất Tự Nhiên Hoạt Tính Chống Oxy Hóa và Kháng Khuẩn Từ Thịt Quả Mãng Cầu Xiêm

Khảo sát hợp chất tự nhiên từ thịt quả mãng cầu xiêm với hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn, mang lại tiềm năng ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Thân
• Người hướng dẫn: TS. Trần Đức Mạnh
• Trường học: Đại học Đà Nẵng
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Khảo Sát Một Số Hợp Chất Tự Nhiên Chống Oxy Hóa và Kháng Khuẩn Từ Mãng Cầu Xiêm
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Đà Nẵng

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VÀ TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.2. Giới thiệu về mãng cầu xiêm
• 1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4. Giá trị và tình hình sử dụng mãng cầu xiêm
• 1.5. Một số lớp chất tự nhiên trong thịt quả MCX có hoạt tính sinh học
• 1.6. Gốc tự do và hoạt tính chống oxy hóa
• 1.7. Một số phương pháp chiết xuất
• 1.7.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
• 1.7.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng
• 1.7.3. Các phương pháp chiết khác
• 1.8. Một số bài thuốc từ MCX
• 1.9. Một số sản phẩm từ MCX có trên thị trường
• 1.10. Ứng dụng thịt quả MCX trong chế biến thực phẩm
• 1.11. Độc chất và những chống chỉ định khi sử dụng quả MCX
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị - Dụng cụ - Hóa chất
• 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.1.2. Nguồn nguyên liệu
• 2.2. Sơ đồ quy trình thực nghiệm
• 2.3. Phương pháp định tính một số thành phần hợp chất tự nhiên có trong thịt quả MCX
• 2.3.1. Xác định pH và hàm lượng chất khô (TSS) của thịt quả MCX
• 2.3.2. Xác định hàm lượng acid tổng trong thịt quả MCX
• 2.3.3. Xác định tổng hàm lượng hợp chất có tính khử có trong thịt quả MCX
• 2.3.4. Xác định hàm lượng phenol tổng
• 2.3.5. Xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
• 2.3.6. Xác định lực kháng oxy hoá tổng theo mô hình phospho molybdenum
• 2.3.7. Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH
• 2.3.8. Xác định hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số bằng phản ứng DPPH với chất chuẩn Vitamin C. Khả năng trung hòa gốc tự do (SA)
• 2.3.9. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán qua giếng thạch
• 3. CHƯƠNG 3: THẢO LUẬN VÀ KẾT QUẢ
• 3.1. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên
• 3.2. Kết quả xác định tổng nồng độ các hợp chất khử có trong thịt quả MCX
• 3.3. Xác định pH và hàm lượng chất khô (TSS) trong thịt quả MCX
• 3.4. Xác định hàm lượng acid tổng có trong thịt quả MCX
• 3.5. Một số chỉ tiêu hoá lý của thịt quả MCX
• 3.6. Xác định hàm lượng vitamin C bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
• 3.7. Kết quả xác định hàm lượng phenol tổng
• 3.8. Xác định lực kháng oxy hoá tổng theo mô hình phospho molybdenum
• 3.9. Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH
• 3.9.1. Tổng hàm lượng hợp chất có khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH trong 1g thịt quả MCX qui tương đương khối lượng vitamin C
• 3.9.2. Hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số của mẫu thử (C) biểu thị bằng milimol đương lượng Vitamin C trên 100 g (µmol TC/100 g)
• 3.10. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán qua giếng thạch
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khám Phá Hợp Chất Tự Nhiên Chống Oxy Hóa Từ Mãng Cầu Xiêm

Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) không chỉ là một loại trái cây thơm ngon mà còn chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Nghiên cứu cho thấy, thịt quả mãng cầu xiêm có khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn mạnh mẽ. Các hợp chất này có thể giúp bảo vệ cơ thể khỏi các gốc tự do, từ đó giảm nguy cơ mắc các bệnh lý nghiêm trọng.

1.1. Tác Dụng Chống Oxy Hóa Của Mãng Cầu Xiêm

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng mãng cầu xiêm chứa nhiều phytochemicals như alkaloids và flavonoids, có khả năng loại bỏ gốc tự do. Những hợp chất này giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương, từ đó ngăn ngừa lão hóa và các bệnh liên quan đến stress oxy hóa.

1.2. Khả Năng Kháng Khuẩn Của Hợp Chất Từ Mãng Cầu Xiêm

Các nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ mãng cầu xiêm có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là đối với các vi khuẩn gây bệnh. Điều này mở ra cơ hội sử dụng mãng cầu xiêm trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên.

II. Vấn Đề Về Gốc Tự Do Và Stress Oxy Hóa Trong Cuộc Sống Hiện Đại

Gốc tự do là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, bệnh tim mạch và lão hóa sớm. Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng giữa gốc tự do và chất chống oxy hóa trong cơ thể. Việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng chống oxy hóa là rất cần thiết trong bối cảnh hiện nay.

2.1. Nguyên Nhân Gây Ra Gốc Tự Do

Gốc tự do có thể xuất hiện từ nhiều nguồn khác nhau như ô nhiễm môi trường, chế độ ăn uống không lành mạnh và căng thẳng. Những yếu tố này làm tăng nguy cơ mắc các bệnh mãn tính.

2.2. Hệ Lụy Của Stress Oxy Hóa Đối Với Sức Khỏe

Stress oxy hóa có thể dẫn đến tổn thương tế bào, gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, bệnh tim mạch và các bệnh thoái hóa thần kinh. Việc bổ sung các chất chống oxy hóa từ thực phẩm tự nhiên là một giải pháp hiệu quả.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất Từ Mãng Cầu Xiêm

Có nhiều phương pháp chiết xuất khác nhau để thu được các hợp chất tự nhiên từ mãng cầu xiêm. Các phương pháp này không chỉ giúp bảo toàn hoạt tính sinh học mà còn tối ưu hóa hiệu quả chiết xuất.

3.1. Kỹ Thuật Chiết Lỏng Lỏng

Phương pháp chiết lỏng - lỏng là một trong những kỹ thuật hiệu quả để tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ mãng cầu xiêm. Kỹ thuật này giúp thu được các hợp chất với độ tinh khiết cao.

3.2. Kỹ Thuật Chiết Rắn Lỏng

Kỹ thuật chiết rắn - lỏng cũng được áp dụng để chiết xuất các hợp chất từ mãng cầu xiêm. Phương pháp này giúp tăng cường hiệu quả chiết xuất và giảm thiểu thời gian thực hiện.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hợp Chất Từ Mãng Cầu Xiêm

Hợp chất chiết xuất từ mãng cầu xiêm không chỉ được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm mà còn trong dược phẩm và mỹ phẩm. Những sản phẩm này mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe và làm đẹp.

4.1. Sản Phẩm Thực Phẩm Chức Năng

Các sản phẩm thực phẩm chức năng từ mãng cầu xiêm đang ngày càng được ưa chuộng nhờ vào khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn. Những sản phẩm này giúp nâng cao sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

4.2. Ứng Dụng Trong Ngành Mỹ Phẩm

Hợp chất từ mãng cầu xiêm cũng được sử dụng trong ngành mỹ phẩm nhờ vào khả năng chống lão hóa và làm sáng da. Các sản phẩm này giúp cải thiện tình trạng da và mang lại vẻ đẹp tự nhiên.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Nghiên Cứu Hợp Chất Từ Mãng Cầu Xiêm

Nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên từ mãng cầu xiêm đang mở ra nhiều triển vọng mới trong việc phát triển các sản phẩm an toàn và hiệu quả cho sức khỏe con người. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cộng đồng.

5.1. Tiềm Năng Nghiên Cứu Thêm

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất trong mãng cầu xiêm để khai thác tối đa tiềm năng của chúng trong y học và thực phẩm.

5.2. Hướng Đi Mới Trong Phát Triển Sản Phẩm

Việc phát triển các sản phẩm từ mãng cầu xiêm không chỉ giúp nâng cao giá trị kinh tế mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong cơ thể sinh vật, các gốc tự do (nhóm các dạng oxy và nitơ hoạt tính - ROS và RNS) là những nguyên tử hoặc phân tử mang điện tử độc thân, có khả năng phản ứng oxy hóa rất cao. Khi trạng thái mất cân bằng giữa gốc tự do và hệ thống chất chống oxy hóa xảy ra (stress oxy hóa), các gốc tự do dư thừa sẽ tấn công và gây tổn hại nghiêm trọng đến màng lipid, protein và DNA, dẫn tới nhiều bệnh lý thoái hóa mạn tính như xơ vữa động mạch, bệnh Parkinson, Alzheimer, ung thư và quá trình lão hóa sinh học. Việc tăng cường chế độ dinh dưỡng giàu các chất chống oxy hóa tự nhiên và khai thác các nguồn dược liệu thực vật để trung hòa gốc tự do là một hướng tiếp cận quan trọng trong hóa học các hợp chất tự nhiên, công nghệ thực phẩm và dược phẩm.

Cây mãng cầu xiêm (Annona muricata L., thuộc họ Annonaceae) là loài thực vật nhiệt đới đã được nhiều nghiên cứu quốc tế chứng minh chứa nhiều nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học quý như acetogenin, alkaloid, flavonoid, tannin, phenolic, có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm, hạ huyết áp và ức chế tế bào ung thư. Tại Việt Nam, mãng cầu xiêm được trồng phổ biến tại các tỉnh Nam Bộ và Nam Trung Bộ, chủ yếu được sử dụng dưới dạng quả tươi ăn trực tiếp hoặc chế biến nước giải khát quy mô nhỏ, trong khi việc khảo sát định tính, định lượng các hợp chất tự nhiên và đánh giá hoạt tính sinh học từ thịt quả vẫn chưa được quan tâm khai thác đầy đủ.

Đề tài khóa luận "Khảo sát một số hợp chất tự nhiên, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn từ thịt quả mãng cầu xiêm" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

1. Định tính các lớp hợp chất tự nhiên chính (phenolic, tannin, flavonoid, alkaloid, coumarin, saponin, terpenoid) có trong dịch chiết thịt quả mãng cầu xiêm.
2. Xác định các chỉ tiêu hóa lý cơ bản của thịt quả mãng cầu xiêm bao gồm giá trị pH, hàm lượng chất khô hòa tan (TSS), hàm lượng acid tổng và tổng nồng độ các hợp chất có tính khử.
3. Định lượng hàm lượng vitamin C (acid ascorbic) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và định lượng hàm lượng phenolic tổng số bằng phương pháp đo quang phổ với thuốc thử Folin-Ciocalteu.
4. Đánh giá lực kháng oxy hóa tổng theo mô hình phosphomolybdenum và khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH (xác định giá trị $SC_{50}$).
5. Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thịt quả đối với chủng vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch.

• Đối tượng nghiên cứu: Thịt quả mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) ở hai trạng thái quả chín và quả chưa chín.
• Phạm vi nghiên cứu: Mẫu quả mãng cầu xiêm thu mua có nguồn gốc từ nhà vườn tỉnh Đắk Lắk (trọng lượng 1–2 kg, đường kính 15–25 cm). Các thí nghiệm hóa lý, phân tích hóa học và vi sinh được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Khoa Hóa học và Phòng Thí nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng; thời gian hoàn thành khóa luận vào tháng 04 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về hóa học các hợp chất tự nhiên chuyển hóa thứ cấp trong thực vật (phenolic, flavonoid, alkaloid, terpenoid, coumarin, saponin, tannin, acetogenins), cơ chế phản ứng khử - oxy hóa của các chất khử tự nhiên, cơ chế bắt giữ gốc tự do bền DPPH ($2,2\text{-diphenyl-}1\text{-picrylhydrazyl}$) và phản ứng tạo phức phosphomolybdenum khử.

Các phương pháp phân tích và quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

• Phương pháp thu nhận dịch chiết: Thịt quả sau khi gọt vỏ, loại bỏ hạt và xay nhuyễn được chiết xuất với dung môi ethanol 70° (tỷ lệ rắn:lỏng là 1:5 g/mL) có hỗ trợ của sóng siêu âm trong thời gian 20–30 phút ở nhiệt độ phòng (20–25°C), sau đó ly tâm tách cặn ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch chiết trong suốt.
• Phương pháp định tính hóa học: Áp dụng theo quy trình của Sofowora (1993) và Tiwari (2011) với các phản ứng màu và phản ứng tạo tủa đặc trưng:
  • Phenolic và tannin: Phản ứng tạo phức màu xanh đen với dung dịch $\text{FeCl}_3\ 5%$.
  • Flavonoid: Phản ứng tạo tủa vàng với dung dịch chì axetat $\text{Pb(CH}_3\text{COO)}_2\ 10%$.
  • Alkaloid: Phản ứng tạo tủa nâu đỏ với thuốc thử Wagner ($\text{I}_2/\text{KI}$).
  • Coumarin: Phản ứng mở vòng lacton tạo dung dịch màu vàng đậm với $\text{NaOH}\ 10%$.
  • Saponin: Phản ứng tạo nhũ tương bền dạng sữa với dầu oliu ở 90°C.
  • Terpenoid: Phản ứng Salkowski (dung môi $\text{CHCl}_3$ và $\text{H}_2\text{SO}_4$ đậm đặc) tạo màu đỏ gạch hoặc xanh lá.
• Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa lý:
  • Đo pH trực tiếp bằng máy đo pH điện tử.
  • Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (TSS) bằng khúc xạ kế Brix (thang đo 0–90°Bx).
  • Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích với dung dịch chuẩn $\text{NaOH}\ 0,0975\text{ N}$.
  • Xác định tổng hàm lượng hợp chất có tính khử bằng phương pháp chuẩn độ Iot – Thiosunfat (cho tác dụng với lượng dư dung dịch $\text{I}_2$, chuẩn độ $\text{I}_2$ dư bằng dung dịch chuẩn $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3\ 0,1\text{ N}$ với chỉ thị hồ tinh bột).
• Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS:
  • Định lượng phenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteu: Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 765 nm, sử dụng đường chuẩn acid gallic (khoảng nồng độ 1–5 mg/L), kết quả quy đổi về mg đương lượng acid gallic trên 100 g nguyên liệu tươi (mg GAE/100g).
  • Đánh giá lực kháng oxy hóa tổng theo mô hình Phosphomolybdenum: Dịch chiết phản ứng với hỗn hợp thuốc thử ($\text{H}_2\text{SO}_4\ 0,6\text{ M}$, $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 28\text{ mM}$, $(\text{NH}_4)_2\text{MoO}_4\ 4\text{ mM}$), ủ tối trong 90 phút, đo quang ở bước sóng 695–696 nm, quy đổi theo đường chuẩn acid gallic (100–500 mg/L).
  • Đánh giá năng lực loại bỏ gốc tự do DPPH: Phản ứng với dung dịch DPPH nồng độ 400 µg/mL trong ethanol 96°, đo độ suy giảm hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm sau 30 phút, tính phần trăm trung hòa gốc tự do (%SA), xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do ($SC_{50}$) và tính hoạt độ chống oxy hóa tổng số ($C$, đơn vị mmol đương lượng Vitamin C/100g).
• Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC): Định lượng vitamin C (acid ascorbic) trên hệ thống Agilent 1200 Series, cột ZoRBax Eclipse C18 ($250\text{ mm} \times 4,6\text{ mm ID} \times 5\text{ }\mu\text{m}$), đầu dò UV ở bước sóng 260 nm. Pha động gồm kênh A: dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ có $\text{pH} = 2,1\ (70%)$ và kênh B: acetonitrile (30%), tốc độ dòng 0,7 mL/phút, đường chuẩn acid ascorbic nồng độ 10–200 ppm.
• Phương pháp thử nghiệm vi sinh: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên môi trường thạch Luria-Bertani (LB) với chủng E. coli mật độ $10^6\text{ CFU/mL}$. Sử dụng kỹ thuật đục giếng thạch đường kính 15 mm, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đối chứng âm là nước cất vô trùng (1 mL), đối chứng dương là dung dịch kháng sinh tetracycline nồng độ 5 mg/mL (1 mL), đo đường kính vòng vô khuẩn (DKVVK) bằng hiệu số giữa đường kính vùng ức chế và đường kính giếng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu và tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu trong và ngoài nước về cây mãng cầu xiêm. Về mặt thực vật học, Annona muricata L. là loài cây gỗ nhỏ cao 5–8 m, lá hình bầu dục thuôn dài trơn bóng (dài 15–20 cm), hoa lưỡng tính tam phân màu vàng, quả hình tim hoặc thuôn dài nặng 1–6 kg với lớp vỏ có gai mềm và chứa 55–170 hạt đen. Thịt quả chứa khoảng 114 hợp chất bay hơi (ester, terpene, alcohol, aldehyde, ketone, acid) tạo nên hương vị đặc trưng.

Về thành phần dinh dưỡng, tổng quan chỉ ra trong 100 g thịt quả chín có 81,50% độ ẩm, 16,83% carbohydrate, 2,89% protein, 6,26% chất xơ, hàm lượng vitamin C đạt khoảng 22,59 mg/100g cùng các vitamin nhóm B (thiamin, riboflavin, niacin) và khoáng chất (Ca, P, Mg, K). Các hợp chất hóa học thứ cấp có hoạt tính sinh học phong phú bao gồm các alkaloid (annonaine, nornuciferine, asimilobine), acetogenin (muricin J, muricin K, muricin L, epomurinin), các hợp chất phenolic (caffeoylquinic acid, coumaric acid) cùng flavonoid, tannin và saponin.

Chương 1 cũng tổng quan cơ chế stress oxy hóa, tác hại của các gốc oxy hóa tự do và vai trò của các chất chống oxy hóa tự nhiên. Bên cạnh các công dụng trong y học cổ truyền (trị tiêu chảy, sỏi thận, hạ huyết áp, làm lành vết thương) và chế biến thực phẩm (nước ép, mứt, sinh tố, trà), tài liệu nhấn mạnh cảnh báo độc tính thần kinh của nhóm chất acetogenin (đặc biệt là annonacin có nhiều trong hạt), khả năng gây kích thích tử cung ở phụ nữ mang thai và khuyến cáo liều dùng thịt quả an toàn khoảng 50 g/ngày.

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất đạt độ tinh khiết phân tích, nguồn nguyên liệu mãng cầu xiêm Đắk Lắk và sơ đồ quy trình thực nghiệm. Tác giả trình bày các công thức toán học và quy trình vận hành cụ thể cho từng phép thử:

• Quy trình chiết mẫu với ethanol 70° hỗ trợ siêu âm.
• 6 phản ứng định tính hóa học xác định các lớp chất.
• Phương pháp chuẩn độ thể tích đo acid tổng và chất khử tổng.
• Phương pháp xây dựng đường chuẩn đo quang UV-VIS xác định phenol tổng và lực kháng oxy hóa tổng.
• Điều kiện chạy máy sắc ký lỏng cao áp HPLC (pha động, cột sắc ký, detector, tốc độ dòng) định lượng acid ascorbic.
• Công thức tính hệ số chuyển đổi Vitamin C ($TC = 566.059\text{ }\mu\text{g/g}$), hàm lượng hoạt độ chống oxy hóa $C$ ($\mu\text{mol TC/100g}$) và phần trăm trung hòa gốc tự do $%SA$ để suy ra giá trị $SC_{50}$.
• Bố trí thí nghiệm giếng thạch 3 lần lặp lại ngẫu nhiên để đo hoạt tính kháng vi khuẩn E. coli.

Chương 3: Thảo luận và kết quả

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được từ các phân tích định tính và định lượng trên mẫu thịt quả mãng cầu xiêm:

1. Kết quả định tính: Dịch chiết thịt quả cho phản ứng dương tính (+) rõ rệt với cả 6 nhóm hợp chất thử nghiệm:
   • Phenolic và tannin: Xuất hiện kết tủa màu xanh đen khi thêm $\text{FeCl}_3\ 5%$.
   • Flavonoid: Xuất hiện kết tủa màu vàng với $\text{Pb(CH}_3\text{COO)}_2\ 10%$.
   • Alkaloid: Tạo kết tủa màu nâu đỏ đặc trưng với thuốc thử Wagner.
   • Coumarin: Tạo dung dịch chuyển màu vàng khi thêm $\text{NaOH}\ 10%$ (màu vàng biến mất khi acid hóa).
   • Saponin: Tạo nhũ tương màu sữa bền khi đun nóng với dầu oliu ở 90°C.
   • Terpenoid: Xuất hiện màu đỏ gạch/xanh lá với thuốc thử Salkowski.
2. Các chỉ tiêu hóa lý:
   • Giá trị pH: Mẫu thịt quả chín có $\text{pH} = 3,65$; mẫu quả chưa chín có $\text{pH} = 4,70 - 5,88$.
   • Hàm lượng chất khô hòa tan (TSS): Đạt $26,0\ ^\circ\text{Bx}$ ở quả chín.
   • Hàm lượng acid tổng: Mẫu dịch chiết quả chín có nồng độ acid chuẩn độ là $0,039\text{ N}$ (cao hơn mẫu quả chưa chín là $0,0312\text{ N}$).
   • Tổng hàm lượng các hợp chất có tính khử: Chuẩn độ lượng $\text{I}_2$ dư tiêu tốn trung bình $8,2\text{ mL}\ \text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3\ 0,1\text{ N}$, tính ra tổng chất khử đạt $1,37\text{ mmol/100g}$ thịt quả chín.
3. Định lượng Vitamin C bằng HPLC: Tín hiệu sắc ký của mẫu dịch chiết xuất hiện pic acid ascorbic rõ nét tại thời gian lưu $T_R = 1,862\text{ phút}$ (diện tích pic $S = 649,6$). Phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn là $y = 14,376x - 296,79$ ($R^2 = 0,9809$). Hàm lượng vitamin C xác định được trong thịt quả mãng cầu xiêm chín là $32,00\text{ mg/100g}$ nguyên liệu tươi (cao hơn giá trị lý thuyết tham khảo là $22,59\text{ mg/100g}$).
4. Hàm lượng Phenol tổng:
   • Đường chuẩn acid gallic cho phương trình $y = 0,065x + 0,0379$ ($R^2 = 0,9956$).
   • Hàm lượng phenolic tổng số trong thịt quả chín đạt $66,75\text{ mg GAE/100g}$ thịt quả tươi; ở quả chưa chín đạt $36,817\text{ mg GAE/100g}$ (phương trình $y = 0,07x + 0,0316$, $R^2 = 0,9948$).
   • Kết quả này cao hơn mẫu quả chưa chín và mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc tham chiếu ($132\text{ mg GAE/100g}$ nấm khô), nhưng thấp hơn hàm lượng trong lá mãng cầu xiêm ($378\text{ mg/100g}$ lá).
5. Lực kháng oxy hóa tổng theo mô hình Phosphomolybdenum: Đường chuẩn acid gallic có phương trình $y = 0,0006x + 0,1152$ ($R^2 = 0,9506$). Lượng chất kháng oxy hóa quy đổi đạt $643,3\text{ mg GAE/100g}$ thịt quả chín (thấp hơn lá mãng cầu xiêm $10.502\text{ mg/100g}$ khoảng 16,32 lần và thấp hơn nấm Linh chi Hàn Quốc $6.927\text{ mg/100g}$ khoảng 10,84 lần).
6. Khảo sát hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH:
   • Hoạt độ chống oxy hóa tổng số của mẫu thử đạt $C = 344.616,7\text{ mmol Vitamin C/100g}$ thịt quả chín.
   • Phương trình hồi quy phần trăm trung hòa gốc tự do của chất chuẩn acid ascorbic: $y = 2 \times 10^6 x + 5,4888$ ($R^2 = 0,9986$), tính ra giá trị $SC_{50} = 2,225 \times 10^{-5}\text{ mol/L}$.
   • Phương trình hồi quy của dịch chiết thịt quả mãng cầu xiêm chín: $y = 304.613x + 31,62$ ($R^2 = 0,8564$), tính ra giá trị $SC_{50} = 6,0338 \times 10^{-5}\text{ mol/L}$.
   • Nhận xét: Do giá trị $SC_{50}$ của dịch chiết cao hơn chất chuẩn acid ascorbic nên khả năng dập tắt gốc tự do DPPH của dịch chiết thô thấp hơn acid ascorbic tinh khiết.
7. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với E. coli: Thử nghiệm khuếch tán qua giếng thạch cho thấy dịch chiết thịt quả mãng cầu xiêm chín tạo ra đường kính vòng vô khuẩn là $1,5\text{ cm}$, cao hơn đáng kể so với mẫu đối chứng âm nước cất ($0,5\text{ cm}$) và đạt hiệu lực ức chế vi khuẩn tương đương hơn một nửa so với kháng sinh đối chứng dương tetracycline 5 mg/mL ($2,6\text{ cm}$).

Bảng tổng hợp các chỉ tiêu hóa lý và hoạt tính sinh học của thịt quả mãng cầu xiêm chín trong khóa luận:

STT	Chỉ tiêu khảo sát	Kết quả phân tích thực nghiệm	Đơn vị tính
1	Giá trị pH	3,65	—
2	Hàm lượng chất khô hòa tan (TSS)	26,0	°Bx
3	Nồng độ acid tổng	0,039	N
4	Tổng hàm lượng chất khử	1,37	mmol/100g thịt quả
5	Hàm lượng vitamin C (HPLC)	32,00	mg/100g thịt quả
6	Hàm lượng phenolic tổng số	66,75	mg GAE/100g thịt quả
7	Kháng oxy hóa tổng (Phosphomolybdenum)	643,3	mg GAE/100g thịt quả
8	Nồng độ trung hòa 50% gốc DPPH ($SC_{50}$)	$6,0338 \times 10^{-5}$	mol/L
9	Đường kính vòng vô khuẩn kháng E. coli	1,5	cm

Chương 4: Kết luận và hướng phát triển đề tài

Chương 4 đúc kết các phát hiện thực nghiệm chính khẳng định thịt quả mãng cầu xiêm chín là nguồn nguyên liệu thực vật giàu hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học, có khả năng kháng oxy hóa và ức chế vi khuẩn E. coli. Trên cơ sở đó, tác giả nêu ra 4 định hướng mở rộng đề tài trong tương lai.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

Khóa luận đã định lượng và xác lập được hệ thống dữ liệu thực nghiệm toàn diện về thịt quả mãng cầu xiêm:

• Xác định sự hiện diện đồng thời của 6 nhóm hoạt chất thứ cấp: phenolic, tannin, flavonoid, alkaloid, coumarin, saponin, terpenoid.
• Xác định nồng độ các chất khử tự nhiên đạt $1,37\text{ mmol/100g}$ quả tươi; hàm lượng acid ascorbic định lượng bằng HPLC đạt $32,00\text{ mg/100g}$ (cao hơn $0,059\text{ mg/g}$ so với mức $22,59\text{ mg/100g}$ trong các tài liệu tham khảo trước đó).
• Xác định hàm lượng phenolic tổng số ở quả chín ($66,75\text{ mg GAE/100g}$) cao gấp 1,81 lần so với quả chưa chín ($36,817\text{ mg GAE/100g}$).
• Đo lường năng lực chống oxy hóa tổng số đạt $643,3\text{ mg GAE/100g}$ theo mô hình Phosphomolybdenum; hoạt độ chống gốc tự do DPPH đạt $C = 344.616,7\text{ mmol Vitamin C/100g}$ với $SC_{50} = 6,0338 \times 10^{-5}\text{ mol/L}$.
• Chứng minh khả năng kháng khuẩn in vitro đối với vi khuẩn đường ruột E. coli với đường kính vòng vô khuẩn $1,5\text{ cm}$.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tận dụng nguồn thịt quả mãng cầu xiêm dồi dào trong nước làm nguyên liệu tự nhiên để nghiên cứu chiết xuất, phân lập các chất chống oxy hóa, chống gốc tự do và kháng khuẩn.
• Ứng dụng nguồn dịch chiết giàu hoạt tính này vào quy trình công nghệ sản xuất, chế biến thực phẩm chức năng và hỗ trợ phát triển các sản phẩm dược phẩm bảo vệ sức khỏe.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm phân tích sắc ký HPLC và quang phổ phân tích trực tiếp trên mẫu quả mãng cầu xiêm trồng tại Đắk Lắk (Việt Nam), bổ sung vào khoảng trống dữ liệu hóa thực vật vốn trước đây chủ yếu tập trung nghiên cứu trên bộ phận lá hoặc trên các giống mãng cầu xiêm ngoại nhập.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Quá trình chiết xuất chỉ mới khảo sát trên một hệ dung môi cố định (ethanol 70° hỗ trợ siêu âm), chưa so sánh hiệu suất thu hồi giữa các loại dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ mới thực hiện trên 01 chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli), chưa mở rộng sang các chủng vi khuẩn Gram dương hoặc vi nấm gây bệnh khác.
• Hoạt tính chống oxy hóa mới được đánh giá qua hai mô hình in vitro (Phosphomolybdenum và DPPH), chưa phân lập tinh khiết từng đơn chất cụ thể trong dịch chiết.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Nghiên cứu khảo sát chiết tách các hợp chất sinh học từ thịt quả mãng cầu xiêm với nhiều loại dung môi và phương pháp chiết khác nhau để tối ưu hóa hiệu suất trích ly.
2. Mở rộng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng các mô hình thực nghiệm bổ trợ khác như phương pháp bắt gốc tự do $\text{ABTS}^{\bullet+}$, năng lực khử $\text{H}_2\text{O}_2$, năng lực khử sắt (FRAP) để đánh giá toàn diện các cơ chế dập tắt gốc tự do.
3. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau, kết hợp phương pháp Monks nhằm thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào in vitro.
4. Nghiên cứu toàn diện hơn về hoạt tính sinh học, khả năng kháng khuẩn và độc tính trên các bộ phận khác nhau của cây (lá, vỏ quả, hạt), hướng đến phân lập các hợp chất có hoạt tính cao phục vụ công nghiệp dược phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành Hóa Dược, Hóa học phân tích, Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học: Tham khảo quy trình thực nghiệm chiết xuất có hỗ trợ sóng siêu âm, các phản ứng định tính hóa thực vật cổ điển theo Sofowora và Tiwari.
• Người nghiên cứu các đề tài về hoạt tính sinh học tự nhiên: Tham khảo phương pháp chuẩn độ Iot – Thiosunfat xác định chất khử, quy trình xây dựng đường chuẩn và điều kiện chạy máy HPLC phân tích acid ascorbic (cột C18, pha động $\text{H}_2\text{SO}_4/\text{acetonitrile}$), quy trình đo quang xác định phenol tổng và thử nghiệm DPPH, Phosphomolybdenum.
• Doanh nghiệp và nhà sản xuất chế biến nông sản thực phẩm: Tham khảo các số liệu chỉ tiêu hóa lý (pH, Brix, acid tổng, vitamin C) của thịt quả mãng cầu xiêm chín phục vụ thiết kế quy trình chế biến nước quả, sinh tố hoặc thực phẩm bổ sung.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hàm lượng vitamin C trong thịt quả mãng cầu xiêm chín được xác định bằng phương pháp HPLC trong khóa luận là bao nhiêu?
Hàm lượng vitamin C (acid ascorbic) xác định qua phương pháp HPLC (cột ZoRBax Eclipse C18, detector UV 260 nm, thời gian lưu $T_R = 1,862\text{ phút}$) là $32,00\text{ mg/100g}$ thịt quả tươi, cao hơn so với số liệu lý thuyết tham khảo ($22,59\text{ mg/100g}$).

2. Hàm lượng phenolic tổng số giữa thịt quả mãng cầu xiêm chín và chưa chín chênh lệch như thế nào?
Hàm lượng phenolic tổng số trong thịt quả chín đạt $66,75\text{ mg GAE/100g}$ thịt quả tươi, cao hơn rõ rệt so với thịt quả chưa chín ($36,817\text{ mg GAE/100g}$).

3. Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (giá trị $SC_{50}$) của dịch chiết thịt quả mãng cầu xiêm thể hiện như thế nào so với chất chuẩn acid ascorbic?
Nồng độ trung hòa 50% gốc tự do DPPH ($SC_{50}$) của dịch chiết thịt quả chín là $6,0338 \times 10^{-5}\text{ mol/L}$, cao hơn so với chất chuẩn acid ascorbic ($SC_{50} = 2,225 \times 10^{-5}\text{ mol/L}$), cho thấy hoạt tính dập tắt gốc tự do của dịch chiết thô thấp hơn chất chuẩn tinh khiết.

4. Khả năng ức chế vi khuẩn Escherichia coli của dịch chiết mãng cầu xiêm đạt mức độ nào trong thử nghiệm giếng thạch?
Dịch chiết thịt quả chín tạo ra đường kính vòng vô khuẩn đạt $1,5\text{ cm}$, cao hơn đối chứng âm nước cất ($0,5\text{ cm}$) và đạt hiệu lực ức chế tương đương hơn một nửa so với dung dịch kháng sinh chuẩn tetracycline $5\text{ mg/mL}$ ($2,6\text{ cm}$).

5. Những nhóm hợp chất tự nhiên nào đã được phát hiện dương tính trong thịt quả mãng cầu xiêm?
Phép phân tích định tính hóa học đã xác nhận sự có mặt của 6 nhóm hợp chất gồm: phenolic & tannin, flavonoid, alkaloid, coumarin, saponin và terpenoid.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thân đã hoàn thành việc khảo sát định tính 6 nhóm hợp chất tự nhiên và xác định hệ thống chỉ tiêu hóa lý, hóa sinh của thịt quả mãng cầu xiêm chín. Công trình đã định lượng thành công hàm lượng vitamin C ($32\text{ mg/100g}$) bằng phương pháp HPLC, hàm lượng phenolic tổng ($66,75\text{ mg GAE/100g}$) và chứng minh năng lực chống oxy hóa theo các mô hình Phosphomolybdenum, DPPH cùng khả năng kháng vi khuẩn E. coli. Đây là công trình thực nghiệm hóa dược cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy, làm tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng mãng cầu xiêm trong lĩnh vực chế biến thực phẩm và phát triển chế phẩm dược liệu tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VÀ TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tình hình nghiên cứu MCX trong và ngoài nước Trên thế giới đã có những nghiên cứu về trích xuất từ lá, hạt, quả, vỏ những chất hoạt tính sinh học có khả năng kháng khuẩn, hạ huyết áp, giảm đau, viêm khớp, cải thiện hệ tiêu hóa, điều trị và ngăn ngừa ung thư. Các hoạt tính sinh học cụ thể là các hợp chất của các nhóm acetogenin khác nhau, alkaloids, flavonoid, sterol. Hamid et al và cộng sự cũng đã thử nghiệm một chiết xuất ethanol của lá graviola cho các hoạt động chống viêm cấp tính và mãn tính đối với chuột.

Hơn 212 hợp chất hóa học đã được báo cáo trong chiết xuất từ lá MCX. Các tác giả cho biết rằng, dịch chiết trong ethanol có tác dụng làm giảm hiện tượng phù nề và giảm viêm khớp ở chuột do xylene [1, 2]. MCX có nguồn dinh dưỡng cao, chứa nhiều vitamin C, khoáng, xơ và có nhiều đặc tính sinh học quý giá (Trần Việt Hưng, 2011). Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện sản phẩm trà được làm từ lá và quả MCX tươi của công ty TNHH Cẩm Thiều (2017); nước cốt MCX của công ty TNHH Thuận Thiên Thành; có nhiều cơ sở bán lá MCX có hướng dẫn sử dụng theo kinh nghiệm dân gian.

Bên cạnh đó, công nghệ sản xuất bột trái MCX với kỹ thuật sấy lạnh đã được nghiên cứu bởi Nguyễn Đức Vượng và cộng sự (3/2019), [4]. Nhìn chung, việc nghiên cứu tận dụng nguồn nguyên liệu này để chế biến thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao vẫn chưa được quan tâm khai thác hiệu quả. Giới thiệu về mãng cầu xiêm Mãng cầu xiêm, tên khoa học là Annona muricata L., thuộc họ Annonaceae, có khoảng 150 loài, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới như Tây Ấn, Nam Châu Mỹ, Châu Phi, các đảo ở Thái Bình Dương, và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, MCX chủ yếu được trồng ở Nam Bộ, Nam Trung Bộ [5, 6].

Quả MCX là một loại trái cây được sử dụng phổ biến ở Châu Mỹ nhiệt đới, Úc, Châu Phi và Malaysia để chế biến thành nhiều sản phẩm khác như hỗn hợp nước trái cây, mật hoa, siro, mứt, thạch và kem [7, 8]. Trong thịt quả có khoảng 114 SVTH: Nguyễn Thị Thanh Thân Trang 2 GVHD: TS. Trần Đức Mạnh; Khoá luận tốt nghiệp Th.S Lê Thị Tuyết Anh hợp chất dễ bay hơi bao gồm 44 ester, 25 terpene, 10 alcohol, 9 aldehyde và ketone, 7 hợp chất thơm, 5 hydro-carbon, 3 acid, 3 lacton và 8 loại hợp chất khác là nguyên nhân tạo nên hương thơm ngon ngọt cho thịt quả [8]. Tất cả các phần lá, quả, hạt và rễ của MCX đã được sử dụng trong y học cổ truyền.

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hơn 80 % tổng dân số thế giới phụ thuộc vào các loại thuốc cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu của họ [6]. Các phương thuốc cổ truyền này chủ yếu dựa vào tác dụng của các hợp chất có hoạt tính sinh học như alkaloids, flavonoid, tannin và các hợp chất phenolic có trong các bộ phận lá, quả, hạt, rễ của MCX. Ở các nước nhiệt đới đang phát triển bao gồm Châu Phi, Jamaica và Trinidad, đã sử dụng các bộ phận khác nhau của MCX để điều trị các bệnh như tiểu đường, ho, bệnh ngoài da và ung thư [2]. Ngoài ra, nó còn được đề cập đến như một chất chống vi trùng, chống đái tháo đường, chống viêm, chất chống oxy hóa, thuốc trừ sâu, thuốc diệt ấu trùng, và chất chống ung thư.

Ở Brazil, nước ép quả MCX được dùng làm thuốc tẩy giun sán, trị tiêu chảy và kiết lỵ [8].