Tổng quan nghiên cứu

Nattokinase (NK) là enzyme phân hủy fibrin có tiềm năng lớn trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh liên quan huyết khối. Từ năm 1988 đến đầu năm 2022, có khoảng 82 công bố khoa học trên thế giới liên quan đến enzyme này, phản ánh sự quan tâm ngày càng tăng của giới khoa học. Tuy nhiên, các nghiên cứu đồng thời về NK và poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) – một sản phẩm phụ làm tăng độ nhớt canh trường lên men – còn rất hạn chế. Độ nhớt cao của canh trường lên men là một thách thức lớn trong quá trình thu hồi enzyme, ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất công nghiệp.

Luận văn tập trung phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. có khả năng sinh tổng hợp NK với hoạt lực cao và tạo độ nhớt thấp, nhằm giải quyết vấn đề này. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu tương truyền thống Việt Nam, đất, nước biển và natto thương mại, trong phạm vi thời gian nghiên cứu từ năm 2020 đến 2022 tại Việt Nam. Mục tiêu cụ thể là phân lập chủng vi khuẩn, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp NK và độ nhớt, tối ưu hóa môi trường lên men bằng phương pháp đáp ứng bề mặt, và kiểm chứng quy mô lên men 2 L.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn enzyme NK chất lượng cao, đồng thời giảm thiểu độ nhớt canh trường, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme trong công nghiệp sinh học và ứng dụng trong y học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nattokinase là protease serine thuộc họ subtilisin, có hoạt tính tiêu fibrin mạnh gấp 4 lần plasmin, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40⁰C và pH 6-12. NK được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các chủng Bacillus subtilis và Bacillus amyloliquefaciens, với khối lượng phân tử khoảng 27-28 kDa. Poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) là polypeptide hòa tan trong nước, tạo độ nhớt cao trong canh trường lên men, ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình thu hồi enzyme. γ-PGA được tổng hợp bởi các gen pgsBCA trong Bacillus spp., với cơ chế trùng hợp và phân hủy phức tạp, chịu ảnh hưởng bởi thành phần môi trường và điều kiện lên men.

Các yếu tố môi trường như nguồn cacbon (glucose), nguồn nitơ (peptone, cao nấm men), và ion kim loại (Ca²⁺, Mg²⁺) có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt lực NK và độ nhớt canh trường. Đặc biệt, ion Ca²⁺ giúp tăng hoạt lực enzyme, trong khi các ion như Zn²⁺, Cu²⁺ có tác động tiêu cực. Độ nhớt canh trường tăng mạnh khi nồng độ γ-PGA vượt 2 g/L, gây khó khăn trong quá trình ly tâm và lọc.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm 73 chủng vi khuẩn phân lập từ 25 mẫu tương, đất, nước biển và natto thương mại tại các tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Chủng đối chứng là Bacillus subtilis D từ bộ sưu tập phòng thí nghiệm. Phân lập vi khuẩn trên môi trường LBS agar, sàng lọc hoạt lực NK bằng phương pháp phân giải fibrin, đo độ nhớt canh trường bằng thiết bị Brookfield Viscometer.

Phân tích định danh chủng bằng giải trình tự gen 16S rRNA. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men (nhiệt độ, tốc độ lắc, tỉ lệ cấp giống) và thành phần môi trường (glucose, peptone, CaCl₂, K₂HPO₄, MgSO₄) bằng thiết kế thí nghiệm Minimum-run screening và tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) với thiết kế Box-Behnken. Kiểm chứng quy mô lên men theo mẻ trên thiết bị bioreactor 1 L và 2 L.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong khoảng 2 năm, với các thí nghiệm được thực hiện lặp lại để đảm bảo độ chính xác và sai số ≤ 5%.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh NK: Từ 73 chủng phân lập, chủng TVY.04 từ tương truyền thống Việt Nam có hoạt lực NK cao nhất đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL và độ nhớt thấp nhất 3,87 ± 0,03 cP, vượt trội hơn nhiều so với các chủng khác và chủng đối chứng.

  2. Định danh chủng: Chủng TVY.04 được xác định là Bacillus amyloliquefaciens qua giải trình tự gen 16S rRNA.

  3. Ảnh hưởng điều kiện lên men: Nhiệt độ 37⁰C, tốc độ lắc 150 rpm và tỉ lệ cấp giống OD600 = 0,2 là điều kiện tối ưu cho hoạt lực NK cao nhất và độ nhớt thấp nhất. Hoạt lực NK đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL khi lên men trong bình tam giác 250 mL, tăng gấp đôi so với môi trường ban đầu.

  4. Tối ưu hóa môi trường: Thành phần môi trường tối ưu gồm 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, 5 g/L CaCl₂, 10 g/L cao nấm men, 5 g/L NaCl, 1 g/L K₂HPO₄. Lên men theo mẻ trên bioreactor 1 L đạt hoạt lực NK 460 ± 12 FU/mL, tăng hơn 50% so với bình tam giác, độ nhớt canh trường 4,41 ± 0 cP, chỉ tăng nhẹ khoảng 10%.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy chủng Bacillus amyloliquefaciens TVY.04 phân lập từ tương truyền thống Việt Nam có tiềm năng sinh tổng hợp NK cao và tạo độ nhớt thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp. Điều kiện lên men và thành phần môi trường được tối ưu hóa giúp tăng gấp đôi đến gấp ba hoạt lực enzyme so với điều kiện ban đầu, đồng thời kiểm soát được độ nhớt canh trường, giảm thiểu khó khăn trong thu hồi enzyme.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hoạt lực NK của chủng TVY.04 vượt trội hơn nhiều so với các chủng Bacillus subtilis phân lập từ natto hoặc tương khác, đồng thời độ nhớt thấp hơn đáng kể so với các nghiên cứu sử dụng môi trường bổ sung axit L-glutamic. Việc kiểm soát độ nhớt là yếu tố then chốt để nâng cao hiệu quả thu hồi enzyme và giảm chi phí sản xuất.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt lực NK và độ nhớt giữa các chủng, cũng như bảng phân tích ANOVA các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực và độ nhớt, giúp minh họa rõ ràng tác động của từng biến số.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ứng dụng chủng TVY.04 trong sản xuất công nghiệp: Đẩy mạnh nghiên cứu và phát triển quy trình lên men theo mẻ quy mô lớn (≥ 2 L) với điều kiện tối ưu đã xác định nhằm tăng năng suất enzyme NK, giảm độ nhớt canh trường, nâng cao hiệu quả thu hồi sản phẩm.

  2. Tối ưu hóa quy trình thu hồi enzyme: Áp dụng các kỹ thuật ly tâm và lọc phù hợp với độ nhớt thấp để giảm thời gian và chi phí, đồng thời đảm bảo chất lượng enzyme.

  3. Nghiên cứu cơ chế sinh tổng hợp đồng thời NK và γ-PGA: Tập trung vào việc điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến γ-PGA nhằm giảm sản xuất sản phẩm phụ gây tăng độ nhớt, nâng cao hiệu quả sản xuất NK.

  4. Phát triển nguồn nguyên liệu lên men: Khuyến khích sử dụng các nguồn nguyên liệu truyền thống như tương Việt Nam để phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính ưu việt, góp phần bảo tồn và phát huy giá trị sinh học bản địa.

  5. Thời gian thực hiện: Các giải pháp trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tiếp theo, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất enzyme.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu về enzyme, vi sinh vật lên men, tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme có thể ứng dụng các phương pháp và kết quả trong luận văn để phát triển đề tài mới.

  2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và dược phẩm: Áp dụng chủng vi khuẩn và quy trình lên men tối ưu để nâng cao năng suất sản xuất nattokinase, giảm chi phí và cải thiện chất lượng sản phẩm.

  3. Chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu về thực phẩm lên men truyền thống và ứng dụng vi sinh vật bản địa trong sản xuất enzyme có thể khai thác nguồn gen và quy trình lên men hiệu quả.

  4. Cơ quan quản lý và phát triển công nghệ sinh học: Tham khảo để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghệ enzyme, thúc đẩy nghiên cứu ứng dụng và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật bản địa.

Câu hỏi thường gặp

  1. Nattokinase là gì và có vai trò gì trong y học?
    Nattokinase là enzyme phân hủy fibrin, giúp ngăn ngừa và điều trị các bệnh huyết khối như tắc mạch máu. Hoạt tính của NK mạnh gấp 4 lần plasmin, duy trì hiệu lực trong máu từ 8-12 giờ, dài hơn nhiều so với các enzyme khác.

  2. Tại sao độ nhớt canh trường lên men lại quan trọng?
    Độ nhớt cao làm giảm hiệu quả ly tâm và lọc trong quá trình thu hồi enzyme, tăng chi phí sản xuất và giảm năng suất. γ-PGA là nguyên nhân chính làm tăng độ nhớt, do đó cần chọn chủng vi khuẩn tạo độ nhớt thấp.

  3. Phương pháp tối ưu hóa môi trường lên men được sử dụng là gì?
    Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) với thiết kế Box-Behnken được sử dụng để xác định nồng độ tối ưu của glucose, peptone và CaCl₂ nhằm tăng hoạt lực enzyme và giảm độ nhớt.

  4. Chủng Bacillus amyloliquefaciens TVY.04 có ưu điểm gì?
    Chủng này có hoạt lực NK cao nhất đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL và độ nhớt thấp nhất 3,87 ± 0,03 cP trong số 73 chủng phân lập, phù hợp cho sản xuất công nghiệp với hiệu quả thu hồi enzyme cao.

  5. Làm thế nào để kiểm soát sản xuất γ-PGA trong quá trình lên men?
    Có thể điều chỉnh thành phần môi trường, đặc biệt là nguồn cacbon và ion kim loại, cũng như nghiên cứu cơ chế biểu hiện gen liên quan đến γ-PGA để giảm sản xuất sản phẩm phụ này, từ đó giảm độ nhớt canh trường.

Kết luận

  • Đã phân lập và tuyển chọn thành công chủng Bacillus amyloliquefaciens TVY.04 từ tương truyền thống Việt Nam với hoạt lực nattokinase cao (98,5 ± 3,5 FU/mL) và độ nhớt thấp (3,87 ± 0,03 cP).
  • Điều kiện lên men tối ưu gồm nhiệt độ 37⁰C, tốc độ lắc 150 rpm, tỉ lệ cấp giống OD600 = 0,2 và môi trường chứa 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, 5 g/L CaCl₂.
  • Lên men quy mô 1 L trên bioreactor đạt hoạt lực NK 460 ± 12 FU/mL, tăng hơn 50% so với bình tam giác, đồng thời kiểm soát độ nhớt hiệu quả.
  • Nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme nattokinase, giảm thiểu độ nhớt canh trường, hỗ trợ ứng dụng trong công nghiệp và y học.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu cơ chế đồng sản xuất NK và γ-PGA, mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng trong thực tế.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng chủng và quy trình tối ưu này để phát triển sản phẩm nattokinase chất lượng cao, đồng thời tiếp tục nghiên cứu giảm thiểu độ nhớt canh trường nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất.