Luận văn thạc sĩ vnua tuyển chọn định tên vi khuẩn sinh enzyme β galactosidase ưa lạnh bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu định tên vi khuẩn sinh enzyme β galactosidase ưa lạnh và ứng dụng trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose.

• Tác giả: Nguyễn Thị Huyên
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Tiến Thành
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh enzyme β-galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 7. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU
• 8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 8.1. TỔNG QUAN VỀ SỮA TƯƠI
• 8.2. Tình hình sản xuất
• 9. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 9.1. Đối tượng nghiên cứu
• 9.2. Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm. Thiết bị và dụng cụ
• 9.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 9.4. Nội dung nghiên cứu
• 9.5. Phương pháp nghiên cứu
• 9.5.1. Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase
• 9.5.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase
• 9.5.3. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp
• 9.5.4. Phương pháp tinh sạch sơ bộ β-galactosidase
• 9.5.5. Phương pháp xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ
• 9.5.6. Định danh vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh
• 9.5.7. Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng enzyme β-galactosidase ưa lạnh
• 10. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 10.1. Tuyển chọn vi khuẩn lactic, Bacillus sinh β-galactosidase
• 10.2. Kết quả xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal
• 10.3. Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn lactic và Bacillus
• 10.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase nội bào của hai chủng SC3 và SC4
• 10.5. Tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp
• 10.6. Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase
• 10.7. Đặc tính của β-galactosidase từ chủng SC3 sau khi tinh sạch sơ bộ
• 10.8. Độ bền của β-galactosidase ở 4oC
• 10.9. Khả năng phân giải lactose trong sữa của β-galactosidase ở 4ºC
• 10.10. Định danh chủng SC3 bằng phương pháp xác định trình tự gen 16 rDNA
• 10.11. Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose
• 11. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về enzyme β galactosidase ưa lạnh trong sản xuất sữa tươi không lactose

Enzyme β-galactosidase là một enzyme quan trọng trong quá trình phân giải đường lactose thành glucose và galactose. Việc nghiên cứu enzyme này, đặc biệt là các chủng enzyme ưa lạnh, có ý nghĩa lớn trong sản xuất sữa tươi không lactose. Sữa tươi là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, nhưng đối với những người không dung nạp lactose, việc tiêu thụ sữa có thể gây ra các triệu chứng khó chịu. Do đó, việc ứng dụng enzyme β-galactosidase trong sản xuất sữa không lactose là một giải pháp hiệu quả.

1.1. Enzyme β galactosidase và vai trò trong sản xuất sữa

Enzyme β-galactosidase có khả năng phân giải lactose, giúp giảm thiểu lượng đường lactose trong sữa. Điều này rất quan trọng cho những người không dung nạp lactose, giúp họ có thể tiêu thụ sữa mà không gặp phải các vấn đề tiêu hóa. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng vi sinh vật là nguồn phổ biến nhất do khả năng sinh sản nhanh và chi phí thấp.

1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme β galactosidase ưa lạnh

Nghiên cứu về enzyme β-galactosidase ưa lạnh đang ngày càng được chú trọng. Các chủng vi khuẩn như Bacillus và Lactococcus đã được xác định là nguồn enzyme tiềm năng. Việc sử dụng enzyme ưa lạnh không chỉ giúp tiết kiệm năng lượng mà còn tăng hiệu quả trong quá trình sản xuất sữa tươi không lactose.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất sữa tươi không lactose

Mặc dù enzyme β-galactosidase mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình sản xuất sữa tươi không lactose. Một trong những vấn đề chính là việc lựa chọn chủng vi khuẩn phù hợp để sản xuất enzyme có hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp. Ngoài ra, việc kiểm soát chất lượng sản phẩm cũng là một yếu tố quan trọng.

2.1. Thách thức trong việc lựa chọn chủng vi khuẩn

Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sinh enzyme β-galactosidase có hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp là một thách thức lớn. Các nghiên cứu hiện tại đang tìm kiếm các chủng vi khuẩn mới có khả năng sinh enzyme này với hiệu suất cao, nhằm tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.2. Kiểm soát chất lượng sản phẩm sữa không lactose

Kiểm soát chất lượng sản phẩm là một yếu tố quan trọng trong sản xuất sữa tươi không lactose. Cần đảm bảo rằng enzyme được sử dụng có hoạt tính ổn định và không gây ảnh hưởng đến hương vị cũng như chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu enzyme β galactosidase ưa lạnh

Để nghiên cứu enzyme β-galactosidase ưa lạnh, các phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Việc tuyển chọn vi khuẩn, xác định hoạt độ enzyme và tinh sạch enzyme là những bước quan trọng trong quy trình nghiên cứu. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định được các chủng vi khuẩn tiềm năng mà còn tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme.

3.1. Tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme β galactosidase

Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme β-galactosidase bao gồm việc nuôi cấy và kiểm tra hoạt độ enzyme. Các chủng vi khuẩn được lựa chọn dựa trên khả năng sinh enzyme ở nhiệt độ thấp, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất sữa không lactose.

3.2. Tinh sạch enzyme β galactosidase

Tinh sạch enzyme là bước quan trọng để thu được enzyme có hoạt tính cao. Các phương pháp như sử dụng muối amoni sunphat và các kỹ thuật sắc ký đã được áp dụng để đạt được enzyme tinh khiết, đảm bảo hiệu suất cao trong quá trình sản xuất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme β galactosidase trong sản xuất sữa

Enzyme β-galactosidase không chỉ được nghiên cứu mà còn được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sữa tươi không lactose. Việc sử dụng enzyme này giúp cải thiện chất lượng sản phẩm, đồng thời đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng không dung nạp lactose. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme có thể phân giải lactose hiệu quả, tạo ra sản phẩm sữa an toàn và dinh dưỡng.

4.1. Quy trình sản xuất sữa tươi không lactose

Quy trình sản xuất sữa tươi không lactose bao gồm việc bổ sung enzyme β-galactosidase vào sữa tươi trong quá trình bảo quản lạnh. Enzyme sẽ phân giải lactose thành glucose và galactose, giúp sản phẩm cuối cùng không còn lactose và an toàn cho người tiêu dùng.

4.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme β-galactosidase có thể giảm lượng lactose trong sữa xuống mức tối thiểu, đồng thời giữ nguyên chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm. Kết quả cho thấy enzyme này có tiềm năng lớn trong ngành công nghiệp chế biến sữa.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu enzyme β galactosidase

Nghiên cứu về enzyme β-galactosidase ưa lạnh trong sản xuất sữa tươi không lactose đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp thực phẩm. Việc phát triển các chủng vi khuẩn mới và tối ưu hóa quy trình sản xuất sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn hơn nữa.

5.1. Triển vọng nghiên cứu enzyme trong ngành thực phẩm

Nghiên cứu về enzyme β-galactosidase sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các sản phẩm sữa không lactose chất lượng cao hơn. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc cải thiện hiệu suất enzyme và ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm khác.

5.2. Định hướng phát triển sản phẩm sữa không lactose

Định hướng phát triển sản phẩm sữa không lactose sẽ tập trung vào việc nâng cao chất lượng và đa dạng hóa sản phẩm. Các sản phẩm mới sẽ được nghiên cứu và phát triển để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, đặc biệt là những người không dung nạp lactose.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường tiêu thụ sữa tại Việt Nam đang ghi nhận tốc độ tăng trưởng ấn tượng với mức chi tiêu cho các sản phẩm sữa chiếm hơn 10% trong tổng chi tiêu thực phẩm của các hộ gia đình. Giai đoạn 2010 - 2015, sản lượng sữa tươi sản xuất trong nước tăng trung bình 16%/năm, tăng từ 520,6 triệu lít lên mức 1.093 triệu lít vào năm 2015, đưa doanh thu toàn ngành đạt khoảng 92.000 tỷ đồng. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất đối với việc mở rộng nhóm người tiêu dùng trưởng thành là hội chứng bất dung nạp lactose. Theo thống kê y học, khoảng 75% dân số thế giới và xấp xỉ 46% người trên 50 tuổi không có khả năng dung nạp lactose do thiếu hụt enzyme $\beta$-galactosidase tự nhiên trong hệ tiêu hóa.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm đặt ra là các quy trình thủy phân lactose truyền thống thường đòi hỏi nhiệt độ cao từ 37°C đến 50°C, gây tốn kém năng lượng gia nhiệt và làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn làm chua sữa tươi nguyên liệu. Đề tài hướng tới mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn an toàn có khả năng sinh tổng hợp enzyme $\beta$-galactosidase ưa lạnh, tinh sạch sơ bộ, khảo sát đặc tính xúc tác ở nhiệt độ thấp và bước đầu ứng dụng phân giải lactose trực tiếp trong điều kiện bảo quản lạnh 4°C.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 8/2017 đến tháng 10/2018 tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Khoa học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp giải pháp công nghệ sinh học đột phá giúp thủy phân đến 59,33% lượng lactose trong sữa tươi ngay trong chuỗi vận chuyển lạnh 4°C, tạo nền tảng vững chắc để các doanh nghiệp sữa nội địa phát triển các dòng sản phẩm sữa tươi tiệt trùng không lactose đạt chuẩn chất lượng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết động học enzyme và cơ chế thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glycosidic của enzyme $\beta$-galactosidase (EC 3.2.1.23). Enzyme này xúc tác phản ứng cắt đường đôi lactose thành hai đường đơn D-glucose và D-galactose, đồng thời có khả năng thực hiện phản ứng chuyển vị galactosyl (transgalactosylation) để tạo chuỗi galacto-oligosaccharides (GOS) có hoạt tính prebiotic kích thích lợi khuẩn đường ruột.

Bên cạnh đó, khung lý thuyết về enzyme ưa lạnh (psychrophilic/cold-active enzymes) được vận dụng để phân tích cấu trúc linh động của enzyme vi sinh vật thích nghi ở nhiệt độ thấp 4°C. Các khái niệm cốt lõi bao gồm: hội chứng bất dung nạp lactose, vi khuẩn sinh enzyme an toàn đạt chuẩn GRAS (Generally Regarded As Safe), hoạt tính enzyme nội bào/ngoại bào, và công nghệ bảo quản sữa tươi không phá hủy dưỡng chất.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 68 chủng vi khuẩn (thuộc nhóm vi khuẩn lactic và Bacillus) được thu thập từ 4 nhóm nguồn sinh thái khác nhau: 10 mẫu sữa tươi và sữa chua thương mại, 2 mẫu phomai, 33 mẫu đất trang trại bò sữa tại Mộc Châu, Ba Vì, Phù Đổng, và 17 mẫu phân bò sữa tại Nghệ An và Phù Đổng. Phương pháp chọn mẫu phân tầng có chủ đích được áp dụng nhằm tối đa hóa khả năng tìm kiếm các chủng vi sinh vật bản địa thích nghi với môi trường giàu cơ chất lactose và điều kiện nhiệt độ thấp.

Hệ thống phương pháp phân tích chuyên sâu được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chặt chẽ:

• Sàng lọc định tính: Sử dụng môi trường đĩa thạch NA và MRS bổ sung chỉ thị X-gal (nồng độ 20 mg/ml) kết hợp chất cảm ứng IPTG 0,1M theo nguyên lý tạo màu xanh indigo đặc trưng khi enzyme thủy phân cơ chất.
• Định lượng hoạt độ enzyme: Sử dụng phương pháp so màu quang phổ kế UV-VIS ở bước sóng 420 nm với cơ chất tổng hợp ortho-nitrophenyl-$\beta$-D-galactopyranoside (oNPG), xây dựng đường chuẩn oNP với hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 0,999$ nhằm xác định chính xác hoạt tính riêng (U/ml).
• Định lượng protein tổng số: Áp dụng phương pháp Bradford (1976) sử dụng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue ở bước sóng 595 nm với đường chuẩn protein huyết thanh bò (BSA) từ 0,1 đến 1,0 mg/ml.
• Tinh sạch sơ bộ: Tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối amonisunfat $(NH_4)_2SO_4$ ở các ngưỡng bão hòa 40%, 50%, 60% và 70% ở 4°C qua đêm.
• Định lượng lactose trong sữa: Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với đầu dò khúc xạ RID, cột Carbohydrate C18 ($250 \times 4$ mm, 5 $\mu$m), pha động acetonitrile:nước khử ion (tỷ lệ 80:20 v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, đường chuẩn lactose đạt $R^2 = 0,9995$.
• Định danh phân tử: Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi chuyên biệt 27F/1492R (35 chu kỳ nhiệt), giải trình tự gen và đối chiếu ngân hàng dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST.

Timeline nghiên cứu được triển khai xuyên suốt 14 tháng, từ khâu hoạt hóa vi sinh vật, khảo sát động học sinh trưởng 0 - 30 giờ, tinh sạch enzyme đến thử nghiệm thủy phân trên nền mẫu sữa tươi thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc từ 68 chủng vi khuẩn ban đầu đã ghi nhận 11 chủng (chiếm tỷ lệ 16,18%) có phản ứng dương tính trên đĩa thạch X-gal tạo khuẩn lạc màu xanh da trời. Đánh giá hoạt độ enzyme của 11 chủng này cho thấy hoạt tính tập trung chủ yếu ở dạng nội bào; trong đó, hai chủng SC3 và SC4 phân lập từ sữa chua thể hiện hoạt lực cao nhất với giá trị lần lượt là 390,32 U/l và 361,30 U/l.

Khảo sát động học lên men chỉ ra rằng thời gian nuôi cấy tối ưu để thu nhận enzyme nội bào của chủng SC3 và SC4 là 24 giờ ở 37°C, đạt cực đại tương ứng 389,58 U/l và 369,16 U/l, trùng khớp với giai đoạn đầu của pha cân bằng sinh khối.

Đánh giá khả năng xúc tác ở nhiệt độ thấp cho thấy tại 4°C, chủng SC3 duy trì 24,36% hoạt tính (đạt 95,34 U/l) so với mức 100% tại 30°C (391,36 U/l). Tỷ lệ duy trì hoạt tính này của SC3 cao hơn gấp 2,19 lần so với chủng SC4 (chỉ đạt 11,10% với 41,02 U/l).

Quá trình tinh sạch sơ bộ dịch enzyme nội bào chủng SC3 bằng muối $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa 60% mang lại hiệu quả vượt bậc: hoạt tính riêng đạt 2,783 U/mg protein (tăng gấp 7,67 lần so với mức 0,363 U/mg của dịch thô), với hiệu suất thu hồi enzyme đạt 86,63%.

Thử nghiệm độ bền nhiệt độ thấp khẳng định enzyme đã tinh sạch từ chủng SC3 có tính ổn định xuất sắc, duy trì được 56,15% hoạt tính ban đầu sau 24 ngày (tương đương 512 giờ) bảo quản liên tục ở 4°C và pH 6,5. Khi thử nghiệm thủy phân lactose trong sữa tươi ở 4°C với liều lượng 2,110 U/1g lactose (công thức CT2), enzyme đã phân giải 59,33% lượng đường lactose sau 27 giờ (tỷ lệ lactose còn lại giảm xuống mức 40,67%). Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA xác định chủng SC3 là Streptococcus thermophilus với độ tương đồng 99%.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu thực nghiệm trong nghiên cứu có thể được mô hình hóa trực quan thông qua đồ thị tương quan động học giữa mật độ quang tế bào $OD_{600}$ và hoạt độ enzyme theo thời gian nuôi cấy 0 - 30 giờ, phản ánh rõ sự đồng pha giữa quá trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp enzyme. Ngoài ra, sắc ký đồ HPLC-RID qua các mốc thời gian 6h, 12h, 18h, 24h và 27h minh chứng rõ nét cho sự suy giảm diện tích peak sắc ký của lactose tương ứng với quá trình phân giải tạo glucose và galactose.

Nguyên nhân chủng Streptococcus thermophilus SC3 thể hiện hoạt tính và độ bền vượt trội ở 4°C bắt nguồn từ tính linh hoạt trong cấu trúc không gian của enzyme ưa lạnh, giúp trung tâm hoạt động dễ dàng tiếp cận cơ chất ngay cả khi động năng phân tử bị suy giảm ở nhiệt độ thấp. Khi so sánh với các công bố quốc tế, enzyme từ Lactobacillus plantarum HF571129 giảm 25% hoạt tính chỉ sau 7 giờ ở 4°C, hay enzyme từ Lactobacillus acidophilus giảm 45% hoạt tính khi nhiệt độ hạ từ 40°C xuống 30°C. Như vậy, enzyme $\beta$-galactosidase từ chủng SC3 sở hữu tính bền lạnh vượt trội, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu kỹ thuật để ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa không lactose.

Đề xuất và khuyến nghị

• Tối ưu hóa công nghệ lên men chìm: Tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy (nồng độ lactose, pepton, cao men) và các thông số vận hành bioreactor (tốc độ khuấy, độ thông khí $pO_2$, pH 6,5) nhằm nâng cao sinh khối chủng Streptococcus thermophilus SC3, nâng hoạt độ enzyme nội bào từ 389,58 U/l lên trên 1.500 U/l trong vòng 6 - 12 tháng, do các viện và bộ môn công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.
• Phát triển kỹ thuật cô đặc và sấy đông khô chế phẩm enzyme: Ứng dụng hệ thống lọc màng tiếp tuyến (TFF) với ngưỡng cắt phân tử 10 - 30 kDa kết hợp kỹ thuật đông khô chân không để tạo chế phẩm enzyme dạng bột có hoạt tính thương mại đạt từ 5.000 U/g trở lên trong thời gian 12 - 18 tháng, do các trung tâm R&D doanh nghiệp thực phẩm triển khai.
• Tích hợp quy trình thủy phân vào chuỗi vận chuyển lạnh: Thiết lập quy trình đưa trực tiếp enzyme $\beta$-galactosidase ưa lạnh vào các bồn bảo quản sữa và xe bồn vận chuyển ở nhiệt độ 4°C ngay sau khi thu vắt tại trang trại, tận dụng chu kỳ lưu chuyển 24 - 27 giờ để đạt tỷ lệ phân giải lactose trên 90% trước khi đưa vào dây chuyền tiệt trùng UHT, triển khai thử nghiệm tại các nhà máy sữa trong vòng 18 tháng.
• Xây dựng tiêu chuẩn an toàn và đánh giá cảm quan mở rộng: Hoàn thiện hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở đối với phụ gia enzyme từ chủng vi khuẩn lactic GRAS, đồng thời tiến hành thử nghiệm cảm quan người tiêu dùng (về độ ngọt tự nhiên và cấu trúc sữa) trong vòng 24 tháng bởi liên minh doanh nghiệp và cơ quan kiểm nghiệm an toàn thực phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh học: Tiếp cận quy trình sàng lọc vi khuẩn sinh enzyme ưa lạnh, phương pháp định lượng enzyme bằng oNPG, kỹ thuật tinh sạch muối phân đoạn và phân tích sắc ký HPLC-RID.
• Kỹ sư công nghệ và chuyên gia R&D tại các doanh nghiệp chế biến sữa: Tham khảo giải pháp kỹ thuật tích hợp enzyme phân giải lactose trực tiếp trong bồn lạnh 4°C, giúp tiết kiệm năng lượng và giảm chi phí sản xuất sữa không lactose.
• Chủ trang trại chăn nuôi bò sữa và đơn vị quản lý chuỗi cung ứng lạnh: Nắm bắt quy trình sơ chế và nâng cao giá trị thương phẩm của sữa tươi nguyên liệu ngay tại trạm thu gom trước khi chuyển tới nhà máy.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và chuyên gia dinh dưỡng: Khai thác dữ liệu khoa học về độ an toàn của chủng vi khuẩn lactic Streptococcus thermophilus SC3 phục vụ xây dựng danh mục enzyme an toàn trong công nghiệp thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao việc thủy phân lactose ở nhiệt độ 4°C lại có ý nghĩa vượt trội trong công nghệ chế biến sữa? Thủy phân lactose ở 4°C cho phép tích hợp phản ứng enzyme trực tiếp vào thời gian bảo quản và vận chuyển sữa tươi từ trang trại về nhà máy (kéo dài 24 - 27 giờ). Quá trình này giúp ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng sữa, không làm biến tính protein nhiệt nhạy cảm, đồng thời cắt giảm hoàn toàn chi phí năng lượng gia nhiệt.

Chủng vi khuẩn Streptococcus thermophilus SC3 được tuyển chọn có an toàn cho người dùng không? Chủng SC3 được phân lập trực tiếp từ sữa chua thương phẩm và định danh qua phân tích trình tự 16S rDNA thuộc loài Streptococcus thermophilus. Đây là loài vi khuẩn lactic kinh điển thuộc nhóm GRAS (Generally Regarded As Safe) được FDA công nhận, hoàn toàn không sinh độc tố và tuyệt đối an toàn trong sản xuất thực phẩm.

Tại sao nồng độ muối amonisunfat 60% bão hòa lại được chọn để tinh sạch sơ bộ enzyme? Tại nồng độ $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa 60%, chế phẩm thu được có hoạt tính riêng cao nhất đạt 2,783 U/mg protein (tăng 7,67 lần so với dịch thô 0,363 U/mg) cùng hiệu suất thu hồi đạt 86,63%. Ở nồng độ 70%, dù hiệu suất thu hồi tương đương nhưng hoạt tính riêng giảm xuống còn 2,038 U/mg do kết tủa nhiều protein tạp.

Độ bền hoạt tính của enzyme β-galactosidase SC3 ở nhiệt độ 4°C kéo dài bao lâu? Enzyme sau tinh sạch sơ bộ có độ bền lạnh rất cao, duy trì được 56,15% hoạt tính sau 24 ngày (512 giờ) bảo quản liên tục ở 4°C và pH 6,5. Hoạt tính giảm nhanh trong 6 ngày đầu (còn 82,63%) và duy trì mức ổn định trong suốt giai đoạn từ ngày 18 đến ngày 24.

Làm thế nào để nâng cao tỷ lệ thủy phân lactose từ mức 59,33% lên trên 90% trong thực tế sản xuất? Để phân giải triệt để lactose, doanh nghiệp cần sử dụng chế phẩm enzyme đã qua siêu lọc cô đặc hoặc đông khô nhằm tăng mật độ hoạt lực lên trên 5.000 U/g thay vì dùng dịch enzyme thô, kết hợp tối ưu hóa tỷ lệ enzyme bổ sung trên một đơn vị cơ chất lactose trong bồn ủ lạnh.

Kết luận

• Tuyển chọn thành công 11 chủng sinh $\beta$-galactosidase từ 68 chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó chủng SC3 cho hoạt độ nội bào cao nhất đạt 389,58 U/l sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C.
• Xác định enzyme từ chủng SC3 có đặc tính ưa lạnh vượt trội, duy trì 24,36% hoạt tính ở 4°C so với 30°C và giữ vững 56,15% hoạt tính sau 24 ngày bảo quản tại 4°C.
• Tinh sạch sơ bộ thành công bằng $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa 60%, đạt hoạt tính riêng 2,783 U/mg protein với hiệu suất thu hồi 86,63%.
• Phân giải thành công 59,33% lượng đường lactose trong sữa tươi sau 27 giờ ở điều kiện bảo quản lạnh 4°C với liều lượng enzyme 2,110 U/1g lactose.
• Định danh chính xác chủng vi khuẩn tiềm năng bằng kỹ thuật sinh học phân tử 16S rDNA là Streptococcus thermophilus SC3 đạt độ tương đồng 99%.

Luận văn đã đóng góp một giải pháp công nghệ mang tính tiên phong tại Việt Nam, chứng minh tính khả thi của việc sử dụng enzyme $\beta$-galactosidase ưa lạnh từ vi khuẩn lactic an toàn để sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose ngay trong chuỗi cung ứng lạnh. Trong 12 - 24 tháng tới, các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp cần phối hợp mở rộng quy mô sản xuất enzyme và tiến hành chuyển giao công nghệ. Quý bạn đọc, nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể liên hệ các phòng thí nghiệm chuyên ngành công nghệ thực phẩm để tiếp nhận chuyển giao quy trình và hợp tác phát triển sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội phát triển con người càng quan tâm tới chất lượng cuộc sống, đặc biệt là chế độ dinh dưỡng trong khẩu phần ăn hàng ngày của mỗi gia đình. Việc chi tiêu cho sữa chiếm hơn 10% trong tổng chi tiêu cho thực phẩm tại Việt Nam (VIRAC, JSC, 2016). Sữa là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein và các khoáng chất thiết yếu, tiện lợi khi sử dụng và đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em và người già (Furlan et al. Trong sữa động vật phần lớn là đường lactose (β-D-galactopyranosyl-(1- 4)-α-D-glucopyranose, loại đường đôi gồm hai đơn phân glucose và galactose liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside).

Cơ thể muốn hấp thụ được thì ruột non phải tiết ra một loại enzyme là β-galactosidase có chức năng phân giải đường lactose thành đường đơn là glucose và galactose. Tuy nhiên, ở một số người, cơ thể thiếu β-galactosidase (hiện tượng bất dung nạp lactose) khiến đường lactose không được tiêu hóa, khi vào cơ thể vi khuẩn đường ruột sẽ chuyển hóa nó thành acid lactic và carbondioxide, khiến người sử dụng gặp các triệu trứng: đầy hơi, chướng bụng, nôn, tiêu chảy. Trên thế giới có khoảng 75% dân số không có khả năng dung nạp lactose, trong đó có khoảng 46% người trên 50 tuổi gặp tình trạng này. Nguyên nhân là do khả năng tổng hợp β-galactosidase bị mất dần sau một thời gian dài không sử dụng sữa (Nguyễn Văn Cách và cs.

Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng β-galactosidase để sản xuất các sản phẩm sữa cho những người không hấp thu đường lactose là rất cần thiết. Tất cả các sản phẩm sữa đều được sản xuất từ sữa tươi. Sữa sau khi vắt (sữa tươi) sẽ được bảo quản lạnh bằng các bồn hoặc xe chứa để vận chuyển từ nông trại về nhà máy chờ chế biến, đây cũng là thời gian lý tưởng để thực hiện quá trình phân giải lactose trong sữa bằng cách bổ sung enzyme β-galactosidase chịu lạnh, vì nó tiết kiệm được chi phí và thời gian trong quá trình chờ sữa về đến nhà máy. Khi về đến nhà máy hoặc trước khi đưa vào sản xuất đường lactose trong sữa đã được phân giải hết thành đường glucose và galactose, sẵn sàng cho quá trình chế biến tiếp theo để tạo ra các sản phẩm sữa không lactose.

β-galactosidase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên, có thể ở thực vật, động vật hoặc vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn thu nhận enzyme từ vi sinh vật được 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ứng dụng nhiều hơn cả, vì tốc độ sinh sản nhanh và sinh khối lớn. Mặt khác, môi trường dinh dưỡng lại rẻ tiền, dễ kiếm nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao và ít tốn kém (Đỗ Thị Bích Thủy, 2012). Enzyme β-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau: vi khuẩn (Bacillus subtilis, Lactococcus pneumonira, Lactobacilus delbrueckii.), nấm men (Cryptococcus laurentii, Candida pseudtropicalis,.) hay nấm mốc (Aspergillus awmori, Chaetomium globosum,.) (Davail et al.

Trong đó, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều do có nhiều ưu điểm hơn các loài vi sinh vật khác bởi chúng là những sinh vật an toàn, dễ nuôi cấy và chịu được pH thấp. Hiện nay có rất nhiều các công trình nghiên cứu về vi sinh vật sinh enzyme β-galactosidase tại Việt Nam và trên thế giới. Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên cứu về các chủng vi khuẩn sinh enzyme β-galactosidase chịu lạnh để ứng dụng trong ngành công nghệ chế biến sữa. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Tuyển chọn, định tên vi khuẩn sinh β-galactosidase ưa lạnh, bước đầu nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose.

MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1. Mục đích Xác định được 1-2 chủng vi khuẩn mới có khả năng sinh β-galactosidase phân giải lactose ở nhiệt độ thấp. Yêu cầu - Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase. - Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase.

- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp. - Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase. - Xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ. - Định tên vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh.

- Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng β-galactosidase ưa lạnh. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TỔNG QUAN VỀ SỮA TƯƠI 2.

Sữa tươi Sữa tươi nguyên liệu theo định nghĩa là sữa được lấy từ động vật cho sữa (bò, trâu, dê, cừu.) mà không bổ sung hoặc rút bớt các thành phần của sữa và chưa qua xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40°C (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2004). Trong khi đó sữa tươi tiệt trùng lại được định nghĩa là sản phẩm được chế biến hoàn toàn từ sữa tươi nguyên liệu, có bổ sung đường, các loại nguyên liêu khác như các loại nước quả, cacao để tạo hương vị cho sản phẩm, có hoặc không bổ sung phụ gia thực phẩm, đã qua xử lý ở nhiệt độ cao (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2009). Để chuẩn hoá nguyên liệu, có thể bổ sung sữa bột hoặc chất béo từ sữa nhưng không quá 1% tính theo khối lượng của sữa tươi nguyên liệu. Trong sữa có nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sức khỏe: Bảng 2.

Thành phần dinh dưỡng của sữa bò tươi tính trên 100g Thành phần dinh dưỡng Đơn vị Hàm lượng Nước g 86,2 Năng lượng Kcal 74 Protein g 3,9 Lipid g 4,4 Glucid g 4,8 Lactose g 5,26 Calci mg 120 Nguồn: Bộ y tế (2007) Các thành phần chính trong sữa tươi gồm: protein, lipid, glucid, các vitamin, khoáng chất (canxi) và một lượng lớn đường lactose. Các chất dinh dưỡng này cần thiết cho mọi lứa tuổi. Tuy nhiên một lượng lớn đường lactose trong sữa sẽ là trở ngại cho những người không dung nạp lactose. Hiện nay, sữa tươi tiệt trùng có thể được đựng trong hộp giấy, chai thủy tinh hoặc chai nhựa kín.

Sản phẩm có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện không mở bao bì có thê bảo quản trong khoảng thời gian từ 6 – 8 tháng. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tình hình sản xuất Ngành công nghiệp sản xuất, chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa của Việt Nam những năm gần đây có sự phát triển mạnh, đáp ứng nhu cầu trong nước, từng bước thay thế các mặt hàng sữa nhập khẩu và tham gia xuất khẩu với sự đa dạng về mẫu mã và chủng loại. Bên cạnh đó, ngành đã có nhiều đóng góp đáng kể vào ngân sách nhà nước, tạo nhiều việc làm cho người lao động, góp phần bảo đảm đời sống nhân dân.

Do thuộc nhóm sản phẩm thiết yếu, nên dù trong những năm kinh doanh ảm đạm của các doanh nghiệp trong toàn bộ nền kinh tế, các doanh nghiệp ngành sữa vẫn giữ tăng trưởng mạnh với mức 2 con số. Từ năm 2001 – 2014, sản xuất sữa trong nước tăng trưởng 26,6%/năm, đạt 456400 tấn năm 2013, chỉ đủ đáp ứng 28% nhu cầu trong nước và đạt 549500 tấn vào năm 2014. Hai mảng chính trong ngành sữa là sữa nước và sữa bột với tổng giá trị chiếm gần 3/4 giá trị thị trường, trong đó giá trị sữa nước chiếm 30%. Tính chung giai đoạn 2010-2015, sản lượng sản xuất sữa tươi tăng trung bình 16%/năm, từ mức 520,6 triệu lít năm 2010 lên 1093 triệu lít năm 2015.

Theo Tổng Cục Thống kê, năm 2015 ngành sữa Việt Nam có sản lượng sản xuất các loại sữa cao nhất từ trước đến nay. Sản lượng sản xuất sữa giai đoạn 2010-2015 Nguồn: Tổng cục Thống kê (2015) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tháng 6/2016, sản lượng sữa tươi đạt 99,1 triệu lít; tăng 1,3% so với tháng 5 trước đó. Tính chung 6 tháng đầu năm 2016, sản lượng sữa tươi ước đạt 553,1 triệu lít, tăng 4% so với cùng kỳ năm 2015. Đvt: triệu lít Hình 2.

Sản lượng sữa tươi theo tháng năm 2015 và 6 tháng đầu năm 2016 Nguồn: Tổng cục Thống kê (2016) Trong phân khúc sữa nước, các công ty Việt Nam đang chiếm ưu thế với gần 50% thị phần. Bên cạnh đó, ưu thế về chi phí và thời gian bảo quản cũng đang giúp các công ty Việt Nam làm chủ thị trường trong nhiều nhóm sản phẩm liên quan đến sữa khác như sữa thanh trùng, sữa chua, sữa đặc có đường. Đa số các sản phẩm sữa tại Việt Nam được sản xuất cho trẻ em dưới 3 tuổi và người cao tuổi, trong khi thị trường lớn cho sữa tiêu dùng hàng ngày hay sữa cho người trưởng thành chưa được đầu tư mạnh. Số lượng bò sữa tại Việt Nam tăng khá nhanh trong những năm gần đây.

Theo Tổng cục thống kê, tính đến thời điểm 1/10/2015, Việt Nam có khoảng 257,3 nghìn con bò sữa, tăng 21% so với năm 2014. Tính trong giai đoạn 10 năm gần nhất (2006 – 2015), lượng bò sữa tăng trưởng trung bình hơn 11%/năm. Quy mô đàn bò mở rộng là yếu tố tích cực thúc đẩy sản lượng sữa sản xuất tại Việt Nam có xu hướng tăng mạnh qua từng năm. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Ngành sữa đang đẩy mạnh hiện đại hóa các trang trại bò sữa một cách nhanh chóng.

Việt Nam cũng đề ra kế hoạch đáp ứng 60% nhu cầu trong nước đối với sữa tươi, tương ứng dự báo dân số tăng lên 113 triệu người vào năm 2045. Để đáp ứng mục tiêu này, đất nước cần phải phát triển số lượng bò sữa có khả năng sản xuất 5,65 triệu tấn sữa hàng năm. Có khoảng 24000 hộ gia đình tham gia chuỗi sản xuất chăn nuôi phục vụ ngành sữa. Đây là một lực lượng rất quan trọng giúp ngành sữa Việt Nam phát triển bền vững.

Bởi chăn nuôi hộ gia đình quy mô vừa phải sẽ đỡ phải chịu áp lực về môi trường như các trang trại quy mô tập trung quá lớn. Theo Hiệp hội Sữa Việt Nam, nếu không phát triển chăn nuôi hộ gia đình mà chỉ tập trung vào phát triển trang trại quy mô lớn sẽ gặp rất nhiều khó khăn: thiếu đất đai, nông dân mất đất sẽ gặp khó khăn trong cuộc sống mưu sinh, năng suất, bệnh tật và nhất là vấn đề môi trường. Dự báo tăng trưởng sản lượng sữa Việt Nam từ năm 2015 – 2045: - Giai đoạn 2015 – 2025: Tăng trưởng 12%/năm; - Giai đoạn 2026 – 2035: Tăng trưởng 5%/năm; - Giai đoạn 2036 – 2045: Tăng trưởng 3%/năm.