CHƯƠNG 1. Khái niệm về huyết khối Huyết khối (cục máu đông) là kết quả của một loạt các hiện tượng xảy ra trong quá trình cầm máu mà có tác dụng ngăn cản chảy máu vết thương, hàn gắn vết thương để giúp bảo vệ mạch máu. Tuy nhiên, huyết khối còn được hình thành trong cơ thể do sự phát sinh và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông máu của cơ thể dẫn đến hình thành nút huyết khối trong lòng mạch máu. Huyết khối ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não, gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ… Huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Bệnh nghẽn mạch là một bệnh lý nguy hiểm do quá trình sinh bệnh diễn ra chậm và chỉ phát hiện khi phát bệnh vì không hề có triệu chứng hay cảnh báo trước.
Bệnh khởi phát rất nhanh, rất đột ngột và gây ra những biến chứng gây tử vong cao [1,10]. Đại cương về nattokinase 1. Lịch sử phát hiện nattokinase Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K. Yabe, một chuyên gia về vi sinh học.
Ông công bố những kết quả tìm tòi về quá trình lên men của natto vào năm 1894. Ông cho rằng “Natto là một loại pho-mai thực vật”. Shin Sawamura đã thành công trong việc phân lập các vi khuẩn lên men từ đậu nành nấu chín. Trong số các vi khuẩn này vi khuẩn Baccillus natto đem lại mùi hương đặc biệt làm đậu lên men [10].
Sumi Hiroyuki phát hiện NK là chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên của đậu nành nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Năm 1986, ông công bố toàn bộ kết quả 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nghiên cứu về tác dụng của NK sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau và ông thấy rằng NK là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme (mạnh gấp 4 lần plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông và tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống) [20]. Hoạt tính của nattokinase NK là một enzyme ngoại bào, thuộc họ serine protease kiềm, có pI 8,7 và có nhiệt độ tối ưu là 40oC. Theo những nghiên cứu của Yibing Feng và ctv.
NK làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông). NK hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phân hủy sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này. Sức khỏe, tuổi tác và sự suy giảm sản sinh plasmin trong cơ thể càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. NK cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase [25].
NK có tác dụng làm giảm huyết áp. Các nghiên cứu chỉ ra rằng NK làm giảm huyết áp bằng cách ức chế Angiotensin Converting Enzyme (ACE). ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. NK có khả năng ức chế ACE và ngăn cản dầy nội mạc mạch, trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ hệ tuần hoàn và được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch.
NK còn làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn và bệnh lỵ [26,30,57]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ NKhứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người mắc bệnh này. Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase NK phân hủy fibrin theo ba cơ chế chính như sau: A) tham gia phân hủy trực tiếp fibrin – một protein dạng sợi tạo mạng lưới gây đông tụ máu, B) đẩy mạnh hoạt động của urokinase (nhân tố làm tăng cường sự chuyển hóa plasminogen thành plasmin) và C) tăng cường chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) sản sinh plasmin [29].
Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29] 1. Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase NK được mã hóa bởi gen apr. Gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha cân bằng trong quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis dưới sự kiểm soát của promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-sporulation). Ps chỉ hoạt động khi có 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sự gắn kết với Spo0A, một protein liên kết DNA giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) và điều hòa trực tiếp hoặc gián tiếp khoảng 500 gen liên quan chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử cũng như hiện tượng biến nạp ở B.
Do có vai trò điều hòa quan trọng, lượng Spo0A ở dạng hoạt hóa (dạng phosphoryl hóa) được kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phức hệ protein phosphorelay (chuỗi các protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop). Vì vậy, thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp NK (subtilisin) trong tự nhiên ở B. subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn [8,14,18]. Từ trước đến nay NK được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn của chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể.
Thực tế, NK được phân tách từ cơ chất hay môi trường lỏng và nó có hàm lượng không cao cũng như hoạt tính ít ổn định. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ có hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa [15,58]. Các sản phẩm nattokinase trên thị trường hiện nay: Hình 1. Các sản phẩm nattokinase 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase Mùi nhẹ và kết cấu dạng sợi của natto là một trở ngại lớn cho việc sử dụng natto như một thực phẩm thông thường, vì vậy NK tinh khiết đã được nghiên cứu sản xuất. subtilis (natto) là giống khởi động được sử dụng để làm natto, thương mại hóa hay quy mô hộ gia đình. subtilis có trong các sản phẩm NK thương mại hiện nay có thể duy trì tính khả thi và hoạt động trao đổi chất ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 6 tháng. So với quá trình lên men đơn giản, việc chiết xuất và tinh chế NK từ dịch lên men natto là rất khó khăn và không hiệu quả.
Một số biện pháp cho mục đích này đã được áp dụng như chiết rút bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, sắc ký trao đổi ion protein và thẩm tích, nhưng hoạt tính NK thu được từ các biện pháp này vẫn thấp [18]. Mặt khác, bên ngoài Nhật Bản, NK ở dạng viên nang thường được uống qua đường miệng, sự có mặt của các tạp chất trong các sản phẩm NK là một trở ngại khi sử dụng nó làm thuốc chữa bệnh huyết khối đối với người ăn chay. Hơn thế nữa, các sản phẩm NK hiện nay được quan tâm nhiều hơn bởi Cục Quản lý Dược Liên bang (FDA) do yêu cầu về mức độ tinh khiết cao. Vì vậy, công nghệ tái tổ hợp đã được áp dụng để đáp ứng các yêu cầu nâng cao sản lượng và đơn giản hóa quá trình tinh sạch NK.
Các gen NK đã được nhân dòng và biểu hiện ở các hệ thống vật chủ vi sinh vật khác nhau, bao gồm Escherichia coli[32] và B. subtilis đã được công nhận là một vật chủ tốt cho sự biểu hiện của các protein ngoại lai với các hoạt động dược lý bởi không có tính độc [56]. Nhiều nỗ lực đã được đầu tư để tăng 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cường sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách loại bỏ các yếu tố hạn chế[14], sử dụng các vector biểu hiện với sự ổn định cấu trúc cao, tối ưu hóa môi trường sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa promoter [57]. Hiệu quả hơn, chủng B.
subtilis đã được thiết kế cho sản xuất thừa các protein như enzyme tiêu sợi huyết /NK/subtilisin trong B. Việc sản xuất NK thương mại đòi hỏi tối ưu hóa các điều kiện lên men để tối đa hóa sản lượng NK được tạo ra bởi B. subtilis (natto), bao gồm nhiệt độ, pH, và thời gian lên men tối ưu [3,5] và đặc biệt là môi trường lên men. Một loạt các chất dinh dưỡng, như là glycerol, cao nấm men, peptone đậu nành, hoặc bột vỏ tôm đã được đánh giá cho khả năng nâng cao sản lượng NK [24,53].
Chiến lược bổ sung cơ chất thích hợp được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) đã nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản lượng đạt được bởi lên men mẻ[10]. Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn carbon (C) là các loại đường khác nhau như maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50]. Tương tự, muối ammonium sulphate và sodium nitrate cũng đã được xem là nguồn nitơ (N) kích thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6]. Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%) cũng là các nguồn N tuyệt vời [16,50].
Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong sản xuất NK ngoại bào bởi chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương [16]. Tuy nhiên, aspartate dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi huyết [50]. Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6]. Các ion kim loại hóa trị II như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sản xuất tối ưu NK.
Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme. Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia tăng trong hoạt động NK của Bacillus subtilis[22]. Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ 30-40°C đã được báo cáo là tối ưu cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis[51]. Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn là 200 vòng/phút.