CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Xu hướng nghiên cứu trong và ngoài nước Từ tên đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp”, các từ khóa liên quan đã được xác định bao gồm: nattokinase, isolation (phân lập), screening (sàng lọc), Bacillus, viscosity (độ nhớt), poly-gamma-glutamic acid (γ-PGA). Dựa vào các từ khóa này, tiến hành tìm kiếm trong tiêu đề, tóm tắt và từ khóa (title, keywords, abstract) trên cơ sở dữ liệu Science Direct để xác định các công bố khoa học có liên quan đến nội dung nghiên cứu.
Kết quả tìm kiếm được phân tích thống kê theo nhiều tiêu chí khác nhau. Đồ thị thống kê số lượng công bố được trình bày trên Hình 1.1: Thông kê số lượng các nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase” trên cơ sở dữ liệu Science Direct trong khoảng thời gian từ 1988 – 2022. Từ đồ thị Hình 1.1 cho thấy số lượng các nghiên cứu tăng dần theo từng năm, qua đó phản ánh sự quan tâm của giới khoa học đến enzyme nattokinase (NK). Tính từ năm 1988 tới đầu năm 2022 có tất cả 82 công bố của các nhà nghiên cứu trên thế giới liên quan tới loại enzyme nattokinase.
Mặc dù số lượng công bố không quá nhiều nhưng có thể thấy sự hấp dẫn của các đề tài liên quan tới nattokinase đối với các nhà khoa học. Tuy nhiên khi tiến hành tìm kiếm đồng thời hai từ khóa “nattokinase, poly-gamma-glutamic acid” với cách thức như trên trên cơ sở dữ liệu Science Direct thì kết quả trả về chỉ có duy nhất một bài báo được công bố. Như vậy các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào enzyme nattokinase mà chưa đề cập đồng thời đến quá trình sinh tổng hợp enzyme và sản phẩm phụ, trong trường hợp này là γ-PGA, một tác nhân làm tăng độ nhớt canh trường lên men lỏng. 1 Bên cạnh cơ sở dữ liệu khoa học Science Direct, các cơ sở dữ liệu uy tín khác bao gồm: NCBI, BMC Biotechnology, JMB, Nature, Europe PMC, Tạp chí Sinh học cũng được sử dụng để tìm kiếm các tài liệu tham khảo bằng các từ khóa nêu trên.
Với các tài liệu tham khảo tìm được tiến hành sàng lọc hai cấp. Quá trình sàng lọc sơ cấp dựa từ khóa và tiêu đề để chọn lựa các công bố phù hợp với đề tài nghiên cứu và sàng lọc thứ cấp dựa trên nội dung tóm tắt của các nghiên cứu được lựa chọn ở bước sàng lọc sơ cấp để tìm ra những nghiên cứu thích hợp nhất, gần nhất với đề tài luận văn. Quá trình sàng lọc hai cấp trên đã xác định được 70 nghiên cứu từ trong và ngoài nước phù hợp với đề tài phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Các công bố này đến từ nhiều quốc gia khác nhau trên thế giới, trong đó có Việt Nam.
Sự phân bố các nghiên cứu của các quốc gia theo địa lí được trình bày trên Hình 1.2: Infographic phân bố các nghiên cứu về nattokinase theo quốc gia Hình 1.2 cho thấy hầu hết các quốc gia có sự quan tâm tới đề tài nattokinase đến từ Châu Á và chỉ có một công bố tới từ Châu Âu. Lí giải cho sự phân bổ không đồng đều này có thể do các loại thực phẩm lên men từ đậu tương phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở các nước Châu Á hơn Châu Âu. Đối với các quốc gia Châu Á, Trung Quốc là nước thể hiện mối quan tâm nhiều nhất tới nattokinase với 25 nghiên cứu. Việt Nam với 9 nghiên cứu tuy không nhiều so với Trung Quốc nhưng cũng phần nào thể hiện sự quan tâm của các tác giả tới chủ đề “Nattokinase”.
Đối với 9 công bố của Việt Nam về nattokinase, phần lớn những công bố này đều được đăng trên Tạp chí Sinh học và trên các tạp chí khoa học công nghệ khác, số lượng các nghiên cứu về NK được đăng trên các tạp chí uy tín trên thế giới còn ít, chưa thực sự nhiều. 2 Từ 70 nghiên cứu được sàng lọc ở trên, tiến hành phân tích nội dung kết quả và đã chọn ra được 42 nghiên cứu có liên quan gần nhất tới đề tài nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ các nguồn phân lập khác nhau.3 mô tả phân bố theo quốc gia thống kê trên 42 nghiên cứu này.3: Thống kê tỷ lệ các nghiên cứu về phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK theo quốc gia trên tổng số 42 bài báo khoa học Hình 1.3 cho thấy, chiếm tỷ lệ lớn nhất là các nghiên cứu tới từ Trung Quốc với 26% (11 nghiên cứu), theo sau là Ấn Độ và Hàn Quốc cùng có 7 nghiên cứu chiếm 17% và theo sau các nước trên là Việt Nam chiếm 14% số nghiên cứu về nattokinase. Chiếm 26% tổng số nghiên cứu là những công bố đến từ các quốc gia khác, trong đó gồm các nước đến từ Châu Âu và một số nước Châu Á với số lượng công bố ít hơn những nước kể trên. Từ đồ thị trên có thể thấy rằng Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ và Việt Nam là những nước quan tâm nhiều nhất tới việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm chứa NK.
Để có thể chủ động được nguyên liệu NK cho sản xuất thì những năm gần đây trong nước đã có nhiều hướng nghiên cứu về NK được đưa ra và bước đầu đạt được những kết quả khá khả quan.1 thể hiện một số nghiên cứu về đề tài nattokinase trong những năm gần đây ở Việt Nam.1: Một số nghiên cứu về nattokinase ở Việt Nam TLTK Nội dung Kết quả thu được [1] Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính 11 chủng có hoạt tính tiêu nattokinase cao và khảo sát ảnh hưởng huyết. Hoạt lực NK cao nhất là một số yếu tố đối với quá trình lên 8,6 FU/mL. men thu nhận nattokinase. 3 [2] Sàng lọc và xác định Bacillus sp.
phân Bốn chủng Bacillus lập từ sản phẩm đậu tương lên men amyloliquefaciens với hoạt lực truyền thống của Việt Nam để sản enzyme cao nhất 77,9 FU/g. xuất enzyme tiêu huyết khối. [3] Tinh sạch và đặc điểm của Thông số động học của NK. Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis DB104 tái tố hợp [4] Tối ưu hóa thành phần lên men thu Hiệu suất NK cao nhất đạt 69,3 nhận nattokinase từ chủng Bacillus ± 0,2 FU/mL.
[5] Tối ưu hóa thành phần lên men để đạt Hiệu suất NK cao nhất đạt năng suất sinh khối cao nhất từ chủng được sau khi tối ưu là 31,06 ± Bacillus subtilis natto và bước đầu 0,297 FU/mL. khảo sát năng suất nattokinase. [6] Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ Phân lập 2 chủng: B.subtilis natto Nhật Bản làm giống sản xuất N18 và B. [7] Phân lập và tuyển chọn một số chủng Hai chủng Bacillus sp.2 và Bacillus sinh tổng hợp nattokinase.NP3 với hoạt lực NK cao nhất 470 FU/g.
[8] Tối ưu môi trường lên men chìm thu Hoạt lực NK đạt 242 FU/mL nhận enzyme nattokinase từ chủng B. trong lên men theo mẻ. Lên men fed-batch hoạt lực tăng gấp 7 lần so với lên men theo mẻ. [9] Tăng cường sản xuất enzyme phân 48 chủng trong số 64 chủng giải fibrin bởi Bacillus sp.
phân lập từ phân lập được có hoạt lực phân đậu tương lên men truyền thống của giải fibrin. Việt Nam (Tương bần) bằng chiếu xạ Đột biến chủng bằng chiếu tia tia UV và hóa chất. UV và hoá chất thu được chủng Bacillus sp. ES4 cho hoạt lực sau đột biến là 404 FU/mL.
Qua các nghiên cứu trong nước về nattokinase (Bảng 1.1), các tác giả và nhóm tác giả ở Việt Nam chủ yếu quan tâm đến phân lập các chủng vi khuẩn từ sản phẩm natto thương mại cũng như khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa môi trường giúp tăng khả năng sinh tổng hợp NK của chủng. Ngược lại, số nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn sinh NK từ thực phẩm đậu tương lên men (tương) chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ (khoảng 22% tương đương với 2 công bố) trong số các nghiên cứu nêu trên. Lịch sử Natto (Hình 1.4) hay đậu nành (đậu tương) lên men là một món ăn truyền thống của người Nhật Bản được làm từ những hạt đậu nành lên men tự nhiên trong môi trường chứa Bacillus subtilis natto ở nhiệt độ 40⁰C trong vòng 18 đến 24 tiếng thậm chí lâu hơn. Natto có độ nhớt khá cao và mùi của nó khá khó ngửi đối với những người lần đầu tiên tiếp xúc do đó loại thực phẩm này khá kén người tiêu dùng.
Người Nhật Bản thường sử dụng natto như một món ăn kèm trong các bữa ăn, thông thường bữa sáng. Natto nhận được sự quan tâm lớn của được giới khoa học và các nhà nghiên cứu vào năm 1980 khi GS. Sumi Hiroyuki phát hiện ra rằng natto có thể hòa tan fibrin nhân tạo. Sumi và nhóm nghiên cứu của ông đã tách chiết được một loại enzyme có khả năng phân hủy fibrin từ natto.
Sau đó, ông đặt tên cho enzyme mới này là enzyme tan huyết khối hay còn được gọi là enzyme tiêu sợi huyết “Nattokinase” [10]. Năm 1986, Sumi và cộng sự đã công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về NK sau khi thử nghiệm hơn 173 loại thực phẩm khác nhau để so sánh và xác định rằng nattokinase là một enzyme có khả năng phân giải các cục máu đông (do sự hình thành một cách bất thường bởi các sợi fibrin và tiểu cầu [11]) một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme [12]. Khi đó, NK được coi là enzyme phân giải fibrin đầu tiên từ Bacillus subtilis.4: Natto-Đậu nành lên men [10] 1. Cấu trúc và đặc điểm của nattokinase Nattokinase (NK) hay subtilisin NAT (E.62) là một protease serine thuộc họ subtilisin gồm 275 axit amin, không chứa các liên kết cầu disulfide và có hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh, hoạt tính của NK mạnh gấp 4 lần plasmin [13-15].
NK hoạt động trong dải nhiệt độ 30-50⁰C, bền ở nhiệt độ 60⁰C, nhiệt độ tối ưu là 40⁰C. Hoạt động của NK chủ yếu ở pH 6 – 12 tuy nhiên thiếu ổn định trong môi 5 trường kiềm. Một số nghiên cứu khác cho thấy hoạt tính của NK có thời gian hiệu lực trong máu cao, duy trì hoạt lực được 8 đến 12 giờ trong cơ thể dài hơn so với urokinase (4-20 phút) và hơn chất hoạt hóa plasminogen (tissue plasminogen activator, t-PA) (3-6 giờ) [16, 17]. Ngoài ra NK có tính tương đồng cao với subtilisins E (99,5%) và subtilisins J (Amylosacchariticus, 99,3%) [18].5: Cấu trúc không gian nattokinase [15] 1.
Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase NK được biết đến là enzyme phân giải fibrin đầu tiên được tìm thấy từ Bacillus subtilis natto. Ngoài ra, các enzyme phân giải firbin có thể được sinh tổng hợp từ nhiều chi vi khuẩn khác nhau như: Streptococcus, Staphylococcus, Vibrio, Paenibacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas [19].