Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu tạo của HPV Papillomavirus (PV) là loại virus lây lan qua con đường tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt qua quan hệ tình dục. HPV là virus có đường kính 52-55 nm và được tạo bởi chuỗi xoắn kép DNA dài khoảng 8000 cặp base nito. Chuỗi DNA của HPV gồm 8 đoạn dịch mã; các gen dịch mã được chia thành 3 nhóm: gen muộn L (late), gen sớm E (early) và vùng điều khiển dài (long control region-LCR) hay còn gọi là vùng không mã hóa (unreading region - URR).
Capsid virus gồm 72 capsomeres, mỗi capsomere được cấu tạo bởi 2 protein chính L1 và protein phụ L2. Vùng gen sớm gồm các gen E1, E2, E4, E5, E6 và E7 mã hóa cho các protein liên quan quá trình tái bản của vi rút. Sơ đồ về sự sắp xếp các gen và chức năng từng protein tương ứng của HPV được mô tả trong hình 1.1, mô hình capsomeres của hạt virus được minh họa tại hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo các gen của HPV và chức năng các protein E1-E7: các gen của HPV; protein của E1 can thiệp quá trình tái bản (replication), protein E2 can thiệp quá trình sao mã và tái bản (transcription/replication), protein E5, E6, E7 liên quan đến quá trình dịch mã (transformation). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Lịch sử phát hiện và phân loại HPV HPV5 đại diện cho HPV đầu tiên phát hiện ở tế bào ung thư biểu mô da. Năm 1980, Gissmann và zur Hausen đã đặt tên là HPV6 cho HPV được tách thành công từ u nhú sinh dục. Năm 1982, Gissmann và cộng sự tách HPV 11 từ vùng hầu họng. Năm 1983, bằng kỹ thuật lai trên màng, Dürst và cộng sự đã tách sublineage HPV16.
Năm 1984, Boshart và cộng sự tách sublineage HPV18 [14]. Sau gần 30 năm, từ phân loại dựa trên gen lai và đoạn gen mẫu, sự phân loại HPV đã chuyển sang so sánh toàn bộ bộ gen hoặc những đoạn subgenomic. Gen L1 có tính bảo tồn cao nên được sử dụng để phân loại HPV trong suốt hơn 15 năm qua. Một loại Papillomavirus được coi là mới nếu trình tự DNA của L1 khác biệt 10% so với loại gần nhất đã biết; nếu sự khác biệt từ 2-10% được gọi là dưới nhóm (subtype) và nếu ít hơn 2% được gọi là biến thể (variant) [14].
Năm 2011, Chen và cộng sự đã công bố tiêu chí phân loại mới cho HPV; nếu sự khác biệt toàn bộ bộ gen của HPV từ 1-10% được gọi là lineage, từ 0,5-1% được gọi là sublineage [16]. Năm 2013, Bzhalava và cộng sự đã xây dựng cây phả hệ HPV căn cứ vào gen L1 của 198 HPV, chi tiết được mô tả trong hình 1. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3: Cây phả hệ căn cứ vào trình tự gen L1 của 198 HPV Cũng căn cứ vào khả năng gây bệnh, Muñoz lại chia HPV thành 3 nhóm: nhóm nguy cơ cao gồm 15 loại: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 và 82; nhóm có khả năng gây ung thư gồm 3 loại HPV26, 53 và 66; nhóm nguy cơ thấp có 12 loại: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 và CP6108 [7]. Căn cứ vào bộ gen hoàn chỉnh của HPV16, Smith và cộng sự đã định danh phân nhóm dưới nhóm của HPV16 gồm nhóm châu Âu - European (gồm có sublineage châu Âu (E prototype - E(p) và Asian-E(As)) và không châu Âu - Non European (gồm sublineage châu Phi 1 (African -1 (Af-1)), châu Phi 2 (Afiran-2 (Af-2)) và Á Mỹ (Asian American-AA)) [18].
Không những sử dụng cả bộ gen của HPV, chỉ căn cứ vào trình tự nucleotide của đoạn gen E6, Antonio Huertas-Salgado đã định danh 5 loại sublineage của HPV16. Mỗi sublineage có những đặc điểm đột biến riêng đặc trưng của nó. Sublineage European (E) phải có đột biến C ở nucleotide thứ 109 nhưng tùy vào vị trí nucleotide 350 là T hay G mà lại chia làm 2 loại biến thể E-T350 và E-G350. Sublineage Asian (As) được đặc trưng bởi đột biến LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 acid nucleic tại vị trí 178.
Đột biến T178G thuộc nhóm As-a; T178A thuộc As-b và T178C thuộc nhóm As-c. Sublineage Asian American (AA) được mô tả với các đột biến: G145T, T286g, A289g, T350G và A532g. Trong khi sublineage African1 (Af1) có đột biến C143G và G145T thì Afican 2 (Af 2) có 5 đột biến điểm: C143G, G145T, A289g và C335T (nucleotid viết thường là đột biến thay thế nucleotid không làm thay đổi bộ ba mã hóa acid amin tương ứng) [19]. Như vậy, phân loại HPV được căn cứ vào trình tự gen L1 của HPV và phân nhóm (lineage) và phân nhóm dưới nhóm (sublineage) của HPV16 dựa trên trình tự gen E6, E7 của HPV16.
Cơ chế gây bệnh của HPV Doorbar đã mô phỏng quá trình xâm nhập và nhân lên của HPV ở hình 1. Tại vùng biểu mô trụ tầng, ví dụ như cổ tử cung, qua những tổn thương nhỏ, HPV đã có thể xâm nhập vào màng đáy. Sau khi vi rút xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô đáy, một hoặc 1 vài bản sao của vi rút được nhân lên và tồn tại như 1 thực thể ổn định trong nhân tế bào bằng cách gắn lên sợi nhiễm sắc tạo thể bổ sung hình nhẫn. Ngay ở lớp đáy, protein E6, E7 được biểu hiện, can thiệp vào chu kỳ tế bào.
Gen khởi động của HPV được hoạt hóa và các protein sớm E1, E2 được giải mã, tổng hợp một lượng lớn thể bổ sung. Cùng với sự phân bào của tế bào đáy, bộ gen của HPV cũng được nhân lên và phân chia theo thoi vô săc. Ở giai đoạn này, thể bổ sung được duy trì, gen của vi rút được biểu hiện với số lượng rất nhỏ nhưng vi rút được nhân lên với mức độ trung bình để đồng bộ với chu trình sống của tế bào chủ. Tới lớp thượng bì, các gen muộn L1, L2 được biểu hiện để tổng hợp protein L1, L2 tạo hạt vi rút hoàn chỉnh.
Các hạt vi rút hoàn chỉnh được giải phóng cùng với sự bong ra các tế bào biểu mô khi các tế bào nhiễm vi rút phân chia tiến tới bề mặt lớp biểu mô [20]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.4: Chu kỳ sống của HPV Cơ chế gây bệnh của HPV được cụ thể hóa qua chức năng của các protein trong quá trình xâm nhập và nhân lên của HPV. Protein L1 và L2 Protein L1 và L2 vừa có vai trò nhận diện thụ thể màng tế bào, xâm nhập vào tế bào và nhân tế bào; sau khi bị phân hủy ở giai đoạn sớm tổng hợp trở lại giai đoạn muộn. Protein L1với 531 acid amin của HPV có các đầu tận carbon và ni-tơ như những “cánh tay xâm lấn” vào đáy của các múi capsomer và các acid amin cystein tại vị trí 161, 229 và 379 có vai trò tăng sự bền vững đối với enzyme thủy phân-endonulease trong quá trình biệt hóa tế bào biểu mô [21],[22].
Sự xâm nhập của HPV vào tế bào chủ bắt đầu bằng sự tương tác của protein L1 với tế bào biểu mô qua thụ thể trên bề mặt màng tế bào - heparan sulfat proteoglycans (HSPG) [23]. Nhưng cũng chính sự tương tác giữa capsid với thụ thể bề mặt tế bào biểu mô của vật chủ dẫn tới sự thay đổi ở các acid amin tận trên capsid protein L2-phân hủy một lượng acid amin nhất định bởi furin – protease tế bào, khiến cho protein L2 thoát khỏi sự thực bào của các hạt nội bào [24]. Bên cạnh đó, protein L2 bị furin phân cắt cho phép vi rút bám vào thụ thể thứ 2 trên bề mặt tế bào biểu mô [25]. Đột biến acid amin cystein tại vị trí 161, 229, 379 thành serin đã làm tăng khả năng bền vững với enzym thủy phân endonuclease, bảo tồn của LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Hơn nữa, chức năng nhận diện và bám vào tế bào biểu mô của protein L1 được các acid amin từ 54 -77, 274 -308 trên HPV16 L1 và 59- 78, 259-278 trên HPV18 L1 đảm nhiệm [26]. Acid amin lysine 278 và 361 tại đỉnh của cánh pentamer cũng giữ vai trò chủ chốt trong việc tương tác với thụ thể bề mặt tế bào [27]. Sau khi xâm nhập vào tế bào, protein L1 của HPV16 còn xâm nhập vào nhân tế bào chủ qua Karyopherin α2β1, receptor trên màng nhân và ức chế Karyopherin α2β1 trong suốt quá trình tăng sinh [28]. Protein L2 đóng vai trò quan trọng trong việc thoát khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch tại chỗ.
Tế bào Langerhan và tế bào thực bào của da và biểu mô - dendritic cell được hoạt hóa bởi sự xâm nhập của HPV mà điển hình là sự xuất hiện protein L1 của HPV [29]. Nhưng chính protein L2 giảm quá trình phosphoryl hóa Protein kinase B (Akt) dẫn tới giảm hoạt tính của Akt, do đó, giáng hóa con đường PI3K-Atk dẫn tới áp chế “sự chín” của tế bào Langerhan khiến cho HPV16 thoát khỏi sự kiểm soát của hệ miễn dịch [30]. Như vậy, protein L1 vừa nhận diện và bám vào thụ thể trên bề mặt màng tế bào. Sự kết hợp giữa protein L1 của HPV và thụ thể sẽ hoạt hóa các tế bào miễn dịch tại chỗ và cắt bỏ 1 vài acid amin của protein L2.
Protein L2, đến lượt nó lại ức chế tế bào miễn dịch, giúp HPV sống sót và tiếp tục xâm nhập vào nội bào và tiến vào nhân tế bào chủ. Protein E1 và E2 Protein E1 với 138 acid amin chia làm 3 phần, domain N từ acid amin số 1 đến 125 đảm nhiệm chức năng gắn với DNA, domain C từ acid amin 170 có hoạt tính như enzyme tháo xoắn DNA helicase/ATPase [31]. Protein E1 nhận diện vị trí sao chép của đoạn ori (origin) và biến tính DNA tại vị trí ori. Với số bản copy 50 bản/ tế bào, protein E1 HPV cần thiết cho cả giai đoạn bắt đầu nhân lên và duy trì bộ gen của vi rút [32].
Protein E1 không chỉ tác động LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 9 đến các gen liên quan đến chu trình tế bào mà còn giảm hoạt động của các gen đáp ứng miễn dịch như IFNβ1, IFNλ1 và ISG [33]. Protein E1, cùng với sự hiện diện của protein E2, protein E2 qua DNA binding domain sẽ tăng cường E1 bám vào DNA. Phức hợp protein E1-E2-ori liên kết với DNA của tế bào chủ với ái lực cao [34]. Protein E4 Protein E4 được tổng hợp sớm và với nồng độ cao, thậm chí cao hơn cả các protein L1, L2.
Sự tổng hợp protein E4 chịu tác động của các kinase, mà điển hình là protein kinase A [35]. Vùng bảo tồn LLXLL tại vị trí acid amin 12-16 trên protein E4 của HPV16, đóng vai trò then chốt trong việc sừng hóa tế bào [36].