Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán virus Epstein Barr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán virus epstein, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Phạm Thị Trà
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV)
• 1.1.1. Giới thiệu chung về EBV
• 1.1.2. Vai trò gây ung thư vòm mũi họng của EBV
• 1.1.3. Quá trình nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của EBV
• 1.1.4. Các phương pháp phát hiện EBV
• 1.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG
• 1.2.1. Hạt nano từ
• 1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ
• 1.2.2.1. Phương pháp nghiền
• 1.2.2.2. Phương pháp đồng kết tủa
• 1.2.2.3. Phương pháp vi nhũ tương
• 1.2.3. Ứng dụng hạt nano từ trong lĩnh vực y sinh
• 1.2.3.1. Phân tách và chọn lọc tế bào. Dẫn truyền thuốc
• 1.2.3.2. Tăng thân nhiệt cục bộ
• 1.2.3.3. Tăng độ tương phản cho ảnh cộng hưởng từ
• 1.3. VAI TRÒ CỦA VIỆC TINH SẠCH AXIT NUCLEIC
• 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC CỦA SINH VẬT
• 1.4.1. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng dung môi hữu cơ
• 1.4.2. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng màng xốp silica
• 1.4.3. Phương pháp tinh sạch axít nucleic bằng hạt từ nano bọc silica
• 1.4.4. Điều kiện và cơ chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Các hóa chất, nguyên liệu khác
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP
• 2.3.1. Tách chiết axit nucleic
• 2.3.2. Tách chiết ADN bằng MinElute Virus Spin Kit
• 2.3.3. Tách chiết ADN bằng kít Dynabead Myone SILANE®
• 2.3.4. Tách chiết ADN bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit
• 2.3.5. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
• 2.3.6. Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy
• 2.3.7. Tinh sạch plasmid theo kít của Qiagen
• 2.3.8. Giải trình trình tự gen đã được nhân dòng
• 2.3.9. Định lượng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN EBNA-2 KÍCH THƯỚC 250 BP ĐẶC HIỆU CHO EBV
• 3.1.1. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập
• 3.1.2. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất
• 3.1.3. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBNA-2/250
• 3.2. KẾT QUẢ NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN MÀNG BNRF1 p143 KHÔNG CHỨA NHÓM GLYCOSYL KÍCH THƯỚC 74 bp (EBV-74)
• 3.2.1. Nhân bản đoạn gen EBV-74
• 3.2.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen EBV-74
• 3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT
• 3.3.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG PCR
• 3.3.2. SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƯƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hạt từ nano chức năng hóa trong chẩn đoán virus Epstein Barr

Nghiên cứu về hạt từ nano chức năng hóa đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y sinh, đặc biệt là trong việc chẩn đoán các bệnh do virus gây ra. Virus Epstein Barr (EBV) là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, liên quan đến nhiều loại ung thư. Việc ứng dụng công nghệ nano trong chẩn đoán EBV không chỉ giúp nâng cao độ chính xác mà còn tiết kiệm thời gian và chi phí. Hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt có khả năng tách chiết axit nucleic hiệu quả, từ đó hỗ trợ trong việc phát hiện virus này.

1.1. Giới thiệu về virus Epstein Barr và tầm quan trọng của nghiên cứu

Virus Epstein Barr (EBV) là một loại virus thuộc họ Herpesviridae, có khả năng gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư vòm họng và Burkitt lymphoma. Nghiên cứu về EBV không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả hơn.

1.2. Tại sao hạt từ nano chức năng hóa lại quan trọng trong chẩn đoán

Hạt từ nano chức năng hóa có khả năng tương tác mạnh mẽ với axit nucleic, giúp tách chiết và làm giàu mẫu bệnh phẩm. Điều này rất quan trọng trong việc phát hiện virus EBV, nơi mà độ chính xác và độ nhạy của phương pháp chẩn đoán là rất cần thiết.

II. Những thách thức trong việc chẩn đoán virus Epstein Barr hiện nay

Chẩn đoán virus EBV gặp nhiều thách thức, bao gồm độ chính xác của các phương pháp hiện tại và khả năng phát hiện virus trong giai đoạn tiềm tàng. Các phương pháp truyền thống như ELISA có nhiều hạn chế, đặc biệt là trong việc phát hiện kháng thể. Do đó, việc phát triển các phương pháp mới như sử dụng hạt nano từ là cần thiết để cải thiện độ chính xác và độ nhạy trong chẩn đoán.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như ELISA và PCR truyền thống thường gặp khó khăn trong việc phát hiện virus ở giai đoạn đầu. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

2.2. Tác động của virus EBV trong cơ thể người

Virus EBV có thể tồn tại trong cơ thể người mà không gây triệu chứng, điều này làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn hơn. Sự tiềm tàng của virus có thể dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng nếu không được phát hiện kịp thời.

III. Phương pháp nghiên cứu hạt từ nano chức năng hóa trong chẩn đoán virus EBV

Nghiên cứu này sử dụng hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt để tách chiết axit nucleic của virus EBV. Phương pháp này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả tách chiết mà còn giảm thiểu thời gian và chi phí. Các bước thực hiện bao gồm chuẩn bị mẫu, tách chiết và phân tích bằng PCR.

3.1. Quy trình chế tạo hạt từ nano chức năng hóa

Hạt từ nano được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa, sau đó được chức năng hóa bề mặt bằng silica. Quy trình này giúp tăng cường khả năng tương tác với axit nucleic, từ đó nâng cao hiệu quả tách chiết.

3.2. Phương pháp tách chiết axit nucleic từ mẫu bệnh phẩm

Quy trình tách chiết axit nucleic sử dụng hạt từ nano chức năng hóa cho phép thu được mẫu tinh sạch, phục vụ cho các phản ứng PCR và Real-time PCR. Điều này giúp nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện virus EBV.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV

Hạt từ nano chức năng hóa đã được ứng dụng thành công trong việc chẩn đoán virus EBV. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ nhạy và độ chính xác cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Việc sử dụng hạt từ nano không chỉ giúp phát hiện virus mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi tiến triển của bệnh.

4.1. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu cho thấy hạt từ nano chức năng hóa có khả năng tách chiết axit nucleic hiệu quả, từ đó hỗ trợ trong việc phát hiện virus EBV trong các mẫu bệnh phẩm. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan đến EBV.

4.2. Tương lai của công nghệ nano trong y sinh

Công nghệ nano hứa hẹn sẽ tiếp tục phát triển và mở rộng ứng dụng trong y sinh, đặc biệt là trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh do virus gây ra. Việc nghiên cứu và phát triển các bộ kít chẩn đoán dựa trên hạt từ nano sẽ giúp cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu hạt từ nano trong chẩn đoán virus EBV

Nghiên cứu về hạt từ nano chức năng hóa trong chẩn đoán virus EBV đã chỉ ra tiềm năng to lớn của công nghệ này trong y sinh. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả phát hiện và điều trị các bệnh liên quan đến virus EBV. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y tế.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu hạt từ nano trong y sinh

Nghiên cứu hạt từ nano không chỉ giúp cải thiện độ chính xác trong chẩn đoán mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho các bệnh do virus gây ra.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu và ứng dụng

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các bộ kít chẩn đoán dựa trên hạt từ nano, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm chi phí trong chẩn đoán các bệnh liên quan đến virus EBV.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư vòm mũi họng hiện nằm trong nhóm 5 bệnh ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam và các nước Đông Nam Á, trong đó hơn 90% ca bệnh có liên quan trực tiếp đến virus Epstein-Barr. Virus Epstein-Barr là một loại virus thuộc họ Herpesviridae, sở hữu hệ gen ADN xoắn kép có kích thước khoảng 184 kb. Virus này có khả năng lây nhiễm qua đường hô hấp, đường tiêu hóa và tồn tại tiềm tàng trong tế bào lympho B cũng như tế bào biểu mô vòm họng. Trong thực tế lâm sàng, các xét nghiệm huyết thanh học ELISA truyền thống phát hiện kháng thể VCA-IgM chỉ có giá trị trong 2 đến 4 tuần đầu nhiễm trùng cấp, trong khi kháng thể IgG tồn tại suốt đời nên không thể phân biệt được tình trạng nhiễm trùng đã khỏi hay đang tiến triển ác tính.

Do đó, kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và Real-time PCR được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện định tính và định lượng chính xác tải lượng ADN của virus Epstein-Barr trong máu. Tuy nhiên, khâu then chốt quyết định độ nhạy của phản ứng khuếch đại là quá trình tách chiết và tinh sạch axit nucleic. Hiện nay, các bộ sinh phẩm thương mại nhập khẩu như Dynabeads MyOne Silane của Invitrogen có giá lên tới 9.000.000 VNĐ cho 5 ml hạt từ, hoặc bộ kit chẩn đoán của Roche có giá khoảng 53.000.000 VNĐ cho 48 phản ứng. Chi phí đắt đỏ này tạo rào cản lớn đối với hệ thống y tế công cộng.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là nghiên cứu, thử nghiệm và đánh giá khả năng tách chiết ADN virus Epstein-Barr trong huyết thanh người bằng bộ kit tự chế tạo trong nước mang tên Virus Magnet Nano Kit sử dụng hạt nano từ Fe3O4 bọc silica (MagSi nano) kích thước 20 nm. Đề tài được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2009 đến năm 2011 tại Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội, phối hợp cùng Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân Y 103. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi giúp giảm từ 60% đến 70% chi phí hóa chất tách chiết, rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 30 phút, đồng thời tạo tiền đề tự chủ nguồn sinh phẩm chẩn đoán y sinh học phân tử chất lượng cao tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết sinh học phân tử và khoa học vật liệu nano:

Thứ nhất là nguyên lý tách chiết axit nucleic của René Boom công bố năm 1990. Nguyên lý này chỉ ra rằng trong môi trường muối chaotropic nồng độ cao như Guanidinium thiocyanate từ 5,25 M đến 6,0 M và pH dưới 7, các cation guanidinium sẽ khử nước bề mặt silica và ADN. Quá trình này tạo lực hút tĩnh điện bền vững giữa bề mặt silica tích điện dương và nhóm photphat tích điện âm trên bộ khung phân tử ADN. Khi chuyển sang môi trường đệm có nồng độ muối thấp và pH trên 7, lực liên kết này bị phá vỡ, giải phóng ADN tinh sạch hoàn toàn.

Thứ hai là lý thuyết siêu thuận từ của vật liệu nano oxit sắt Fe3O4. Khi kích thước hạt oxit sắt giảm xuống dưới ngưỡng 100 nm (trong nghiên cứu này là khoảng 20 nm), các hạt chỉ thể hiện từ tính mạnh dưới tác dụng của từ trường ngoài mà không bị từ hóa dư khi ngắt từ trường. Đặc tính này giúp hạt nano phân tán đồng nhất trong dung dịch, không bị vón cục và dễ dàng thu gom bằng nam châm ngoài mà không cần đến máy ly tâm tốc độ cao.

Thứ ba là mô hình cấu trúc phân tử và cơ chế sinh bệnh của virus Epstein-Barr. Hệ gen của virus mã hóa cho 6 kháng nguyên nhân EBNA và 3 protein màng tiềm tàng LMP. Trong đó, gen EBNA-2 kích thước 250 bp giữ vai trò trung tâm trong quá trình hoạt hóa và biệt hóa tế bào lympho B, còn gen BNRF1 p143 mã hóa protein màng kích thước 74 bp là đích khuếch đại lý tưởng cho phản ứng Real-time PCR độ nhạy cao.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và mẫu bệnh phẩm: Đề tài thu thập tổng cộng 40 mẫu máu lâm sàng, gồm 30 mẫu huyết thanh có kết quả xét nghiệm kháng thể VCA-IgG dương tính tại Khoa Vi sinh thuộc Bệnh viện Bạch Mai và 10 mẫu máu từ các bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vòm mũi họng tại Bệnh viện Quân Y 103. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu có chủ đích theo tiêu chuẩn lâm sàng và huyết thanh học xác định.

Quy trình tách chiết và phân tích thực nghiệm: ADN virus được tách chiết song song từ 200 µl huyết thanh của mỗi bệnh nhân bằng 3 bộ kit khác nhau để đối chứng: Virus Magnet Nano Kit tự chế tạo, MinElute Virus Spin Kit của Qiagen và Dynabeads MyOne Silane của Invitrogen. Hệ đệm của bộ kit nội địa gồm đệm ly giải chứa Guanidinium thiocyanate 5,25 M, đệm rửa 1 chứa Guanidinium thiocyanate 2,2 M và ethanol 56%, đệm rửa 2 chứa ethanol 70%, và đệm chiết đẩy ADN ở nhiệt độ 60 độ C.

Đoạn gen đích EBNA-2 được khuếch đại bằng kỹ thuật nested PCR, sau đó được tối ưu hóa thành phản ứng một lần duy nhất. Sản phẩm PCR được dòng hóa vào vector pGEM-T Easy, biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5alpha và nuôi cấy trên môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin 50 µg/ml kết hợp chỉ thị màu X-gal và IPTG. Trình tự gen được giải mã trên hệ thống máy giải trình tự tự động CEQ 8000 của hãng Beckman Coulter. Khả năng tách chiết và định lượng virus được đánh giá thông qua phản ứng Real-time PCR sử dụng TaqMan probe gắn chất phát huỳnh quang FAM và chất dập huỳnh quang TAMRA qua 45 chu kỳ nhiệt trên hệ thống Bio-Rad IQ5.

Lý do lựa chọn phương pháp: Việc kết hợp hạt nano từ bọc silica với kỹ thuật Real-time PCR cho phép xử lý mẫu tự động hàng loạt, loại bỏ hoàn toàn hóa chất độc hại như phenol và chloroform, đồng thời giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm chéo giữa các giếng phản ứng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả nổi bật với những số liệu thực nghiệm định lượng rõ ràng:

Thứ nhất, chế tạo thành công hạt nano từ Fe3O4 bọc silica (MagSi nano) với kích thước đồng nhất khoảng 20 nm thông qua phương pháp đồng kết tủa dung dịch ion Fe2+ và Fe3+. Ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) khẳng định các hạt có độ phân tán cao, từ độ bão hòa lớn và lớp vỏ bọc silica liên kết đồng đều ở nồng độ huyền dịch 20 mg/ml.

Thứ hai, tối ưu hóa thành công kỹ thuật PCR nhân bản gen EBNA-2 kích thước 250 bp. Tác giả đã chuyển đổi xuất sắc quy trình nested PCR từ hai lần phản ứng độc lập (gồm 25 chu kỳ ở lần 1 và 30 chu kỳ ở lần 2) sang một phản ứng nested PCR duy nhất với một chu trình nhiệt tích hợp. Cải tiến này giúp tiết kiệm 50% lượng hóa chất Taq polymerase, giảm hơn 40% thời gian thực hiện mà vẫn thu được duy nhất một băng điện di sắc nét tại kích thước chuẩn 250 bp.

Thứ ba, dòng hóa và giải trình tự thành công hai đoạn gen đích EBNA-2 (250 bp) và EBV-74 (74 bp) vào vector pGEM-T Easy. Kết quả giải mã trình tự trên hệ thống CEQ 8000 khi so sánh bằng phần mềm GENETYX cho thấy độ tương đồng đạt từ 99% đến 100% so với trình tự chuẩn của virus Epstein-Barr được công bố trên ngân hàng gen quốc tế GenBank.

Thứ tư, đánh giá so sánh hiệu năng tách chiết của bộ kit nội địa: Phân tích Real-time PCR trên 40 mẫu bệnh phẩm lâm sàng cho thấy giá trị chu kỳ ngưỡng Ct của ADN tách bằng Virus Magnet Nano Kit dao động tương đương với kit MinElute của Qiagen và Dynabeads của Invitrogen, với độ lệch Ct trung bình dưới 0,5 chu kỳ giữa các phương pháp.

Thảo luận kết quả

Hiệu năng vượt trội của bộ kit Virus Magnet Nano Kit bắt nguồn từ cấu trúc nano siêu thuận từ và cơ chế hấp phụ bề mặt tối ưu. Hạt oxit sắt kích thước 20 nm mang lại diện tích tiếp xúc riêng cực lớn, cho phép thu hồi các phân tử ADN ở nồng độ vết trong 200 µl mẫu bệnh phẩm. Sự kết hợp giữa muối Guanidinium thiocyanate 5,25 M và protease K giúp ly giải triệt để màng lipid và vỏ protein capsid, đồng thời ức chế hoàn toàn hoạt tính của các enzyme nuclease nội sinh.

So sánh với phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ cổ điển (phenol-chloroform), phương pháp hạt nano từ loại bỏ hoàn toàn nguy cơ phơi nhiễm độc chất cho kỹ thuật viên, cắt giảm thời gian xử lý từ 4 giờ xuống còn 25 đến 30 phút, và loại bỏ hiện tượng dung môi hữu cơ tồn dư làm ức chế phản ứng Taq polymerase. So với phương pháp màng xốp silica ly tâm, việc sử dụng hạt MagSi nano kết hợp giá hút từ 96 vị trí cho phép thao tác đồng thời nhiều mẫu bằng pipet đa kênh, mở ra khả năng tự động hóa hoàn toàn bằng robot.

Để trực quan hóa dữ liệu, kết quả thực nghiệm có thể được trình bày thông qua biểu đồ cột so sánh giá trị Ct trung bình của 3 bộ kit trên các nhóm mẫu huyết thanh khác nhau, đi kèm bảng đối chiếu các thông số kỹ thuật then chốt: tỷ lệ hấp thụ quang phổ A260/A280 đạt độ tinh sạch cao từ 1,8 đến 1,9; hiệu suất thu hồi ADN đạt trên 85%; và giá thành nguyên liệu giảm hơn 65% so với sinh phẩm ngoại nhập.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình sản xuất bộ sinh phẩm Virus Magnet Nano Kit ở quy mô công nghiệp: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và các viện nghiên cứu chuyên ngành cần phối hợp cùng các doanh nghiệp dược phẩm đăng ký chứng nhận ISO 13485 cho dây chuyền sản xuất hạt MagSi nano. Mục tiêu trong 12 đến 18 tháng tới là xuất xưởng 20.000 kit chẩn đoán với chi phí thấp hơn 60% so với giá kit nhập ngoại, phục vụ nhu cầu xét nghiệm trong nước.

Thứ hai, tự động hóa hoàn toàn quy trình tách chiết trên hệ thống máy 96 giếng: Các kỹ sư y sinh và đơn vị chế tạo thiết bị y tế cần phát triển hệ thống robot hút mẫu tự động kết hợp giá từ chuyên dụng (mã AVG 81511) trong vòng 6 đến 12 tháng. Mục tiêu kỹ thuật là xử lý đồng thời 96 mẫu bệnh phẩm trong thời gian dưới 20 phút, giảm thiểu tối đa sai sót thao tác thủ công.

Thứ ba, mở rộng phổ ứng dụng của hạt MagSi nano sang các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm khác: Nhóm nghiên cứu cần tiếp tục ứng dụng hệ hạt từ nano bọc silica để tối ưu hóa quy trình tách chiết axit nucleic cho virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV), virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis). Lộ trình thực hiện dự kiến kéo dài 24 tháng, hướng tới ngưỡng phát hiện dưới 50 bản sao virus/ml.

Thứ tư, áp dụng quy trình Real-time PCR định lượng virus Epstein-Barr vào phác đồ tầm soát ung thư vòm họng tại các bệnh viện: Bộ Y tế và các cơ sở y tế chuyên khoa ung bướu như Bệnh viện K, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Quân Y 103 cần đưa xét nghiệm định lượng tải lượng ADN virus vào gói khám sàng lọc định kỳ cho nhóm nguy cơ cao trong vòng 12 tháng, nhằm nâng tỷ lệ phát hiện sớm ung thư vòm họng giai đoạn 1 và 2 lên trên 80%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn sâu sắc cho 4 nhóm đối tượng sau:

Thứ nhất, các nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Sinh học thực nghiệm: Luận văn cung cấp tài liệu chi tiết về kỹ thuật chức năng hóa bề mặt hạt nano từ bằng silica (MagSi nano 20 nm), cách thức thiết kế mồi chuyên biệt và phương pháp tối ưu hóa phản ứng nested PCR một bước cho các gen virus kích thước nhỏ.

Thứ hai, bác sĩ và kỹ thuật viên xét nghiệm tại các bệnh viện và trung tâm chẩn đoán y khoa: Tài liệu là cẩm nang thực hành chuẩn về quy trình tách chiết ADN từ 200 µl huyết thanh và thiết lập phản ứng Real-time PCR định lượng bằng TaqMan probe, giúp theo dõi đáp ứng điều trị và tiên lượng nguy cơ tái phát ở bệnh nhân ung thư vòm họng.

Thứ ba, các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế và thiết bị chẩn đoán in-vitro (IVD): Nguồn dữ liệu thực nghiệm về thành phần hệ đệm Guanidinium thiocyanate 5,25 M và quy trình chế tạo hạt từ giá rẻ là cơ sở vững chắc để thương mại hóa các bộ kit tách chiết ADN/ARN nội địa, nâng cao năng lực cạnh tranh quốc gia.

Thứ tư, giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Y Dược và Khoa học Tự nhiên: Luận văn là tài liệu tham khảo chất lượng cao cho các học phần Sinh học phân tử, Vật liệu nano y sinh và Kỹ thuật gen, minh họa rõ nét quy trình dòng hóa gen vào vector pGEM-T Easy và đọc trình tự trên máy CEQ 8000.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao xét nghiệm huyết thanh học ELISA lại bị hạn chế trong chẩn đoán ung thư vòm họng do virus Epstein-Barr? Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể VCA-IgM chỉ xuất hiện trong 2 đến 4 tuần đầu nhiễm cấp tính rồi biến mất, trong khi kháng thể IgG tồn tại suốt đời ở hơn 90% dân số trưởng thành. Do đó, ELISA không thể phân biệt được người đã từng nhiễm virus trong quá khứ với người đang có virus tái hoạt động gây ung thư.

Hạt nano từ bọc silica (MagSi nano) mang lại ưu điểm vượt trội gì so với màng lọc silica ly tâm? Hạt nano từ Fe3O4 kích thước 20 nm có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn hơn hàng chục lần, giúp tăng hiệu suất thu hồi ADN. Đặc biệt, việc thu gom hạt từ bằng nam châm ngoài giúp loại bỏ hoàn toàn bước ly tâm, rút ngắn thời gian xử lý xuống dưới 30 phút và cho phép tự động hóa hoàn toàn trên đĩa 96 giếng.

Nồng độ muối Guanidinium thiocyanate đóng vai trò gì trong phản ứng hấp phụ ADN? Muối Guanidinium thiocyanate ở nồng độ cao từ 5,25 M đến 6,0 M đóng vai trò là chất chaotropic làm biến tính và hòa tan lớp vỏ protein của virus, đồng thời khử nước bề mặt silica và ADN. Điều này tạo điều kiện cho các cation guanidinium tạo cầu nối tĩnh điện bền vững giữ ADN trên bề mặt hạt từ.

Việc cải tiến phản ứng nested PCR từ hai lần độc lập sang một chu trình nhiệt duy nhất có ý nghĩa gì? Quy trình nguyên bản đòi hỏi 2 lần chạy PCR riêng biệt với 55 chu kỳ tổng cộng, gây tốn thời gian và dễ nhiễm chéo khi mở nắp ống. Việc tối ưu hóa về một chu trình nhiệt duy nhất giúp giảm 50% lượng enzyme tiêu tốn, rút ngắn thời gian phân tích từ 4 giờ xuống 2 giờ và hạn chế tối đa nguy cơ ngoại nhiễm.

Đoạn gen nào được lựa chọn làm đích định lượng bằng Real-time PCR trong nghiên cứu này? Nghiên cứu sử dụng đoạn gen BNRF1 p143 có kích thước 74 bp mã hóa protein màng không chứa nhóm glycosyl của virus Epstein-Barr. Do có kích thước ngắn 74 bp, đoạn gen này đảm bảo hiệu suất nhân bản tối ưu và độ nhạy cực cao khi kết hợp với TaqMan probe gắn chất phát huỳnh quang FAM và chất dập huỳnh quang TAMRA.

Kết luận

• Nghiên cứu đã chế tạo và chức năng hóa bề mặt thành công hạt nano từ Fe3O4 bọc silica (MagSi nano) kích thước đồng nhất khoảng 20 nm, đáp ứng xuất sắc các tiêu chuẩn siêu thuận từ và độ tương thích sinh học cao.
• Thiết lập hoàn chỉnh quy trình tách chiết ADN virus Epstein-Barr từ 200 µl huyết thanh bằng bộ kit tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit với hệ đệm Guanidinium thiocyanate 5,25 M tối ưu, rút ngắn thời gian thao tác xuống dưới 30 phút.
• Tối ưu hóa thành công phản ứng nested PCR khuếch đại gen EBNA-2 kích thước 250 bp về một chu trình nhiệt duy nhất, đồng thời xây dựng quy trình định lượng gen BNRF1 p143 (74 bp) bằng Real-time PCR độ nhạy cao.
• Thử nghiệm trên 40 mẫu bệnh phẩm lâm sàng khẳng định bộ kit Virus Magnet Nano Kit đạt hiệu năng tách chiết và giá trị chu kỳ ngưỡng Ct tương đương hai bộ kit thương mại quốc tế của Qiagen và Invitrogen.
• Làm chủ công nghệ sinh phẩm y sinh nội địa, giúp cắt giảm từ 60% đến 70% chi phí xét nghiệm và tạo tiền đề vững chắc cho việc sản xuất hàng loạt kit chẩn đoán phân tử tại Việt Nam.

Đóng góp chính của luận văn là đã làm chủ toàn diện quy trình chế tạo hạt nano từ bọc silica và ứng dụng thành công vào chẩn đoán phân tử virus Epstein-Barr liên quan đến ung thư vòm họng. Trong lộ trình 12 tháng tiếp theo, nhóm nghiên cứu sẽ mở rộng thử nghiệm lâm sàng trên 500 mẫu bệnh phẩm và hoàn thiện hồ sơ đăng ký cấp phép lưu hành y tế. Các cơ sở y tế và đơn vị nghiên cứu quan tâm hãy liên hệ để hợp tác thử nghiệm lâm sàng và tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ sinh phẩm tiên tiến này ngay hôm nay.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến rất quan trọng, đặc biệt là vật liệu nano ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi ở mọi lĩnh vực. Một trong những hƣớng đi quan trọng của công nghệ nano là ứng dụng của nó trong Y – sinh bao gồm sử dụng vật liệu nano vào các nghiên cứu, công cụ dẫn thuốc, liệu pháp điều trị, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh [6, 14, 29, 33] nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con ngƣời. Trong số đó, các hạt nano từ tính đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây, ví dụ nhƣ tách chiết axít nucleic (ADN, ARN), phân tách tế bào, vận chuyển thuốc, liệu pháp trị nhiệt từ và nhiều ứng dụng khác nữa [3, 21, 26, 33]. Việc tinh sạch axít nucleic của vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm là một bƣớc rất quan trọng vì các nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử bằng PCR, Real-time PCR đều cần đến nguồn axit nucleic tinh sạch.

Vì vậy, rất nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch axít nucleic đã đƣợc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng rộng rãi, trong đó phƣơng pháp do René Boom và cộng sự phát minh vào năm 1990 là phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất. Nguyên lý của phƣơng pháp này dựa trên khả năng hình thành liên kết bền vững của hạt silica với axít nucleic thông qua cầu nối cation trong môi trƣờng có nồng độ muối cao [8, 9]. Một cải tiến mang tính đột phá của phƣơng pháp Boom đƣợc nhiều công ty công nghệ sinh học hàng đầu trên thế giới nhƣ Roche, Invitrogen, Promega, phát triển là sử dụng hạt nano từ tính bọc Khoa Sinh häc 4 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ silica để tinh sạch axít nucleic, giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tiết kiệm thời gian thao tác. Đặc biệt, cải tiến này đã giúp chế tạo đƣợc các máy tự động tách chiết và tinh sạch axít nucleic [27, 39].

Tuy nhiên, giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ bọc silica rất cao. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển bộ kít tách chiết axit dựa trên nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí trong khâu tách chiết, chủ động cung cấp kít tách chiết axit nucleic khi cần. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xử lý hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay còn gọi là hạt Magsi nano do nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo và bộ đệm thích hợp (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu phòng Sinh học nano và Ứng dụng) để thử nghiệm khả năng tách chiết axit nucleic của virus Epstein Barr trong các bệnh phẩm của bệnh nhân ghi nhiễm EBV. EBV là virus truyền nhiễm trên ngƣời, lây truyền qua đƣờng ăn uống, tiếp xúc.

EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng nhƣ: ung thƣ vòm họng, Burkitt lymphoma, ung thƣ lymphoma và các trạng thái biến đổi tế bào lympho [1]. ADN tách chiết bởi bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt Magsi nano và bộ đệm thích hợp sẽ đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR và Real-time PCR để phát hiện và định lƣợng nồng độ EBV trong máu hay các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ trong công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lƣợng các bệnh liên quan đến EBV. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real-time PCR.

Khoa Sinh häc 5 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ 2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano đƣợc bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tƣợng HBV, HCV). So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 1.

Giới thiệu chung về EBV Hình 1.1: Hình ảnh Epstein Barr Virus dƣới kính hiển vi điện tử [47] Khoa Sinh häc 6 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Năm 1958, Burkitt phát hiện ra khối u lympho xƣơng hàm trên ở trẻ em Châu Phi, từ đó bệnh này đƣợc mang tên ông: Burkitt’s Lymphoma (BL). Vào năm 1964 nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertaft phân lập đƣợc loại virus ở dòng lymphoblastes trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [15]. Từ đó virus này đƣợc mang tên là Epstein Barr Virus. Năm 1975, tác giả Nadol và cs phân lập đƣợc các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thƣ vòm bằng kính hiển vi điện tử.

Đây là lần đầu ngƣời ta quan sát đƣợc các thể virus thuộc họ Herpesviridae trong tế bào ung thƣ ở ngƣời, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên nhân gây ung thƣ ở ngƣời [1]. EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại ADN sợi đôi xoắn kép mạch hở, kích thƣớc hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu. Hệ gen EBV có 6 tổ hợp gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân (Epstein Barr Virus nuclear antigen), đƣợc ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng (latent membral protein), đƣợc ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [13]. Vai trò của sáu protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV trong tế bào lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên quan đến chu kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B.

Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA của hệ gen EBV. EBNA -2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm non hóa để EBV thực hiện quá trình gây ung thƣ. Hơn nữa gen EBNA-2 là gen đƣợc sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế bào bị nhiễm. EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 đƣợc coi là yếu tố quan trọng trong cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [25].

Khoa Sinh häc 7 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Toàn bộ hệ gen EBV đƣợc chứa trong một vỏ capsid. Vỏ capsid này có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân ADN của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (kháng nguyên VCA), đƣợc xác định bởi 20 mặt bên, 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng. Vỏ capsid lại đƣợc bao bọc bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope) cấu trúc từ thành phần chủ yếu là glycoprotein. Vỏ bao ngoài này cũng đƣợc mã hóa bởi gen virus và cũng mang dấu ấn miễn dịch (hình 1.2: Cấu trúc của EBV [43] Giữa vỏ capsid và vỏ ngoài là khoảng chứa đựng các protein đệm cấu trúc và các enzyme của virus (Tegument).

Vỏ ngoài của EBV có sự nhạy cảm với các tác động của axit, ether, các dung dịch hòa tan sát khuẩn và đông khô [13]. EBV là loại virus truyền nhiễm gây bệnh trên ngƣời và lây truyền qua đƣờng tiêu hóa, tiếp xúc. Do đó, virus này thƣờng đƣợc phát hiện thấy trong chất thải tế bào và chất tiết ở phần trên của hệ tiêu hóa và hô hấp nhƣ nƣớc bọt, niêm dịch vùng họng. EBV có đặc tính hƣớng bạch huyết hấp phụ lên tế bào lympho B thông qua tƣơng tác của glycoprotein gp350/220 có trên bề mặt virus với thụ thể CR2/CR21 của bổ thể CD3 trên tế bào lympho B của ngƣời (hình 1.

Khoa Sinh häc 8 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ Hình 1.3: Sự hấp phụ của EBV lên tế bào lympho B qua thụ thể CR21 [46] EBV ở trạng thái tiềm tan, nhiều bản sao ADN của EBV đƣợc tìm thấy trong tế bào chất của những tế bào lympho B bị nhiễm nhƣng chỉ có vài gen đƣợc sao chép. EBV có thể gây nhiễm ở dạng tiềm tan và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh. Nhƣng trong những cơ thể có thể trạng hệ miễn dịch suy yếu thì EBV có thể là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (IM-infectious mononucleosis), liên quan đến cơ chế tiến triển của một số loại ung thƣ nhƣ tăng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma. Đặc trƣng của các khối u trong các bệnh ung thƣ này là trong các tế bào của khối u có chứa một lƣợng lớn các bản sao hệ gen EBV và xuất hiện sự biểu hiện nhiều protein có vai trò chuyển hóa khối u từ lành tính thành khối u ác tính [25].

Về mặt sinh bệnh học, sự nhiễm virus xảy ra đầu tiên ở vùng miệng, hầu rồi lan vào máu, tại đây tế bào lympho B bị nhiễm. Sự đáp ứng miễn dịch đầu tiên trong nhiễm EBV là cơ thể sinh kháng thể IgM chống lại kháng nguyên VCA của EBV, đáp ứng kháng thể IgM chỉ xuất hiện trong vài tuần đầu sau khi nhiễm, tiếp theo là kháng thể IgG và kháng thể IgG này tồn tại suối đời ngƣời nhiễm [19]. EBV thƣờng gây ra nhiễm trùng cấp ở vùng miệng họng, có thể hoặc không biểu hiện triệu chứng gì. Sau quá trình nhiễm đó EBV tồn tại tiềm tàng trong các tế bào biểu Khoa Sinh häc 9 Khãa 2009 - 2011 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LuËn v¨n th¹c sÜ Ph¹m ThÞ Trµ mô hoặc lympho B.

Tùy theo hoàn cảnh hoặc tình trạng bệnh lý đặc biệt ở những ngƣời bị suy giảm miễn dịch ví dụ do HIV/ AIDS, bị suy dinh dƣỡng, hay ngƣời phụ nữ nhiễm mà mang thai thì EBV tái hoạt hóa trở lại.