Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất nattokinase tái tổ hợp

Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất nattokinase tái tổ hợp trong luận văn thạc sĩ HUS, góp phần phát triển thực phẩm chức năng.

• Tác giả: Hoàng Thị Bích Vân
• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Thị Tường Châu
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Khoa học Môi trường
• Đề tài: Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men sản xuất thực phẩm chức năng Nattokinase tái tổ hợp
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Khái niệm về huyết khối
• 0.2. Đại cương về nattokinase
• 0.3. Lịch sử phát hiện nattokinase
• 0.4. Hoạt tính của nattokinase
• 0.5. Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase
• 0.6. Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase
• 0.7. Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase
• 1. CHƯƠNG 1: Khái niệm về huyết khối
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men
• 3.1.1. Lựa chọn môi trường lên men cơ sở
• 3.1.2. Lựa chọn nguồn C
• 3.1.3. Hàm lượng Maltose thích hợp cho sinh tổng hợp NK
• 3.1.4. Lựa chọn nguồn N
• 3.1.5. Hàm lượng đậu nành thích hợp cho sinh tổng hợp NK đến hoạt tính NK
• 3.2. Ảnh hưởng của muối khoáng đến sinh tổng hợp NK
• 3.3. Ảnh hưởng của chất cảm ứng (tiền chất) đến sinh tổng hợp NK
• 3.4. Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men theo phương pháp bề mặt đáp ứng (Design Expert Version 7)
• 3.5. Tối ưu hóa điều kiện môi trường lên men
• 3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH
• 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
• 3.5.3. Nhu cầu oxy của chủng tái tổ hợp trong quá trình lên men
• 3.6. Ảnh hưởng của tuổi giống và lượng giống tới sinh tổng hợp NK
• 3.7. So sánh khả năng sinh tổng hợp NK của chủng tái tổ hợp và chủng tự nhiên (chủng gốc mang gen mã hóa NK)
• 3.8. Ảnh hưởng của các tác nhân vật lý tới sinh tổng hợp NK
• 3.8.1. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới sinh tổng hợp NK
• 3.8.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cuối lên men tới sinh tổng hợp NK
• 3.9. Ảnh hưởng của một số tác nhân hóa học tới sinh tổng hợp NK
• 3.9.1. Ảnh hưởng của hàm lượng IPTG và Lactose đến sinh tổng hợp NK
• 3.9.2. Xác định thời điểm bổ sung chất cảm ứng IPTG
• 3.10. Hoạt tính NK của dịch lên men chủng B. subtilis BD170 tái tổ hợp trong điều kiện tối ưu hóa ảnh hưởng của các nhân tố vật lý và hóa học
• 3.11. Ảnh hưởng chế độ lên men tới sinh tổng hợp NK
• 3.11.1. Nghiên cứu chế độ lên men theo mẻ
• 3.11.2. Nghiên cứu chế độ lên men bán liên tục
• 3.11.3. So sánh hiệu quả sinh tổng hợp NK của 2 chế độ lên men
• 3.11.4. Hoạt tính NK của dịch lên men trong chế độ lên men
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• BẢNG KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất nattokinase

Nattokinase là một enzyme quan trọng trong việc phân hủy huyết khối, được chiết xuất từ sản phẩm lên men đậu nành. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện lên men để sản xuất nattokinase tái tổ hợp, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất. Việc hiểu rõ về môi trường và điều kiện lên men là rất cần thiết để đạt được sản phẩm có hoạt tính cao.

1.1. Khái niệm về nattokinase và vai trò trong y học

Nattokinase là một enzyme có khả năng phân hủy fibrin, giúp làm tan cục máu đông. Enzyme này được sử dụng trong nhiều sản phẩm y tế để điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối. Nghiên cứu cho thấy nattokinase có hiệu quả cao hơn so với các enzyme khác trong việc làm tan huyết khối.

1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase hiện nay

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tối ưu hóa quy trình sản xuất nattokinase. Các phương pháp lên men khác nhau đã được áp dụng, từ lên men tự nhiên đến tái tổ hợp, nhằm nâng cao sản lượng và hoạt tính của enzyme này.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất nattokinase tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp vẫn gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như chi phí sản xuất cao, hiệu suất enzyme thấp và sự ổn định của sản phẩm là những yếu tố cần được giải quyết. Nghiên cứu này sẽ phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và tìm ra giải pháp tối ưu.

2.1. Chi phí sản xuất và hiệu suất enzyme

Chi phí sản xuất nattokinase tái tổ hợp thường cao do yêu cầu về nguyên liệu và quy trình công nghệ phức tạp. Việc tối ưu hóa các điều kiện lên men có thể giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu suất enzyme.

2.2. Sự ổn định của sản phẩm nattokinase

Sự ổn định của nattokinase trong quá trình bảo quản và sử dụng là một vấn đề quan trọng. Nghiên cứu sẽ xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của enzyme và cách cải thiện tính ổn định của sản phẩm.

III. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men sản xuất nattokinase

Để nâng cao sản lượng nattokinase, nghiên cứu sẽ áp dụng các phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và thời gian lên men sẽ được điều chỉnh để đạt được hoạt tính enzyme cao nhất. Phương pháp bề mặt đáp ứng sẽ được sử dụng để xác định các điều kiện tối ưu.

3.1. Tối ưu hóa pH và nhiệt độ trong quá trình lên men

Nghiên cứu cho thấy pH và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của nattokinase. Việc xác định pH tối ưu và nhiệt độ thích hợp sẽ giúp nâng cao hiệu suất sản xuất enzyme.

3.2. Thời gian lên men và ảnh hưởng của các tác nhân hóa học

Thời gian lên men cũng đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất nattokinase. Nghiên cứu sẽ xem xét ảnh hưởng của các tác nhân hóa học như muối khoáng và chất cảm ứng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nattokinase trong y học

Nattokinase không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Enzyme này được sử dụng để điều trị các bệnh lý liên quan đến huyết khối, giúp cải thiện sức khỏe tim mạch. Nghiên cứu sẽ trình bày các ứng dụng cụ thể của nattokinase trong điều trị và phòng ngừa bệnh.

4.1. Nattokinase trong điều trị bệnh tim mạch

Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong việc giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch. Nghiên cứu cho thấy enzyme này giúp làm tan cục máu đông và cải thiện lưu thông máu.

4.2. Các sản phẩm từ nattokinase trên thị trường

Hiện nay, nhiều sản phẩm chứa nattokinase đã được phát triển và thương mại hóa. Các sản phẩm này không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn hỗ trợ sức khỏe tổng thể cho người tiêu dùng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu nattokinase

Nghiên cứu về nattokinase tái tổ hợp mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và công nghiệp thực phẩm chức năng. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí, từ đó đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. Tương lai của nattokinase hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

5.1. Tương lai của sản xuất nattokinase

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, sản xuất nattokinase tái tổ hợp sẽ ngày càng trở nên hiệu quả hơn. Nghiên cứu sẽ tiếp tục tìm kiếm các phương pháp mới để nâng cao sản lượng và chất lượng enzyme.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải thiện quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng của nattokinase trong y học. Việc phát triển các sản phẩm mới từ nattokinase sẽ là một hướng đi tiềm năng trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Các bệnh lý tim mạch và nghẽn mạch cục bộ như đột quỵ não hay nhồi máu cơ tim đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu. Theo báo cáo từ Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm có khoảng 17 triệu người tử vong do các biến chứng tim mạch liên quan đến huyết khối. Thị trường toàn cầu dành cho các loại thuốc làm tan huyết khối ước tính đạt gần 14 tỷ USD. Mặc dù các loại thuốc tiêm tĩnh mạch như Urokinase, Streptokinase hay Alteplase mang lại tác dụng tiêu sợi huyết tức thì, nhược điểm lớn của chúng là thời gian bán thải ngắn, giá thành đắt đỏ và tiềm ẩn nguy cơ xuất huyết nội tạng nghiêm trọng.

Trước thực trạng đó, enzyme Nattokinase chiết xuất từ đậu nành lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis nổi lên như một giải pháp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị huyết khối an toàn, hiệu quả qua đường uống. Tuy nhiên, các chế phẩm Nattokinase trên thị trường Việt Nam chủ yếu phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập ngoại với giá thành rất cao, thường vượt mức 10 triệu đồng/kg. Đề tài luận văn thạc sĩ khoa học môi trường tập trung nghiên cứu tối ưu hóa thành phần môi trường và các thông số công nghệ lên men cho chủng vi khuẩn tái tổ hợp Bacillus subtilis BD170 mang gen mã hóa Nattokinase.

Nghiên cứu được triển khai tại phòng thí nghiệm chuyên sâu thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, thực hiện trên quy mô bình tam giác và hệ thống bioreactor tự động Bioflo 110 dung tích 5 lít. Mục tiêu trọng tâm là xác lập công thức môi trường dinh dưỡng rẻ tiền từ nông sản đậu nành và chế độ vận hành tối ưu, nâng hoạt tính enzyme Nattokinase lên mức 263 FU/ml và tỷ lệ làm tan cục huyết khối đạt trên 40,9%, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc sản xuất thực phẩm chức năng tiêu sợi huyết tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết enzym học vi sinh vật và công nghệ DNA tái tổ hợp. Nattokinase là một serine protease kiềm gồm 275 amino acid, có trọng lượng phân tử khoảng 27,7 kDa, điểm đẳng điện pI ở mức 8,7 và hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40°C. Về mặt dược lý học, enzyme này sở hữu hoạt lực tiêu sợi huyết mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh. Cơ chế tác động của Nattokinase bao gồm 3 con đường chính: trực tiếp phân cắt liên kết chéo của mạng lưới fibrin không tan, kích thích tế bào nội mô giải phóng chất hoạt hóa plasminogen mô và gia tăng chuyển hóa prourokinase thành urokinase.

Trong tự nhiên, gen tổng hợp Nattokinase (aprN) ở Bacillus subtilis bị kiểm soát nghiêm ngặt bởi hệ thống điều hòa tạo bào tử Spo0A khiến hiệu suất sinh tổng hợp rất thấp. Để khắc phục hiện tượng này, chủng Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp được chuyển vector pHT43/Nat05 mang gen Nat05, đặt dưới sự kiểm soát của promoter dung hợp cảm ứng bởi IPTG qua cơ chế operon lac. Lý thuyết động học lên men và mô hình bề mặt đáp ứng đa biến được áp dụng để khảo sát ảnh hưởng tương hỗ giữa các nguồn dinh dưỡng và các tác nhân điều khiển sinh trưởng.

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp mang gen mã hóa Nattokinase (mã số ngân hàng gen KU341115). Cỡ mẫu thực nghiệm được thiết kế bao gồm 30 nghiệm thức theo mô hình phức hợp xoay vòng tại tâm của phương pháp bề mặt đáp ứng trên phần mềm Design Expert 7.1, với 6 điểm lặp tại tâm và 24 điểm không thuộc tâm nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê cao nhất.

Phương pháp xác định hoạt độ protease tổng số dựa trên nguyên lý Anson cải tiến thông qua phản ứng thủy phân casein và đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Hoạt tính tiêu sợi fibrin đặc hiệu của Nattokinase được định lượng chuẩn xác bằng phương pháp quang phổ tử ngoại ở bước sóng 275 nm, song song với phương pháp định tính xác định tỷ lệ phần trăm làm tan khối huyết lợn đông sau 4 giờ ủ tại 37°C. Quá trình lên men được tiến hành qua hai giai đoạn: nhân giống cấp 1 trong môi trường LB ở 37°C với tốc độ lắc 220 vòng/phút trong 24 giờ, sau đó chuyển sang lên men thu nhận enzyme trên bình tam giác và thiết bị Bioflo 110 dung tích 5 lít chứa 3 lít môi trường trong thời gian 48 đến 60 giờ. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý bằng kiểm định Duncan trên phần mềm SPSS 16.0 với mức ý nghĩa p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc 11 công thức môi trường cơ sở cho thấy môi trường MT2 mang lại hiệu quả sinh tổng hợp vượt bậc, đạt hoạt độ protease 1821 U/ml và tỷ lệ tan huyết khối 28,2%, cao hơn gấp 2,6 lần so với môi trường MT4 chỉ đạt 684 U/ml.

Nghiên cứu nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ xác định Maltose và sữa đậu nành là hai cơ chất tối ưu nhất. Khi nồng độ Maltose đạt 30 g/L, tỷ lệ tan huyết đạt 30,7%, vượt trội so với Glucose đạt 27,7% và tinh bột tan chỉ đạt 8,1%. Đồng thời, bột đậu nành ngâm xay ở nồng độ 30 g/L giúp tỷ lệ tan huyết đạt 36,8%, cao hơn rõ rệt so với pepton đạt 25,7% và nguồn nitơ vô cơ amoni sulfat chỉ đạt 14,9%.

Sự phối hợp giữa hai muối khoáng MgSO4 và CaCl2 cùng nồng độ 0,5 g/L tạo ra hiệu ứng cộng hưởng mạnh mẽ, đưa tỷ lệ làm tan huyết khối lên mức 40,7%, cao hơn hẳn các nghiệm thức đơn lẻ hoặc bổ sung NaCl chỉ đạt 27,4%.

Chất cảm ứng IPTG ở nồng độ 1 mM bổ sung tại thời điểm 36 giờ của chu kỳ lên men giúp giải phóng tối đa sự ức chế operon lac, đưa hoạt tính Nattokinase đạt đỉnh 263 FU/ml với tỷ lệ tan huyết 40,9%. Ngược lại, thử nghiệm với chất cảm ứng Methanol ở nồng độ 1% đến 3% đã gây độc cho tế bào và làm suy giảm tỷ lệ tan huyết xuống dưới 10,3%.

Thảo luận kết quả

Khả năng sinh tổng hợp enzyme vượt trội của chủng tái tổ hợp trên môi trường đậu nành kết hợp Maltose được giải thích bởi đặc tính dinh dưỡng cân bằng. Sữa đậu nành tự nhiên cung cấp nguồn acid amin, chuỗi peptide ngắn và các vitamin nhóm B thiết yếu cho sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, trong khi Maltose cung cấp nguồn năng lượng phân giải chậm, không gây ra hiệu ứng ức chế dị hóa do thừa đường đơn như Glucose.

Vai trò của các ion kim loại Ca2+ và Mg2+ ở nồng độ 0,5 g/L là tối quan trọng vì chúng hoạt động như các co-factor giúp ổn định cấu trúc không gian bậc bốn của serine protease ngoại bào, bảo vệ enzyme khỏi hiện tượng tự phân hủy trong suốt pha cân bằng của quá trình lên men kéo dài 48 giờ.

Khi phân tích dữ liệu qua mô hình bề mặt đáp ứng 3D, các tương tác giữa Maltose và Đậu nành hay giữa MgSO4 và CaCl2 đều thể hiện các đường cong dạng parabol rõ rệt, xác nhận vùng tối ưu hóa toàn cục mà các phương pháp khảo sát đơn biến truyền thống không thể phát hiện. Hoạt tính Nattokinase thu được cao hơn khoảng 1,5 đến 2 lần so với chủng hoang dại ban đầu, khẳng định hiệu quả của việc kết hợp công nghệ tái tổ hợp với quy trình điều khiển thông số công nghệ nuôi cấy chính xác.

Đề xuất và khuyến nghị

Chuẩn hóa quy trình chuẩn bị nguyên liệu cơ chất bằng cách sử dụng hạt đậu nành nội địa ngâm nước trong 6 giờ và xay nhuyễn thành sữa ở nồng độ 30 g/L, kết hợp 30 g/L Maltose thương mại, giúp tiết kiệm chi phí hóa chất nuôi cấy xuống dưới 15.000 VNĐ cho mỗi lít môi trường lên men trong vòng 6 tháng tới.

Thiết lập hệ thống kiểm soát tự động trên các bioreactor từ 5 lít đến 50 lít, duy trì nhiệt độ cố định ở 35°C, pH ổn định ở mức 7,0, tốc độ khuấy dao động 200 đến 300 vòng/phút và lưu lượng sục khí 1 vvm nhằm giữ mức oxy hòa tan luôn trên 30% trong suốt quá trình sinh trưởng.

Tối ưu hóa thời điểm bổ sung chất cảm ứng IPTG ở nồng độ chính xác 1 mM vào giờ thứ 36 của mẻ lên men, tương ứng với giai đoạn vi khuẩn chuyển từ pha log muộn sang pha cân bằng, nhằm kích hoạt tối đa sự biểu hiện của promoter mà không gây lãng phí hóa chất đắt tiền.

Áp dụng phương thức lên men bán liên tục trên thiết bị bioreactor công nghiệp, thực hiện chu kỳ rút 80% thể tích dịch lên men (tương đương 2,4 lít trên mẻ 3 lít) sau mỗi 48 giờ và nạp bù môi trường mới vô trùng để tái sử dụng sinh khối tế bào, nâng cao năng suất thu hồi enzyme tổng thể lên hơn 35% so với phương pháp lên men theo mẻ gián đoạn truyền thống.

Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng cần phối hợp với các cơ sở nghiên cứu trong lộ trình 12 đến 18 tháng để chuẩn hóa công nghệ siêu lọc qua màng và đông khô dịch chiết, đảm bảo độ tinh khiết sản phẩm đạt trên 90% trước khi đóng nang thương mại.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Khoa học Môi trường: Tài liệu cung cấp cơ sở phương pháp luận chi tiết về việc ứng dụng phần mềm Design Expert 7.1 trong tối ưu hóa bề mặt đáp ứng, giúp xử lý các bài toán tương tác phức tạp trong công nghệ vi sinh.

Kỹ sư vận hành công nghệ lên men tại các nhà máy Dược phẩm và Thực phẩm chức năng: Nắm bắt các thông số thực tế để điều khiển bioreactor Bioflo 110 quy mô 5 lít, xây dựng công thức môi trường giá rẻ từ đậu nành giúp giảm giá thành sản phẩm Nattokinase nội địa.

Học viên cao học và sinh viên các ngành Hóa sinh, Vi sinh học và Dược học: Tài liệu học thuật chuẩn mực hướng dẫn quy trình định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến và phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở bước sóng 275 nm để đánh giá khả năng phân giải sợi huyết.

Cán bộ quản lý và hoạch định chính sách phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp: Cung cấp cơ sở thực tiễn để xây dựng chuỗi giá trị gia tăng cho nông sản đậu nành Việt Nam thông qua chế biến sâu thành các dược phẩm có giá trị kinh tế cao.

Câu hỏi thường gặp

Chủng vi khuẩn tái tổ hợp Bacillus subtilis BD170 có ưu điểm gì nổi bật so với chủng tự nhiên? Chủng tái tổ hợp mang vector pHT43/Nat05 với mã số gen KU341115 được kiểm soát bởi promoter lac. Dưới tác động cảm ứng của 1 mM IPTG, chủng có khả năng biểu hiện enzyme mạnh mẽ mà không phụ thuộc vào hệ thống điều hòa tạo bào tử phức tạp Spo0A, giúp hoạt tính tiêu sợi huyết cao và ổn định hơn hẳn chủng tự nhiên.

Vì sao môi trường chứa sữa đậu nành và Maltose lại đạt hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất? Sữa đậu nành ở nồng độ 30 g/L cung cấp nguồn đạm hữu cơ phong phú cùng các vi chất tự nhiên, giúp tỷ lệ tan huyết đạt 36,8%, vượt trội so với nguồn đạm vô cơ chỉ đạt 14,9%. Đồng thời, Maltose 30 g/L phân giải giải phóng năng lượng điều hòa, tránh được hiện tượng ức chế dị hóa do thừa đường tự do gây ra.

Vai trò của việc bổ sung đồng thời hai loại muối khoáng MgSO4 và CaCl2 là gì? Ion Ca2+ và Mg2+ ở nồng độ 0,5 g/L đóng vai trò là các yếu tố vi lượng thiết yếu cấu thành và ổn định trung tâm hoạt động của serine protease. Khi phối hợp cả hai muối, tỷ lệ làm tan cục huyết khối tăng vọt lên 40,7%, cao hơn rõ rệt so với việc chỉ sử dụng một loại muối khoáng đơn lẻ.

Methanol có thể thay thế IPTG làm chất cảm ứng trong quá trình lên men không? Thực nghiệm cho thấy bổ sung Methanol từ 1% đến 3% khiến tỷ lệ tan huyết giảm mạnh xuống mức 3,5% đến 10,3%. Nguyên nhân là do quá trình oxy hóa Methanol gây độc tế bào và ức chế sinh trưởng của vi khuẩn, vì vậy IPTG ở nồng độ 1 mM vẫn là lựa chọn cảm ứng tối ưu nhất.

Ưu thế của việc ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng trong nghiên cứu này là gì? Phương pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tâm gồm 30 thí nghiệm trên phần mềm Design Expert 7.1 giúp đánh giá chính xác tương tác qua lại giữa 4 biến dinh dưỡng chính. Cách tiếp cận này giúp tiết kiệm thời gian, giảm số lượng mẫu thử nghiệm và định vị chính xác điểm cực đại của hoạt lực enzyme.

Kết luận

Xác lập thành công công thức môi trường tối ưu MT2 chứa 30 g/L Maltose, 30 g/L sữa đậu nành, 0,5 g/L MgSO4 và 0,5 g/L CaCl2 tại pH 7,0.

Khẳng định vai trò quyết định của chất cảm ứng IPTG nồng độ 1 mM bổ sung ở giờ thứ 36, giúp nâng hoạt tính enzyme Nattokinase lên 263 FU/ml và tỷ lệ làm tan huyết khối đạt 40,9%.

Chuẩn hóa các thông số vận hành trên bioreactor Bioflo 110 quy mô 5 lít gồm nhiệt độ 35°C, tốc độ khuấy 200 đến 300 vòng/phút, sục khí 1 vvm và tỷ lệ tiếp giống 5%.

Chứng minh hiệu quả của chế độ lên men bán liên tục rút 80% thể tích môi trường sau mỗi chu kỳ 48 giờ giúp tái sử dụng sinh khối vi khuẩn và tăng sản lượng thu nhận enzyme.

Mở ra triển vọng làm chủ công nghệ sản xuất Nattokinase tái tổ hợp quy mô công nghiệp từ nguồn nông sản đậu nành trong nước với giá thành cạnh tranh.

Luận văn đã đóng góp một giải pháp công nghệ sinh học hoàn chỉnh và khả thi cho ngành công nghiệp thực phẩm chức năng phòng chống đột quỵ tại Việt Nam. Trong lộ trình 12 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp nên tiếp tục mở rộng quy mô tinh chế màng lọc để sớm thương mại hóa sản phẩm. Hãy kết nối và áp dụng ngay các kết quả nghiên cứu này vào thực tiễn sản xuất nhằm nâng cao giá trị dược liệu nội địa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Khái niệm về huyết khối Huyết khối (cục máu đông) là kết quả của một loạt các hiện tượng xảy ra trong quá trình cầm máu mà có tác dụng ngăn cản chảy máu vết thương, hàn gắn vết thương để giúp bảo vệ mạch máu. Tuy nhiên, huyết khối còn được hình thành trong cơ thể do sự phát sinh và lan rộng bất hợp lý của phản ứng đông máu của cơ thể dẫn đến hình thành nút huyết khối trong lòng mạch máu. Huyết khối ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não, gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ… Huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Bệnh nghẽn mạch là một bệnh lý nguy hiểm do quá trình sinh bệnh diễn ra chậm và chỉ phát hiện khi phát bệnh vì không hề có triệu chứng hay cảnh báo trước.

Bệnh khởi phát rất nhanh, rất đột ngột và gây ra những biến chứng gây tử vong cao [1,10]. Đại cương về nattokinase 1. Lịch sử phát hiện nattokinase Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ K. Yabe, một chuyên gia về vi sinh học.

Ông công bố những kết quả tìm tòi về quá trình lên men của natto vào năm 1894. Ông cho rằng “Natto là một loại pho-mai thực vật”. Shin Sawamura đã thành công trong việc phân lập các vi khuẩn lên men từ đậu nành nấu chín. Trong số các vi khuẩn này vi khuẩn Baccillus natto đem lại mùi hương đặc biệt làm đậu lên men [10].

Sumi Hiroyuki phát hiện NK là chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên của đậu nành nhờ vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Năm 1986, ông công bố toàn bộ kết quả 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nghiên cứu về tác dụng của NK sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau và ông thấy rằng NK là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme (mạnh gấp 4 lần plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông và tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống) [20]. Hoạt tính của nattokinase NK là một enzyme ngoại bào, thuộc họ serine protease kiềm, có pI 8,7 và có nhiệt độ tối ưu là 40oC. Theo những nghiên cứu của Yibing Feng và ctv.

NK làm tan cục máu đông bằng cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục máu đông). NK hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phân hủy sợi fibrin) với cơ chế tương tự như plasmin này. Sức khỏe, tuổi tác và sự suy giảm sản sinh plasmin trong cơ thể càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. NK cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase [25].

NK có tác dụng làm giảm huyết áp. Các nghiên cứu chỉ ra rằng NK làm giảm huyết áp bằng cách ức chế Angiotensin Converting Enzyme (ACE). ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. NK có khả năng ức chế ACE và ngăn cản dầy nội mạc mạch, trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ hệ tuần hoàn và được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch.

NK còn làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn và bệnh lỵ [26,30,57]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ NKhứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người mắc bệnh này. Cơ chế phân hủy fibrin của nattokinase NK phân hủy fibrin theo ba cơ chế chính như sau: A) tham gia phân hủy trực tiếp fibrin – một protein dạng sợi tạo mạng lưới gây đông tụ máu, B) đẩy mạnh hoạt động của urokinase (nhân tố làm tăng cường sự chuyển hóa plasminogen thành plasmin) và C) tăng cường chất hoạt hóa plasminogen mô (t-PA) sản sinh plasmin [29].

Cơ chế phân giải fibrin invivo bởi nattokinase [29] 1. Sinh tổng hợp và sản xuất nattokinase NK được mã hóa bởi gen apr. Gen này chủ yếu được biểu hiện ở pha cân bằng trong quá trình sinh trưởng của Bacillus subtilis dưới sự kiểm soát của promoter có liên quan đến sự tạo bào tử (Ps, s-sporulation). Ps chỉ hoạt động khi có 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] sự gắn kết với Spo0A, một protein liên kết DNA giữ vai trò điều hòa chủ đạo (master regulator) và điều hòa trực tiếp hoặc gián tiếp khoảng 500 gen liên quan chặt chẽ đến quá trình tạo bào tử cũng như hiện tượng biến nạp ở B.

Do có vai trò điều hòa quan trọng, lượng Spo0A ở dạng hoạt hóa (dạng phosphoryl hóa) được kiểm soát khá nghiêm ngặt bởi phức hệ protein phosphorelay (chuỗi các protein chuyển nhóm phosphoryl) và vòng tự điều hòa (autoregulatory loop). Vì vậy, thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp NK (subtilisin) trong tự nhiên ở B. subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn [8,14,18]. Từ trước đến nay NK được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán rắn của chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể.

Thực tế, NK được phân tách từ cơ chất hay môi trường lỏng và nó có hàm lượng không cao cũng như hoạt tính ít ổn định. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thường chỉ có hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa [15,58]. Các sản phẩm nattokinase trên thị trường hiện nay: Hình 1. Các sản phẩm nattokinase 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase Mùi nhẹ và kết cấu dạng sợi của natto là một trở ngại lớn cho việc sử dụng natto như một thực phẩm thông thường, vì vậy NK tinh khiết đã được nghiên cứu sản xuất. subtilis (natto) là giống khởi động được sử dụng để làm natto, thương mại hóa hay quy mô hộ gia đình. subtilis có trong các sản phẩm NK thương mại hiện nay có thể duy trì tính khả thi và hoạt động trao đổi chất ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 6 tháng. So với quá trình lên men đơn giản, việc chiết xuất và tinh chế NK từ dịch lên men natto là rất khó khăn và không hiệu quả.

Một số biện pháp cho mục đích này đã được áp dụng như chiết rút bằng dung môi hữu cơ, kết tủa bằng muối, sắc ký trao đổi ion protein và thẩm tích, nhưng hoạt tính NK thu được từ các biện pháp này vẫn thấp [18]. Mặt khác, bên ngoài Nhật Bản, NK ở dạng viên nang thường được uống qua đường miệng, sự có mặt của các tạp chất trong các sản phẩm NK là một trở ngại khi sử dụng nó làm thuốc chữa bệnh huyết khối đối với người ăn chay. Hơn thế nữa, các sản phẩm NK hiện nay được quan tâm nhiều hơn bởi Cục Quản lý Dược Liên bang (FDA) do yêu cầu về mức độ tinh khiết cao. Vì vậy, công nghệ tái tổ hợp đã được áp dụng để đáp ứng các yêu cầu nâng cao sản lượng và đơn giản hóa quá trình tinh sạch NK.

Các gen NK đã được nhân dòng và biểu hiện ở các hệ thống vật chủ vi sinh vật khác nhau, bao gồm Escherichia coli[32] và B. subtilis đã được công nhận là một vật chủ tốt cho sự biểu hiện của các protein ngoại lai với các hoạt động dược lý bởi không có tính độc [56]. Nhiều nỗ lực đã được đầu tư để tăng 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cường sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách loại bỏ các yếu tố hạn chế[14], sử dụng các vector biểu hiện với sự ổn định cấu trúc cao, tối ưu hóa môi trường sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa promoter [57]. Hiệu quả hơn, chủng B.

subtilis đã được thiết kế cho sản xuất thừa các protein như enzyme tiêu sợi huyết /NK/subtilisin trong B. Việc sản xuất NK thương mại đòi hỏi tối ưu hóa các điều kiện lên men để tối đa hóa sản lượng NK được tạo ra bởi B. subtilis (natto), bao gồm nhiệt độ, pH, và thời gian lên men tối ưu [3,5] và đặc biệt là môi trường lên men. Một loạt các chất dinh dưỡng, như là glycerol, cao nấm men, peptone đậu nành, hoặc bột vỏ tôm đã được đánh giá cho khả năng nâng cao sản lượng NK [24,53].

Chiến lược bổ sung cơ chất thích hợp được sử dụng trong các phương pháp lên men mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) đã nâng cao đáng kể việc sản xuất NK, liên quan đến sản lượng đạt được bởi lên men mẻ[10]. Việc tăng sản lượng của NK đã được báo cáo bởi một số tác giả khi sử dụng nguồn carbon (C) là các loại đường khác nhau như maltose [6], mannitol [16], glucose [46] và fructose [50]. Tương tự, muối ammonium sulphate và sodium nitrate cũng đã được xem là nguồn nitơ (N) kích thích sản xuất NK ở vi sinh vật [6]. Ngoài ra, peptone (1%) và cao nấm men (1-2%) cũng là các nguồn N tuyệt vời [16,50].

Việc bổ sung các hợp chất amino nhất định nào đó đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong sản xuất NK ngoại bào bởi chủng Bacillus lichniformis B4 phân lập tại địa phương [16]. Tuy nhiên, aspartate dường như có tác dụng ức chế đến sự sản xuất của cả protease và protease tiêu sợi huyết [50]. Việc sản xuất NK ở các mức thấp cũng đã được báo cáo với việc sử dụng các nguồn N vô cơ trong môi trường lên men [6]. Các ion kim loại hóa trị II như Ca, Co, Cu, B, Fe, Mg, Mn và Mo được đòi hỏi trong môi trường lên men để 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] sản xuất tối ưu NK.

Tuy nhiên, nhu cầu các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme. Việc sử dụng MgSO4, AgNO3, CaCl2, MnCl2 ở nồng độ 0,1-0,5 mM hoặc NaN3 ở nồng độ 0,1-0,5 mM đã dẫn đến sự gia tăng trong hoạt động NK của Bacillus subtilis[22]. Khoảng pH 5-8 và nhiệt độ 30-40°C đã được báo cáo là tối ưu cho việc sản xuất NK bởi Bacillus subtilis[51]. Đồng thời, Bacillus subtilis A26 cho sản lượng enzyme tối đa tại tốc độ khuấy trộn là 200 vòng/phút.