CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vị trí phân loại G.xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào.[8] Theo khóa phân loại của Bergey, G.xylinus thuộc: • Lớp: Schizomycetes • Bộ: Pseudomonadales • Bộ phụ: Pseudomonadieae • Họ: Pseudomonadaceae 1.
Đặc điểm vi khuẩn G.xylinus có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng 0,6- 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, Khóa luận tốt nghiệp đại học sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh[9]. “Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 – 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 – 5 mm, tròn, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn G.xylinus là loài vi khuẩn hiếu khí.
Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển từ 25 – 300C. Ở nhiệt độ 370C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ thích hợp nhất là 250 C. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3- 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5.xylinus sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8,9].
4 Khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường. “Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 – 48 giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 – 19 ngày. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus Môi trường nuôi cấy G.xylinus là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường của G.xylinus là rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía, nước vo gạo,. để làm nguyên liệu trong nuôi cấy G. Trong đó có thể sử dụng cả nước cất làm môi trường chuẩn và đây được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy G. Thành phần môi trường chuẩn: Khóa luận tốt nghiệp đại học Thành phần Khối lượng Glucose 20 g Pepton 5g Diamoni photphat 2,7 g Cao nấm men 5g Acid citric 1,5 g Acid acetic 2% Nước cất 2 lần 1000 ml Dịch giống 10% 5 Bảng 1.2: Thành phần môi trường nước vo gạo Thành phần Khối lượng Glucose 20 g Pepton 10 g Diamoni photphat 0,3 g Amoni sulfat 0,5 g Nước vo gạo 1000 ml Bảng 1.3: Thành phần nước dừa già Thành phần Khối lượng Glucose 20 g Pepton 10 g Khóa luận tốt nghiệp đại0,3học Diamoni photphat g Amoni sulfat 0,5 g Nước dừa già 1000 ml 1.
Neomycin Sulfate Tên quốc tế: Neomycin Sulfate Loại thuốc: Là dạng muối sulfat của neomycin, một kháng sinh nhóm aminoglycoside Công thức hóa học: C23H46N6O13.XH2SO4 Neomycin là một kháng sinh aminoglycoside được tìm thấy trong nhiều loại 6 thuốc bôi tại chỗ như kem, thuốc mỡ và thuốc nhỏ mắt. Neomycin được phát hiện từ năm 1949. Chúng được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của nhà khoa học Selman Waksman. Neomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside có chứa hai hoặc nhiều đường amino liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic [11].
Neomycin thường được sử dụng như dưới dạng thuốc bôi tại chỗ, chẳng hạn như Neosporin. Chúng cũng có thể được uống, nếu dùng theo cách này thì neomycin thường được kết hợp với các thuốc kháng sinh khác. Neomycin không được hấp thụ qua đường tiêu hóa và được sử dụng như một biện pháp dự phòng cho bệnh não gan và tăng cholesterol máu. Bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong đường ruột, kháng sinh này giúp giữ mức amoniac thấp và ngăn ngừa bệnh não gan, đặc biệt là trước khi phẫu thuật GI.
Chúng hoạt động để tiêu diệt vi khuẩn kháng streptomycin, kể cả trong trường hợp các vi khuẩn lao. Thuốc này cũng đã được sử dụng để điều trị sự phát triển quá mức của các vi khuẩn ruột non. Chúng không được tiêm, vì neomycin cực kỳ độc thận (gây ra tổn thương thận), ngay cả khi so sánh với các aminoglycosid khác[12]. Ngoại lệ là khi neomycin được tích hợp, với lượng rất nhỏ, như một chất bảo quản trong một số vaccine-thường là 25 μg mỗi liều.
“Thuốc này được sử dụng để làm giảm nguy cơ nhiễm trùng sau khi phẫu thuật Khóa luận tốt nghiệp đại học đường ruột. Neomycin thuộc nhóm thuốc kháng sinh aminoglycoside. Nó hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn trong ruột. Neomycin cũng có thể được sử dụng kết hợp với chế độ ăn uống đặc biệt để điều trị một vấn đề nghiêm trọng trong não (bệnh não gan).
Tình trạng này được gây ra do sự tạo thành quá nhiều một vài chất tự nhiên (amoniac). Thông thường, gan sẽ đào thải amoniac, nhưng bệnh gan có thể tạo ra quá nhiều amoniac bện trong cơ thể [11]. Thuốc này giúp điều trị bệnh não bằng cách giết chết các vi khuẩn đường ruột nhất định tạo ra amoniac.” “Thuốc này chỉ điều trị chứng nhiễm khuẩn. Thuốc sẽ không hiệu quả cho chứng nhiễm virus (như cảm lạnh thông thường, cúm).
Việc sử dụng không cần thiết hoặc lạm dụng bất kỳ kháng sinh nào có thể dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc. Lịch sử nghiên cứu đề tài 1. Tình hình trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng VCK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.
CVK là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở Việt Nam đòi hỏi sản xuất CVK với quy 7 mô công nghiệp, tạo CVK với độ bền chắc hơn, phát triển nhanh trong các loại môi trường khác nhau [13]. Tại Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum” [14]. “Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc neomycin sulfate trong chữa bệnh, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí. Màng CVK có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo hệ thống hấp thụ thuốc neomycin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn.” Neomycin sulfate có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4 năm 1999.
Neomycin sulfate được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một sô hoạt chất khác. Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng CVK để hấp thuốc Neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu [14]. Tình hình trên thế giới “ Trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng màng CVK trong Khóa luận tốt nghiệp đại học nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm,.) lĩnh vực y học (tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da,. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.
Vật liệu nghiên cứu 2. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu so sánh khả năng giải phóng thuốc của vật liệu Cellulose nạp Neomycin sufate tạo ra từ Gluconacetobacter xilinus nuôi trong một số môi trường. Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu: nước vo gạo, nước dừa già, thuốc neomycin sulfate Hóa chất: Các hóa chất đặc biệt như cao nấm men, pepton. Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphat, acid acetic, NaOH, HCl, đường glucose.
Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: - Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA Khóa - Máy đoluận quang phổtốt nghiệp UV - 2450 đại (Shimadzu - Nhật Bản)học - Cân phân tích (Sartorius - Thụy Sĩ) - Cân kỹ thuật - Sartorrius TE 3102 S - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) - Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức) - Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh) - Bể ổn nhiệt (Đức) Dụng cụ: - Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml - Micropipet 20-200 µl 9 - Hộp nhựa và đĩa 24 giếng để lên men tạo vật liệu CVK có các kích thước: 10 x15 cm, 3 x 5 cm, 1,5 x 1,5 cm, bình tam giác, ống nghiệm và các dụng cụ hóa sinh khác. Phương pháp nghiên cứu 2. Chuẩn bị màng CVK 2. Lên men thu màng CVK thô Môi trường lên men thu màng CVK Bảng 2.
Thành phần các môi trường thu màng CVK Môi trường MT1 MT2 MT3 Thành phần Glucose 20 g 30 g 30 g Pepton 5g 10 g 10 g Disodium phosphate 2.3 g KhóaAmoni luậnsulfat tốt nghiệp đại 0.5 g Cao nấm men 5g Acid citric 1.5 g Nước cất 2 lần 1000 ml Nước dừa già 1000 ml Nước vo gạo 1000 ml Các bước lên men thu màng CVK từ một số môi trường - Bước 1: Môi trường được chuẩn bị theo Bảng 2. - Bước 2: Các môi trường được hấp khử trùng ở 1130C trong 15 phút. - Bước 3: Các môi trường sau khi lấy ra sẽ được khử trùng bằng tia UV trong 15 phút và để nguội môi trường. - Bước 4: Thêm 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều cho giống phân bố đều trong dung dịch.
- Bước 5: Bịt miệng lọ bằng gạc vô trùng sau đó ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày ở 260C. 10 - Bước 6: Thu màng CVK thô và rửa sạch dưới vòi nước. Chọn màng CVK có độ dày từ 0,3 - 0,5 cm làm hấp thụ và giải phóng thuốc. Tạo màng CVK tinh chế - Sau khi màng được ủ tĩnh ở 26°C trong 6 - 14 ngày, đem màng CVK nhúng vào nước cất 2 ngày, sau đó lấy màng CVK đem tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy trình ở HÌNH 2.