MỞ ĐẦU Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái. Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, một dạng nghỉ của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi trường như khô hạn và thiếu dinh dưỡng. Theo hệ thống phân loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài. Trong số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp.
plantarum (hay còn gọi là B. oryzicola) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B. Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh. Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B.
plantarum được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B. plantarum đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng. Một số chủng như B. plantarum FZB42 cũng đã được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng trừ bệnh cây.
Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B. plantarum trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra. Sản lượng nông sản thu hoạch cũng tăng lên đáng kể khi bổ sung chủng B. plantarum FZB42 vào phân bón.
plantarum sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn. Đa số các chất này được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS). Nhiều chất trong số này đã được nghiên cứu tỉ mỉ về cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y - dược học.
Nhằm tìm kiếm, đánh giá và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, trong luận văn này, chúng tôi trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho cây trồng từ các chủng vi khuẩn B. plantarum có trong bộ sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam. Bên cạnh việc tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chúng tôi còn tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học cũng như tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra từ chủng B. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1. Vi khuẩn Bacillus 1. Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus Định nghĩa khái quát Bacillus là nhóm vi khuẩn khá quen thuộc, hay được nhắc đến trong các tài liệu vi sinh vật học. Trước kia, Bacillus được biết đến như những vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào tử, sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc.
Tuy nhiên, khái niệm đó giờ đây bao quát cho cả Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato) gồm ít nhất 37 chi thuộc 3 họ Bacillaceae, Paenibacillaceae và Alicyclobacillaceae. Chi Bacillus chỉ là một chi trong Bacillus nhóm lớn và thường được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto). Môi trường phân bố Vi khuẩn Bacillus phân bố ở mọi nơi trong sinh quyển. Chúng ta có thể bắt gặp các loài vi khuẩn này trong bất kỳ công bố nào về đa dạng vi sinh vật ở các khu hệ sinh thái, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn, từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương [14, 48].
Trong các hệ sinh thái trên cạn, vi khuẩn Bacillus có thể phân bố ở các vùng đất chua, đất kiềm hay đất trung tính. Một số loài có thể tìm thấy trong các loại đất nhiễm kim loại nặng hay nhiễm asen. Một số loài có khả năng sống ký sinh và gây bệnh cho người, động vật và côn trùng như B. Một số loài là vi sinh vật vùng rễ hay sống cộng sinh trong rễ của một số loại thực vật.
Gần đây, một số loài vi khuẩn mới thuộc chi Bacillus còn được tìm thấy ở độ cao từ 24 đến 41 km trong tầng bình lưu của khí quyển [44]. Các đặc điểm phân loại đặc trưng của chi Bacillus Bacillus là vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào tử, có thể di động bằng tiêm mao, đa số sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ, xếp đôi hay nối với nhau tạo thành các chuỗi dài. Hầu hết các loài vi khuẩn Bacillus có thể sinh sống trên môi trường thạch dinh dưỡng (nutrient agar; NA) hay thạch máu (blood agar).
Hình thái và kích thước khuẩn lạc rất khác nhau giữa các loài khác nhau hay thậm chí giữa các chủng khác nhau trong cùng một loài. Bacillus có phản ứng catalase dương tính nhưng phản ứng oxydase khác nhau giữa các loài khác nhau. Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus Lược sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus Bacillus là một trong những vi khuẩn đầu tiên được con người biết đến sau phát minh về kính hiển vi của Anton van Leeuwenhoek. Các sự kiện nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus bắt đầu từ năm 1835 khi Ehrenberg mô tả và đặt tên một loài vi khuẩn là Vibrio subtilis [14].
Đến năm 1872, Ferdinand Cohn lần đầu tiên phát hiện loài vi khuẩn mà Ehrenberg đã mô tả có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu lại các điều kiện khắc nghiệt của môi trường sống. Ông đặt lại tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis. Trong cùng khoảng thời gian này, Robert Kock cũng phân lập và mô tả tác nhân gây bệnh than là Bacillus anthracis. Ông cũng quan sát thấy loài vi khuẩn này có khả năng sinh nội bào tử như loài Cohn đã mô tả.
Kock đã mô tả chu trình hình thành nội bào tử từ các tế bào dinh dưỡng tới bào tử và ngược lại [14, 18]. Đó là những mốc thời gian quan trọng bắt đầu đánh dấu tiến trình phân lập và phân loại các loài vi khuẩn Bacillus. Sau gần một thế kỷ, rất nhiều các chủng vi khuẩn sống hiếu khí và sinh nội bào tử đã được phát hiện và phân loại. Tuy nhiên, dựa vào các phương pháp phân loại cổ điển như hình thái tế bào mang bào tử (phình ra khi mang bào tử hoặc ngược lại), vị trí bào tử trong tế bào mang bào tử (ở giữa hay ở phía đầu tế bào), hình thái bào tử (hình cầu, hình elip, hay hình trụ), các đặc tính sinh hóa (khả năng đồng hóa các nguồn cacbon hay sản sinh enzyme như catalase, amylase…vv) sinh lý (nhiệt độ và pH tối ưu cho sinh trưởng), số lượng các loài Bacillus được mô tả chỉ nằm trong con số khoảng 30 loài [18].
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đến những thập niên 80 của thế kỷ 20, khi phương pháp phân tích trình tự gien mã hóa riboxôm 16S được ứng dụng vào phân loại vi khuẩn thì số lượng các loài Bacillus bắt đầu tăng lên đáng kể. Thời điểm này cũng bắt đầu đánh dấu sự đổi hoàn toàn hệ thống phân loại vi khuẩn Bacillus [18]. Năm 1991, Ash cùng cộng sự đã xây dựng cây phát sinh chủng loại của 51 loài vi khuẩn Bacillus dựa trên trình tự đoạn gene 16S rDNA và kết luận rằng có ít nhất 5 nhóm vi khuẩn khác nhau trong chi Bacillus (kí hiệu từ nhóm 1 đến nhóm 5) [3]. Ông đề xuất rằng 5 nhóm này có thể là 5 chi khác nhau trong Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato).
subtilis mà Cohn đã mô tả năm 1872 được xếp vào nhóm 1 cùng với các loài thường gặp khác là B. Đây là nhóm có ít thay đổi nhất trong hệ thống phân loại và đến nay vẫn được xếp vào chi Bacillus hay còn được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto). Đến năm 2002, các loài trong nhóm 3 được chuyển sang chi mới là Paenibacillus, các loài trong nhóm 4 được chuyển sang chi mới là Brevibacillus. Một số các loài khác trong Bacillus nhóm lớn này được chuyển sang các chi khác như Alicyclobacillus, Halobacillus, Gracilibacillus và Virgibacillus [48].
Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại Đến những năm đầu thế kỷ 21, với sự gia tăng số lượng nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong các vùng sinh thái đặc biệt, số lượng các loài vi khuẩn trong nhóm Bacillus lớn tăng lên đáng kể. Khoảng thời gian từ năm 2004 đến 2006, trung bình mỗi tuần có một loài mới thuộc Bacillus nhóm lớn được mô tả trên các tạp chí phân loại chuyên ngành [18]. Sự gia tăng đột biến về số lượng loài cũng dẫn đến sự thay đổi nhanh chóng hệ thống phân loại của nhóm vi khuẩn này. Đến nay, có khoảng 37 chi mới trong Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato).
Các chi này được nhóm vào 3 họ: Bacillaceae, Paenibacillaceae, Alicyclobacillaceae (Hình 1.) cùng với 7 họ khác (như Thermoactinomycetaceae, Staphylococcaceae, Pasteuriacea) tạo nên bộ Bacillales [18]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm lớn. Cây được thiết lập dựa trên trình tự gen 16S rRNA.
Trong Bacillus nhóm lớn, Bacillus là chi có số lượng loài nhiều nhất. Đến nay, có khoảng 150 loài vi khuẩn Bacillus đã được mô tả. Loài chuẩn của chi vẫn là B. subtilis mà Cohn đã mô tả năm 1872.
Có 2 nhóm quan trọng nhất trong chi Bacillus là nhóm B. subtilis và nhóm B. subtilis có khoảng 10 loài và các loài phụ có quan hệ gần gũi với nhau và có nhiều loài như B. amyloliquefaciens được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại trên quy mô công nghiệp.
subtilis gồm 3 loài phụ dưới loài là B. cereus gồm 6 loài có quan hệ gần gũi với nhau. Trong chi 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bacillus, nhóm B. cereus là nhóm có khả năng gây bệnh cho người, động vật và côn trùng.