CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát chung về thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp sàng lọc di truyền trước làm tổ 1. Khái quát chung về thụ tinh trong ống nghiệm Thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization:IVF) là kỹ thuật cho tinh trùng kết hợp với noãn trong ống nghiệm thay vì trong vòi tử cung của người phụ nữ. Kỹ thuật này được chỉ định cho các trường hợp tắc nghẽn ống dẫn trứng; đã điều trị thụ tinh nhân tạo nhiều lần thất bại; bệnh nhân làm sàng lọc di truyền trước làm tổ; trường hợp xin noãn; bệnh nhân tinh trùng ít, yếu, dị dạng hoặc không có tinh trùng trong tinh dịch, phải thu tinh trùng từ mào tinh, tinh hoàn.
Quy trình kỹ thuật IVF bao gồm các bước: Kích thích buồng trứng, chọc hút lấy noãn, cho noãn kết hợp với tinh trùng, nuôi cấy phôi và chuyển phôi vào buồng tử cung. Phôi được chuyển vào buồng tử cung cho bệnh nhân có thể là phôi tươi hoặc phôi đã rã đông sau trữ lạnh. Kỹ thuật IVF được thực hiện thành công trên thế giới với sự ra đời của em bé đầu tiên tại Anh năm 1978. Vào năm 1998, ba em bé đầu tiên ở Việt Nam đã được sinh ra nhờ kỹ thuật này tại Bệnh viện Từ Dũ, Thành phố Hồ Chí Minh [12], [13].
Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước làm tổ Với sự phát triển không ngừng của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, các nhà khoa học nhận thấy nhiều trường hợp sau chuyển phôi, mặc dù các phôi chuyển có đặc điểm hình thái tốt nhưng liên tiếp làm tổ thất bại hoặc phôi làm tổ nhưng không phát triển gây tình trạng sảy thai liên tiếp, nặng nề nhất là các trường hợp phôi phát triển thành em bé mang bệnh lý di truyền nghiêm trọng do bất thường nhiễm sắc thể (NST). Từ thực tiễn đó, xét nghiệm di truyền trước làm tổ ra đời kết hợp cùng kỹ thuật IVF đã đưa lĩnh vực hỗ trợ sinh sản lên một tầm cao mới, không chỉ dừng lại ở điều trị cho các bệnh nhân không 4 thể mang thai, mà còn điều trị cho những bệnh nhân có thể mang thai nhưng không thể giữ thai hoặc không thể sinh ra những em bé khoẻ mạnh. Song hành cùng xét nghiệm sàng lọc di truyền trước làm tổ là các kỹ thuật tầm soát NST phôi. Theo thời gian, các kỹ thuật này ngày càng phát triển.
- Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): Ban đầu, xét nghiệm sàng lọc di truyền trước làm tổ được gọi là PGS (Preimplantation Genetic Screening) ứng dụng kỹ thuật FISH với ca thành công đầu tiên trên người vào năm 1995 [14]. Tuy nhiên kỹ thuật FISH thực hiện khó, đòi hỏi chuyên viên nhiều kinh nghiệm, đồng thời cũng bộc lộ nhiều nhược điểm khác, trong đó nhược điểm lớn của FISH là không tầm soát được toàn bộ 24 NST, dần dần kỹ thuật này không còn được áp dụng trong đánh giá NST phôi [15]. Thời gian sau, xét nghiệm PGS đổi tên thành PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy), kĩ thuật FISH cũng được thay thế lần lượt bởi các kỹ thuật khác: - Kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) là kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử được phát triển trong thập niên 1990. Kỹ thuật CGH khắc phục được nhược điểm của kỹ thuật FISH, có thể đánh giá được rối loạn số lượng toàn bộ NST phôi.
Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là vẫn vấp phải giới hạn về độ phân giải, chỉ cho phép phát hiện các bất thường nằm trong giới hạn 10 - 20Mb, do đó CGH chỉ có thể phát hiện được rối loạn số lượng NST và rối loạn cấu trúc không cân bằng. Thêm vào đó, thời gian phân tích kết quả của CGH lâu, khoảng 3 - 4 ngày. - Kỹ thuật aCGH (Microarray - based Comparative Genomic Hybridization): Lai so sánh hệ gen kết hợp microarray. Kỹ thuật aCGH ra đời đã giải quyết được những hạn chế tồn tại của CGH.
Kỹ thuật này có độ phân giải rất cao, có thể phát hiện được các trường hợp thừa hoặc mất các đoạn rất ngắn trong hệ gen. Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là không xác định được bất thường di truyền đơn gen, đặc biệt là các trường hợp bất thường 5 trong cấu trúc NST ở dạng cân bằng như chuyển đoạn cân bằng và đảo đoạn do không xảy ra tình trạng thừa hoặc thiếu vật liệu di truyền. Kĩ thuật aCGH cũng không thể phát hiện ra các trường hợp khảm có tỉ lệ khảm thấp hơn 10% với các trường hợp lệch bội và dưới 20 - 30% đối với bất thường cấu trúc NST dạng mất cân bằng. - Kỹ thuật NGS (Next Generation Sequencing) - kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới là bước tiến lớn trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, cho phép giải trình tự nguyên hệ gen với nhiều ưu điểm vượt trội, độ chính xác cao, thời gian cho kết quả nhanh.
Phôi được sàng lọc NST bằng kỹ thuật NGS cũng đã được chứng minh cho tỉ lệ làm tổ cao hơn và tỉ lệ thai sinh hoá thấp hơn có ý nghĩa so với phôi sàng lọc bằng kỹ thuật aCGH [16]. Hiện nay đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong tầm soát NST phôi tại Việt Nam cũng như trên thế giới. Chỉ định của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp sàng lọc di truyền trước làm tổ Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp sàng lọc di truyền trước làm tổ (IVF-PGT-A) giúp các nhà lâm sàng, các nhà phôi học lựa chọn được những phôi chuyển không mang bất thường NST, tuy nhiên phương pháp này chỉ có ý nghĩa đối với những bệnh nhân tiềm ẩn nguy cơ cao tạo phôi mang bất thường NST, không phù hợp áp dụng cho tất cả các cặp vợ chồng điều trị thụ tinh trong ống nghiệm [17]. Theo nhiều nghiên cứu, những trường hợp nên làm IVF-PGT-A bao gồm: - Tuổi mẹ cao (từ 35 tuổi trở lên).
- Có tiền sử thất bại làm tổ nhiều lần. - Có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp. - Chồng thiểu năng tinh trùng nặng hoặc tinh trùng thu được từ phẫu thuật [18]. Kỹ thuật sinh thiết phôi trong thụ tinh ống nghiệm kết hợp sàng lọc di truyền trước làm tổ Khi kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ngày càng phát triển, mối liên quan giữa hình thái và bất thường NST phôi là vấn đề rất được các nhà khoa học quan tâm.
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng hình thái phôi không hoàn toàn phản ánh được chất lượng thực của phôi, nhiều phôi đạt các tiêu chuẩn hình thái tốt nhưng thực chất lại mang bất thường NST. Ngược lại, một số nghiên cứu khác lại chứng minh có mối liên quan giữa chất lượng hình thái và bất thường NST phôi [19]. Sinh thiết phôi để sàng lọc hoặc chẩn đoán di truyền là kỹ thuật quan trọng giúp các nhà khoa học có nguồn nguyên liệu để nghiên cứu ngày càng sâu về vấn đề này. Cùng với kỹ thuật nuôi cấy phôi ngày càng tốt, kỹ thuật sinh thiết và thời điểm sinh thiết phôi cũng thay đổi nhằm hạn chế tối đa sự tác động lên phôi.
Ban đầu, sinh thiết phôi được thực hiện vào giai đoạn phôi phân cắt, tuy nhiên hiện nay, kỹ thuật này gần như đã được thay thế hoàn toàn bằng kỹ thuật sinh thiết phôi giai đoạn phôi nang tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Sinh thiết phôi giai đoạn phôi phân cắt Bệnh nhân có thai đầu tiên sau chuyển phôi sinh thiết giai đoạn phân cắt và sàng lọc di truyền được tác giả Handyside A. và cộng sự (CS) báo cáo năm 1990 [20]. Giai đoạn đầu, khi kỹ thuật nuôi cấy phôi còn hạn chế, sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt được áp dụng cho hầu hết tất cả các trường hợp sàng lọc, chẩn đoán di truyền phôi.
Vào ngày thứ 3 của tuổi phôi trước khi bước sang giai đoạn kết dính là giai đoạn phôi phân cắt với 8 phôi bào, lúc này các phôi bào chưa có sự biệt hoá thành các dòng tế bào khác nhau. Nhiều nghiên cứu tại thời điểm đó đã cho thấy dù mất đi 1 - 2 phôi bào cũng không làm ảnh hưởng đến sự phát triển và tỉ lệ làm tổ của phôi [21]. Tuy nhiên, sau đó, ngày càng nhiều nhà khoa học chứng minh sinh thiết thực hiện ở tuổi phôi này ảnh hưởng đến sự phát triển và tiềm năng làm tổ của phôi do phôi ở giai 7 đoạn phân cắt còn yếu ớt bởi bộ gen chưa được kích hoạt, đồng thời cũng chưa có sự biệt hoá của phôi bào [22], [23]. Vì thế, hiện nay kỹ thuật này rất ít được sử dụng.
Sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt * Nguồn: Boada M. Sinh thiết phôi nang Khi phôi phát triển tới giai đoạn phôi nang (thông thường vào ngày 5 hoặc ngày 6 của tuổi phôi), số lượng phôi bào trung bình là khoảng 60 tế bào vào ngày 5 của tuổi phôi và tăng lên 80 tế bào vào ngày 6 [25]. Phôi nang có số lượng phôi bào lớn, đồng thời các phôi bào lúc này cũng đã biệt hoá thành hai dòng tế bào: Các tế bào nụ phôi (Inner Cell Mass:ICM) về sau sẽ phát triển thành thai nhi và túi ối; các tế bào lá nuôi (Trophectoderm:TE) về sau sẽ phát triển thành bánh rau. Số lượng TE của phôi nang ngày 5 hoặc ngày 6 trung bình khoảng 37 - 40 tế bào, do vậy khi sinh thiết lấy đi một vài TE để chẩn đoán di truyền sẽ không làm ảnh hưởng tới ICM cũng như không làm ảnh hưởng tới sự phát triển và tiềm năng làm tổ của phôi sau này [25].
Kỹ thuật sinh thiết phôi nang được thực hiện và công bố lần đầu tiên bởi tác giả Dokras A. Đã có nhiều nghiên cứu sau đó được tiến 8 hành để xác minh tính an toàn của kỹ thuật này, đồng thời cho thấy sinh thiết phôi nang không gây phát sinh bất thường dạng khảm trên phôi sinh thiết nếu được thực hiện đúng theo quy trình [23], [27]. Đây là cơ sở để kỹ thuật sinh thiết phôi nang được áp dụng phổ biến ở tất cả các labo hỗ trợ sinh sản hiện nay. * Kỹ thuật sinh thiết phôi giai đoạn phôi nang Sinh thiết phôi nang bản chất là lấy ra một số TE từ phôi để xét nghiệm di truyền.
Sinh thiết phôi nang đang thoát màng A-Phôi nang nở rộng với các TE đang thoát màng qua lỗ được mở trên màng trong suốt 1 hoặc 2 ngày trước bằng laser. B-Cận cảnh TE tại vị trí sinh thiết. C-Pipette sinh thiết được đưa tới TE. D-TE được hút vào pipette sinh thiết.
E- Tách đám tế bào sinh thiết ra khỏi đám TE còn lại của phôi sử dụng laser hỗ trợ. F-Phôi nang sau khi sinh thiết và mẫu sinh thiết đã tách rời khỏi phôi.