BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP.HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC ÑEÀ TAØI: THÖÛ NGHIEÄM SAÛN XUAÁT CHEÁ PHAÅM BACILLUS SUBTILIS SINH ENZYME PROTEAZA LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: VI SINH GVHD: TS. NGUYEÃN NGOÏC HAÛI SVTH : HUYØNH THÒ THUÙY OANH KHOÙA HOÏC: 2001 – 2005 LÔØI CAÛM ÔN Con kính daâng loøng bieát ôn saâu saéc ñeán Ba meï, anh chò em trong gia ñình, cuøng nhöõng ngöôøi thaân yeâu ñaõ cho con coù ngaøy hoâm nay. Em xin chaân thaønh bieát ôn Ban giaùm hieäu nhaø tröôøng, cuøng toaøn theå quyù thaày coâ khoa Coâng Ngheä Sinh Hoïc, Ñaïi Hoïc Môû Baùn Coâng Tp.Hoà Chí Minh ñaõ daïy doã vaø taïo ñieàu kieän cho em trong suoát thôøi gian hoïc taäp taïi tröôøng. Em xin göûi loøng bieát ôn chaân thaønh ñeán thaày Nguyeãn Ngoïc Haûi ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo em trong suoát thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi.
Em traân troïng caûm ôn thaày Leâ Anh Phuïng vaø coâ Nguyeãn Thò Kim Loan boä moân vi sinh truyeàn nhieãm cuûa khoa Chaên nuoâi Thuù Y, Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm, Tp.Hoà Chí Minh ñaõ taïo ñieàu kieän toát cho em trong thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi. Chaân thaønh caûm ôn caùc baïn trong vaø ngoaøi lôùp ñaõ ñoäng vieân chia seû vaø giuùp ñôõ toâi trong suoát thôøi gian hoïc taäp vaø thöïc hieän ñeà taøi. Sinh vieân Huyønh Thò Thuùy Oanh MUÏC LUÏC Trang PHAÀN I. Ñaët vaán ñeà.
Noäi dung ñeà taøi. TOÅNG QUAN. SÔ LÖÔÏC VEÀ ENZYME. Caáu taïo cuûa enzyme.
Tính chaát cuûa enzyme. Cô cheá taùc ñoäng cuûa enzyme. Sinh toång hôïp enzyme. Sô löôïc veà lòch söû.
Nguoàn enzyme proteaza. Chöùc naêng sinh hoïc cuûa proteaza sinh vaät. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp proteaza cuûa vi sinh vaät. ÖÙng duïng cuûa caùc cheá phaåm enzyme proteaza.
ÑAÏI CÖÔNG VEÀ VI KHUAÅN BACILLUS SUBTILIS. Lòch söû phaùt hieän. Ñaëc ñieåm phaân loaïi. Ñaëc ñieåm phaân boá.
Ñaëc ñieåm hình thaùi. Ñaëc ñieåm nuoâi caáy. Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoaù. Ñaëc ñieåm sinh hoïc.
Caáu truùc khaùng nguyeân. Tính chaát ñoái khaùng cuûa Bacillus subtilis vôùi moät soá vi sinh vaät gaây beänh. Tình hình nghieân cöùu vaø öùng duïng cheá phaåm chöùa vi khuaån Bacillus subtilis. VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU.
THÔØI GIAN VAØ ÑÒA ÑIEÅM TIEÁN HAØNH ÑEÀ TAØI. VAÄT LIEÄU NGHIEÂN CÖÙU. Gioáng vi khuaån. Thieát bò duïng cuï thí nghieäm.
Moâi tröôøng nuoâi caáy. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU. Phaân laäp vi khuaån Bacillus subtilis. Maãu phaân laäp.
Quy trình phaân laäp. Xaùc ñònh vi khuaån Bacillus subtilis. Khaûo saùt khaû naêng taêng sinh khoái vaø saûn xuaát enzyme proteaza cuûa Bacillus subtilis töø caùc chuûng phaân laäp ñöôïc. Khaûo saùt khaû naêng sinh enzyme proteaza cuûa moät soá chuûng Bacillus subtilis treân moâi tröôøng casein.
Tìm ñieàu kieän thích hôïp cho söï saûn xuaát enzyme vaø sinh khoái teá baøo cuûa chuûng ñaõ löïa choïn. Saûn xuaát thöû nghieäm cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza. Quy trình saûn xuaát. Kieåm tra chaát löôïng cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza.
KEÁT QUAÛ THAÛO LUAÄN. KHAÛO SAÙT ÑAËC ÑIEÅM SINH HOÏC CUÛA BACILLUS SUBTILIS. Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa Bacillus subtilis. Quan saùt ñaïi theå.
Quan saùt vi theå. Ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa chuûng Bacillus subtilis .KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÊNG SINH KHOÁI VAØ SAÛN XUAÁT CHEÁ PHAÅM BACILLUS SUBTILIS SINH ENZYME PROTEAZA TÖØ 6 CHUÛNG ÑAÕ CHOÏN. Khaûo saùt khaû naêng sinh enzyme proteaza cuûa 6 chuûng Bacillus subtilis ñaõ choïn treân moâi tröôøng casein. Tìm ñieàu kieän thích hôïp cho söï saûn xuaát enzyme vaø sinh khoái teá baøo cuûa chuûng ñaõ löïa choïn.
Keát quaû khaûo saùt ñieàu kieän vaø moâi tröôøng nuoâi caáy vôùi tæ leä naïp gioáng 1%. Keát quaû khaûo saùt tæ leä naïp gioáng. Keát quaû saûn xuaát thöû nghieäm cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza. Cheá phaåm Bacillus subtilis.
Keát quaû kieåm tra cheá phaåm Bacillus subtilis. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ. 45 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO PHUÏ LUÏC DANH SAÙCH CAÙC BAÛNG Trang Baûng 3.1: Boá trí thí nghieäm 1 .2: Boá trí thí nghieäm 2 .1: Ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa caùc chuûng Bacillus subtilis phaân laäp ñöôïc töø ñaát .2: Keát quaû khaûo saùt khaû naêng sinh enzyme cuûa 6 chuûng Bacillus subtilis phaân laäp ñöôïc .3: Keát quaû khaûo saùt hoaït ñoä proteaza trung bìmh.4: Keát quaû khaûo saùt soá löôïng teá baøo .5: Hoaït ñoä proteaza cuûa chuûng B1.6: Soá löôïng teá baøo cuûa chuûng B1 .7: Hoaït ñoä proteaza cuûa chuûng B1( thí nghieäm tieáp theo ) .8: Soá löôïng teá baøo cuûa chuûng B1( thí nghieäm tieáp theo ) .9: Keát quaû kieåm tra cheá phaåm Bacillus subtilis. 43 DANH SAÙCH CAÙC SÔ ÑOÀ VAØ HÌNH Trang Sô ñoà 3.1: Sô ñoà phaân laäp vaø giaùm ñònh vi khuaån Bacillus subtilis .2: Quy trình khaûo saùt khaû naêng sinh enzyme proteaza .3: Quy trình saûn xuaát cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza .1: Quy trình saûn xuaát cheá phaåm Bacillus subtilis .1: Khuaån laïc vi khuaån Bacillus subtilis nghi ngôø treân moâi tröôøng NA .2: Khuaån laïc vi khuaån Bacillus subtilis thuaàn treân moâi tröôøng NA .3: Teá baøo vi khuaån Bacillus subtilis ñöôïc phoùng ñaïi 1000 laàn döôùi kính hieån vi .4: Vi khuaån Bacillus subtilis taïo voøng phaân giaûi casein treân moâi tröôøng thaïch cazein.5: Giai ñoaïn nuoâi caáy suïc khí saûn xuaát cheá phaåm Bacillus subtilis .6: Cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza.
42 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP GVHD: NGUYEÃN NGOÏC HAÛI PHAÀN I :MÔÛ ÑAÀU 1.ÑAËT VAÁN ÑEÀ Ngaøy nay, con ngöôøi coù xu höôùng trôû daàn veà vôùi tính chaát thieân nhieân thoâng qua vieäc söû duïng moät soá chaát coù hoaït tính sinh hoïc hay caùc phöông phaùp sinh hoïc ñeå öùng duïng trong coâng nghieäp, noâng nghieäp, caûi thieän moâi tröôøng vaø ñeå chöõa beänh. Lyù do ñôn giaûn laø con ngöôøi ñaõ thaáy ñöôïc maët traùi cuûa vieäc söû duïng chaát hoùa hoïc, chaát khaùng sinh. Nhöõng chaát naøy tuy coù hieäu quaû nhanh choùng nhöng haäu quaû ñeå laïi cuõng raát lôùn. Trong chaên nuoâi vaø nuoâi troàng thuûy saûn tröôùc ñaây ngöôøi ta thöôøng duøng nhöõng chaát khaùng sinh ñeå phoøng vaø trò beänh cho gia suùc, gia caàm , vaø toâm caù… Vieäc söû duïng khaùng sinh trong moät thôøi gian daøi ñaõ ñeå laïi nhieàu haäu quaû khoâng mong muoán nhö söï khaùng thuoác cuûa vi khuaån hoaëc roái loaïn heä vi sinh vaät ñöôøng ruoät laøm beänh taùi phaùt naëng hôn, daãn ñeán ngaøy caøng khoù ñieàu trò, nghieâm troïng hôn laø söï toàn dö khaùng sinh trong thòt daãn ñeán phaåm chaát thòt giaûm, haï giaù thaønh saûn phaåm gaây thieât haïi lôùn trong chaên nuoâi.
Ñeå khaéc phuïc tình traïng naøy, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu söû duïng tröïc tieáp vi sinh vaät soáng, coù lôïi, caùc daïng cheá phaåm enzyme töø vi sinh vaät. Keát quaû ñaõ chöùng minh ñöôïc lôïi ích cuûa nhöõng vi khuaån coù lôïi naøy trong vieäc phoøng vaø ñieàu trò moät soá beänh trong chaên nuoâi, thuûy saûn vaø cho caû con ngöôøi. Ñieàu quan troïng laø noù khoâng ñeå laïi nhöõng haäu quaû hay di chöùng nhö khi söû duïng caùc loaïi hoùa chaát vaø thuoác khaùng sinh. Vaø moät trong nhöõng vi khuaån coù lôïi ñöôïc quan taâm nhieàu ñeán laø Bacillus subtilis.
SVTH: HUYØNH THÒ THUÙY OANH 1 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP GVHD: NGUYEÃN NGOÏC HAÛI Ñöôïc söï chaáp nhaän cuûa khoa Coâng Ngheä Sinh Hoïc tröôøng Ñaïi hoïc Môû Baùn Coâng TPHCM, cuøng vôùi söï höôùng daãn cuûa thaày Nguyeãn Ngoïc Haûi, chuùng toâi thöïc hieän ñeà taøi:“Thöû nghieäm saûn xuaát cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza” Vôùi trình ñoä chuyeân moân , kinh nghieäm vaø thôøi gian coù haïn neân chuùng toâi chæ khaûo saùt nhöõng vaán ñeà cô baûn vaø khoâng sao traùnh khoûi nhöõng sai laàm thieáu soùt. Chuùng toâi raát mong ñöôïc söï goùp yù cuûa quí thaày coâ, caùc anh, chò vaø caùc baïn.MUÏC ÑÍCH Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän: moâi tröôøng, nuoâi caáy, chaát boå sung, haøm löôïng gioáng vaø thôøi gian phuø hôïp cho vieäc sinh nhieàu enzyme proteaza cuûa vi khuaån Bacillus subtilis, töø ñoù laøm cô sôû saûn xuaát thöû nghieäm cheá phaåm vi khuaån sinh enzyme naøy.NOÄI DUNG ÑEÀ TAØI - Phaân laäp vaø giaùm ñònh vi khuaån Bacillus subtilis trong töï nhieân ( töø ñaát ) Choïn chuûng Bacillus subtilis coù khaû naêng sinh enzyme proteaza cao töø chuûng ñaõ phaân laäp ñöôïc. - Tìm ñieàu kieän nuoâi caáy, tæ leä naïp gioáng, moâi tröôøng , chaát boå sung, thôøi gian thu hoaïch thích hôïp ñeå vi khuaån Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza vaø taïo sinh khoái toái öu. - Saûn xuaát thöû nghieäm cheá phaåm Bacillus subtilis sinh enzyme ôû qui moâ phoøng thí nghieäm.
- Kieåm tra soá löôïng teá baøo vi khuaån cuûa cheá phaåm trong thôøi gian baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng. SVTH: HUYØNH THÒ THUÙY OANH 2 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP GVHD: NGUYEÃN NGOÏC HAÛI PHAÀN 2: TOÅNG QUAN 2. SÔ LÖÔÏC VEÀ ENZYME Enzyme hay coøn goïi laø men laø chaát xuùc taùc sinh hoïc coù baûn chaát laø protein. Enzyme coù trong moïi teá baøo cô theå sinh vaät.
Enzyme khoâng nhöõng laøm nhieäm vuï xuùc taùc ñaëc hieäu cho caùc phaûn öùng hoùa hoïc nhaát ñònh trong cô theå sinh vaät ( phaûn öùng cuûa caùc quaù trình trao ñoåi chaát trong teá baøo cô theå soáng ) goïi laø “in vivo” maø coøn xuùc taùc cho caùc phaûn öùng ngoaøi teá baøo “in vitro” Enzyme coù hieäu suaát xuùc taùc cöïc kyø lôùn. Hoaït ñoä xuùc taùc cuûa enzyme lôùn gaáp haøng traêm, haøng nghìn hoaëc haøng trieäu laàn caùc chaát xuùc taùc voâ cô vaø höõu cô khaùc.Caáu taïo cuûa enzyme Enzyme coù khaû naêng vaø hieäu löïc xuùc taùc raát lôùn ôû nhieät ñoä thöôøng vaø coù tính ñaëc hieäu raát cao neân caáu taïo phaân töû cuûa enzyme raát tinh vi vaø phöùc taïp. Enzyme ñöôïc caáu taïo töø caùc L –α – axit amin , keát hôïp vôùi nhau qua lieân keát peptit. Chuùng coù phaân töû löôïng raát lôùn töø 20.000 dalton Enzyme ñöôïc chia thaønh hai loaïi: Enzyme ñôn giaûn: laø enzyme maø trong caáu truùc chæ coù protein thuaàn tuyù Enzyme phöùc taïp :laø enzyme maø trong caáu truùc ngoaøi protein coøn coù caùc thaønh phaàn khaùc.
Phaàn protein coøn ñöôïc goïi laø apoenzyme, phaàn khoâng phaûi protein laø coenzyme. Coenzyme thöôøng chöùa moät soá vitamin hoøa tan trong nöôùc, moät soá kim loaïi coù vai troø quan troïng trong hoaït ñoäng cuûa enzyme. Coenzyme coù theå lieân keát chaët cheõ vôùi apoenzyme hoaëc coù theå deã daøng ñöôïc taùch ra. SVTH: HUYØNH THÒ THUÙY OANH 3 LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP GVHD: NGUYEÃN NGOÏC HAÛI 2.Tính chaát cuûa enzyme Ñaëc tính quan troïng nhaát cuûa enzyme ñoù laø tính ñaëc hieäu.