MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiêt của đề tài Gan là một nội quan lớn của cơ thể người và động vật, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình trao đổi chất, thải độc và là cơ quan miễn dịch quan trọng của cơ thể. Máu cung cấp cho gan từ hai nguồn, khoảng 75% lưu lượng máu đi đến gan là từ các bộ phận của hệ tiêu hóa, lách thông qua tĩnh mạch cửa và 25% còn lại từ động mạch gan. Chính vì vậy, áp suất riêng phần của oxi trong máu mang đến cung cấp cho gan rất thấp.
Ngoài ra, gan nhận các chất, trao đổi chất và chuyển hóa các chất từ máu mang đến. Do đó gan thường xuyên tiếp xúc với nội độc tố, các chất độc, vi khuẩn, virut. đây là những nguyên nhân làm gan tổn thương và dẫn đến các bệnh về gan (Higuchi và Gores, 2003). Các độc tố khi vào gan, kích thích tế bào gan sản xuất các cytokine tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-), interleukin-6 (IL-6) và interleukin-10 (IL- 10)…đóng vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch và gây chết tế bào.
Các cytokine tiền viêm gây ra phản ứng viêm gan, khởi động cho quá trình tự điều chỉnh để chữa bệnh. Tuy nhiên nếu tình trạng viêm không giảm sau một thời gian ngắn, việc sản xuất các cytokine liên tục sẽ dẫn đến sự hình thành xơ hóa và xơ gan (Mannaa và Abdel-Wahhab, 2016). Do đó, có thể thông qua việc điều chỉnh quá trình sản xuất và hoạt động của các cytokine để bảo vệ gan. Bên cạnh đó, stress oxy hóa cũng là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tổn thương và hoại tử tế bào gây ra trong bệnh về gan.
Các gốc oxy hóa như hydroxyl, anion superoxide và hidrogen peroxide… phá hủy mô gan, gây tổn thương tế bào thông qua quá trình peroxy hóa lipid màng, đột biến ADN (Cochrane, 1991). Vì vậy, việc tìm ra các tác nhân có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp có hoạt tính chống oxy hóa được đề xuất để ngăn ngừa và điều trị bệnh gan do stress oxy hóa. Cây thảo dược đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Các loại thuốc được chiết xuất từ thảo dược được dùng phổ biến trong điều trị bệnh, trong đó có bệnh gan do hiệu quả, mức an toàn và chi phí hợp lý.
Cơ chế bảo vệ gan LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 của các loại thảo dược thường thông qua hoạt động chống oxy hóa, kháng virus, chống viêm, chống xơ và các hoạt động miễn dịch. Tuy nhiên, chỉ có một số các dịch chiết và một số các hợp chất được phân lập từ các loài thảo dược đã được khảo sát, đánh giá hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan trong các mô hình in vitro, ex vivo và in vivo. Hầu hết các loại thảo dược đều chưa được thử nghiệm để chứng minh hiệu quả bảo vệ gan mặc dù được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và trong dân gian (Dhiman và Chawla, 2005). Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng.
Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 5.117 loài và dưới loài thực vật bậc cao có mạch được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh (Viện Dược liệu, 2017). Đây là nguồn dược liệu quý cần được nghiên cứu, khai thác sử dụng có hiệu quả và bảo tồn, phát triển bền vững cho cộng đồng. Trong số những loài đã được phát hiện, cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus), cây Nhó đông (Morinda longissima), cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus) là những cây được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian để điều trị bệnh trong đó có bệnh gan. Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của ba loại cây này sẽ bổ sung thêm nguồn nguyên liệu dược liệu sử dụng trong quá trình hỗ trợ, điều trị bệnh gan.
Xuất phát từ nhữnglý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đông (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus)Việt Nam với các mục tiêu sau: 1. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ các dịch chiết của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông, lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam. Chiết tách và phân lập một số hợp chất từ 3 loài thực vật này, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro của các hợp chất được phân lập Đề tài này là cần thiết, đóng góp vào việc nghiên cứu về hoạt tính bảo vệ gan, chống oxy hóa của các dịch chiết, phát hiện các hợp chất tinh khiết có tác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 dụng bảo vệ gan được tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam.
Các kết quả của đề tài góp phần giải thích về hoạt tính bảo vệ gan của các bài thuốc dân gian, nâng cao giá trị sử dụng của các loài cây này. Những đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên 4 hợp chất được phân lập từ quả Dứa dại và 3 hợp chất được phân lập rễ cây Nhó đông được tiến khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại tác động gây độc của CCl4. 11 hợp chất được phân lập từ lá Chùm ruột phân bố ở Việt Nam đã được xác định cấu trúc trong đó có một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Phyllanthus và một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên là kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl. Các hợp chất được tách chiết từ lá Chùm ruột đã được khảo sát hoạt tính chốg oxy hóa bảo vệ gan, trong đó hợp chất myricitrin thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh nhất thông qua hoạt động chống oxy hóa.
Đặc biệt hợp chất mới kaempferol- 3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-D- glucuronopyranosyl methyl ester có hoạt tính bảo vệ gan mạnh thông qua tác dụng ức chế các cytokine tiền viêm, hoạt động điều chỉnh hàm lượng các cytokine theo thời gian như TNF-α, IL-6, IL-10 trong con đường signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GAN VÀ MỘT SỐ BỆNH VỀ GAN 1. Cấu trúc của gan Gan là một tạng lớn nhất của cơ thể với trọng lượng trung bình khoảng 1500g, chiếm khoảng 2,5% trọng lượng cơ thể.
Gan nằm bên dưới cơ hoành, ở vị trí một phần tư bên phải khoang bụng, giữa dạ dày và tim. Mặt ngoài được phủ bởi phúc mạc. Dưới phúc mạc là áo xơ (tunica fibrosa). Ở cửa gan, áo xơ đi vào trong gan cùng các mạch tạo nên bao xơ quanh mạch (bao Glisson) (Robin và cs.
Gan được chia thành 4 thùy chính và 50. Mỗi tiểu thùy có dạng hình trụ có chiều dài vài milimet (mm) và đường kính có khi lên đến 2 mm. Ở mỗi góc tiểu thùy có một khoảng mô liên kết gọi là khoảng cửa chứa nhánh tĩnh mạch cửa, nhánh động mạch gan và ống dẫn mật. Ở trung tâm của mỗi tiểu thùy gan có tĩnh mạch trung tâm.
Từ tĩnh mạch trung tâm có những đôi dây tế bào gan hình lập phương tỏa ra ngoại vi. Giữa hai đôi dây tế bào gan liền nhau là những mao mạch dạng xoang dẫn máu từ nhánh tĩnh mạch cửa và nhánh động mạch gan ở khoảng cửa tới tĩnh mạch trung tâm. Thành của mao mạch dạng xoang được tạo ra bởi các tế bào nội mô. Tĩnh mạch trung tâm của các tiểu thùy hợp lại thành tĩnh mạch lớn hơn và cuối cùng tạo thành tĩnh mạch gan chạy ra khỏi gan và đổ vào tĩnh mạch chủ dưới.
Ngoài ra, giữa các đôi dây tế bào gan là các vi quản mật, có đầu ngoại vi đổ vào ống mật ở khoảng cửa (ống gian tiểu thùy). Các ống mật ở khoảng cửa hợp nên những ống mật lớn dần và cuối cùng thành các ống gan phải và ống gan trái đi ra khỏi gan (Nguyễn Văn Huy và cs., 2007; Robin và cs. Gan được cấu tạo bởi tế bào nhu mô gan hay còn gọi là tế bào gan và các tế bào không phải là tế bào nhu mô như tế bào Kupffer, tế bào hình sao, tế bào nội mô xoang, tế bào đuôi gai (Robin và cs. Tế bào gan chiếm khoảng 70-80% số lượng tế bào có trong gan và tham gia hầu hết các chức năng quan trọng, đặc trưng của gan như: chuyển hóa glucid, lipid, LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 protein, dự trữ các chất dinh dưỡng, giải độc trong máu trước khi chất độc tham gia vào vòng tuần hoàn và tạo mật (Duncan và cs.
Ngoài ra, tế bào gan tham gia tổng hợp hormon, thrombopoietin, ethythropoientin và chúng còn tổng hợp các cytokine như IL-8, IL-6 trong giai đoạn viêm cấp tính. Tuy nhiên, khi hoạt động bảo vệ không thể chống trả lại tác động của các yếu tố gây hại, tế bào nhu mô gan bắt đầu tổng hợp chemokine nhằm thu hút các tế bào kháng viêm như bạch cầu có hạt, đại thực bào đơn nhân và kích hoạt các đại thực bào cư trú tại gan (Ramadori và cs. Khi tế bào nhu mô gan dày lên là biểu hiện hoạt động tái sinh, tuy nhiên trong trường hợp tổn thương gan, sự dày lên của tế bào gan dấu hiệu của việc xuất hiện các khối u. Ngoài ra, các tế bào gan nằm sát với cửa tĩnh mạch tạo thành một lớp màng và sẽ biểu hiện các hoạt động viêm, trong tình trạng tổn thương hay viêm (Krithika,1013).
Tế bào Kupffer là tế bào miễn dịch nằm trong huyết quản chiếm khoảng 80- 90% loại tế bào đại thực bào trong hệ thống lưới nội mô, khoảng 15% trong tổng số tế bào gan (Suraweera và cs. Tế bào Kupffer đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chức năng sinh lý và cân bằng nội môi của gan, cũng như tham gia vào các phản ứng cấp và mạn tính của gan. Tế bào này có khả năng loại bỏ vi khuẩn, virus, phức hợp fibrin – fibrinnogen, hồng cầu bị hư hỏng (Canbay và cs., 2003; Roberts và cs. Tế bào Kupffer có thể hoạt động như tế bào trình diện kháng nguyên (antigen - presenting cell) và tham gia kiểm soát khối u cũng như quá trình tái sinh gan, nó đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh và bảo vệ gan thông qua sự sản xuất, bài tiết các chất trung gian gây phản ứng viêm.
(Kolios và cs. Tế bào hình sao (Hepatic Stellate Cell: HSC) là những tế bào trung mô đặc trưng ở gan nằm trong khoảng Disse (khoảng giữa tế bào gan và tế bào nội mô xoang mạch), chiếm khoảng từ 5-8% tổng số tế bào gan.