Đặt vấn đề Trong suốt tiến trình phát triển của nhân loại, trên con đƣờng hoàn thiện mình, loài ngƣời luôn phải đấu tranh để vƣợt qua mọi trở ngại, thách thức khác nhau. Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đó và rất nhiều bệnh có nguyên nhân do vi sinh vật gây ra. Với phát minh vĩ đại về penicillin, cùng với việc phát triển và hoàn thiện của công nghệ lên men hiện đại đã tạo ra cho nhân loại các chất kháng sinh, công cụ hữu hiệu mới để đấu tranh chống lại các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện của rất nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và tạo nên một mối nguy cơ toàn cầu trầm trọng đe dọa nền y học hiện đại.
Để khắc phục hiện tƣợng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh, việc nghiên cứu, sản xuất các chất kháng sinh đã biết với các đặc tính ƣu việt hơn và việc tìm kiếm phát hiện các kháng sinh mới vẫn luôn là vấn đề mang tính thời sự và rất cấp thiết, đặt ra không chỉ ở thời điểm hiện tại mà ngay cả trong tƣơng lai. Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit có tác dụng tích cực trong điều trị nhiều loại bệnh, từng đƣợc coi là thần dƣợc hay là phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do nhóm vi khuẩn Staphylococcus (nhóm này có khả năng kháng lại penixillin và methixillin) gây nên. Vancomycin đã đƣợc đƣa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhƣng ngày nay vẫn đƣợc coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc khi phối hợp với các thuốc kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với các thuốc kháng sinh thông dụng. Hiện nay, vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis đã đƣợc đƣa ra sản xuất ở quy mô công nghiệp nhƣng hiệu suất còn thấp và giá thành của chất kháng sinh này còn cao.
Vì vậy, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất chất kháng 1 sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần làm giảm lƣợng kháng sinh nhập khẩu từ nƣớc ngoài, đáp ứng đƣợc phần lớn nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho ngƣời dân, tiết kiệm hàng nghìn tỷ đồng tiền thuốc nhập khẩu. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. Mục tiêu nghiên cứu Thu nhận đƣợc chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men vancomycin từ nguồn nguyên liệu trong nƣớc.
- Nghiên cứu các chế độ lên men vancomycin theo mẻ và lên men bán liên tục. - Nghiên cứu tách chiết vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ khuẩn S. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin 1.
Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin Vancomycin là một chất kháng sinh tiêu biểu nhất thuộc nhóm kháng sinh glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do chủng xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh tổng hợp ra [27]. Nhiễm trùng Staphylococcus aureus là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu trong bệnh viện và cộng đồng trên toàn thế giới với tỉ lệ mắc bệnh và tử vong tƣơng đối lớn, đặc biệt là khi không đƣợc điều trị phù hợp. Với sự xuất hiện của methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) trong năm 1960 kháng lại các kháng sinh là một thách thức lớn đối với việc điều trị nhiễm trùng nghiêm trọng, đặc biệt là nhiễm trùng endovascular.
Đến nay, hầu hết các chủng MRSA kháng với nhiều loại kháng sinh và không thể đƣợc điều trị bằng β- lactams thông thƣờng, làm cho glycopeptide (Vancomycin hoặc Teicoplanin) là giải pháp điều trị duy nhất đƣợc lựa chọn [14]. Trong những năm gần đây, sự xuất hiện của chủng MRSA giảm nhạy cảm với glycopeptide đã nhấn mạnh sự cần thiết cho các loại thuốc mới có hiệu quả hơn. Thuốc mới antistaphylococcal nhƣ linezolid, đó là các kháng sinh oxazolidinone đầu tiên đƣợc chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm (FDA), đã phát triển và cho thấy hiệu quả tƣơng đƣơng với vancomycin trong điều trị viêm phổi và nhiễm trùng mô mềm. Tuy nhiên, linezolid đã không đƣợc sử dụng vì giá mua cao hơn cũng nhƣ thiếu các thử nghiệm lâm sàng và kinh nghiệm so với vancomycin.
Do đó, vancomycin vẫn đƣợc duy trì nhƣ một dòng thuốc ƣu tiên của quốc phòng trong điều trị nhiễm trùng MRSA [14]. Kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomycin đã luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học 3 chủ yếu, từ đó biển đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [24]. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin Vancomycin có công thức phân tử C66H75Cl2N9O24, trọng lƣợng phân tử của vancomycin là 14449.
Vancomycin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm –OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7. Vancomycin khác với các kháng sinh khác thuộc nhóm glycopeptit bởi cấu trúc phức tạp, đặc biệt sự khác biệt đó là bởi trong cấu trúc của vancomycin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai để tạo nên các vancomycin bán tổng hợp hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ kháng sinh mới có hoạt tính cao và chọn lọc [9], [28]. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của vancomycin Các phân tử vancomycin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomycin là chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính.
Nó hòa tan trong 4 nƣớc trong vùng pH axit và bazơ, hòa tan ít hơn trong điều kiện trung tính, bền vững ở dạng rắn và dung dịch nƣớc hòa tan của nó có vùng pH từ 2. Nó thƣờng hòa tan nhiều trong các rƣợu bậc thấp và hầu nhƣ không hòa tan trong các dung môi hữu cơ khác [24]. Vancomycin có bản chất lƣỡng tính nên phản ứng với các axit vô cơ ví dụ nhƣ HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác và tạo thành dạng muối để thuận tiện trong việc thu hồi. Vancomycin chlohydride (Vancomycin HCl) là một dạng muối bền vững của vancomycin.
Vancomycin HCl bền ở dạng rắn và trong dung dịch nƣớc ở nhiệt độ trên 70oC trong vùng pH 2. Giá trị pKa của vancomycin là: 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Vancomycin HCl là một hợp chất màu trắng hòa tan trong nƣớc, ít hòa tan trong ethanol và methanol, hầu nhƣ không hòa tan trong các dung môi khác nhƣ là chloroform, ether, ethyl acetate. Khả năng hòa tan trong nƣớc ở pH 7.0 là khoảng 1 mg/ml và nó hòa tan nhiều trong nƣớc ở giá trị pH thấp và giá trị pH trên 8.
Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomycin chứa khoảng 1,17% nitơ và khoảng 4,26% Cl. Vancomycin bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37°C trong 6 ngày, nếu nhiệt độ thấp hơn thì hoạt tính giảm dần theo thời gian. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ đƣợc nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân huỷ có thể quan sát đƣợc.1 cho thấy phổ kháng khuẩn của vancomycin. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (µg/ml) là nồng độ vancomycin nhỏ nhất làm ức chế sự sinh trƣởng của vi sinh vật kiểm định sau một khoảng thời gian, cụ thể là 24 giờ, 48 giờ ở 37oC.
Theo bảng này thì vancomycin chủ yếu hoạt động chống lại vi khuẩn gram dƣơng, bị hạn chế trong việc chống lại mycobacteria và không có hoạt tính chống lại các vi khuẩn gram âm sử dụng trong thử nghiệm trên. Khi tiêm tĩnh mạch ở chuột trắng theo chuẩn dƣợc, liều gây chết của vancomycin HCl biểu hiện ở LD50 tìm thấy ở khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg [20]. Chế phẩm vancomycin cần đạt 1007 U/mg, nghĩa là một đơn vị vancomycin bao gồm 0,993 mcg vancomycin sunfat. Phổ kháng khuẩn của vancomycin Nồng độ Nồng độ ức ức chế tối chế tối thiểu Vi sinh vật thiểu Vi sinh vật (µg/ml) kiểm định (µg/ml) kiểm định 24 48 24 48 giờ giờ giờ giờ Achromobacter Bacillus brevis 3.13 >100 >100 fischeri Bacillus cereus 3.13 Aerobacter aerogenes >100 >100 Brucella Bacillus licheniformis 0.78 >100 >100 bronchiseptica Bacillus polymyxa 0.39 Escherichia coli >100 >100 Bacillus subtilis 0.39 Klebsiella pneumonia >100 >100 Corynebacterium 0.78 Mycobacterium avium 100 100 diphtheriae Micrococcus pyogenes Pseudomonas var.
aureus (kháng lại 0.78 >100 >100 aeruginosa penixillin) Micrococcus pyogenes Shigella 1. aureus H paradysenteriae Saccharomyces Mycobacterium phiei 12.13 Aspergillus niger >100 >100 smegmatis Sarcina lutea 0,78 0. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin Hoạt tính kháng vi sinh vật của vancomycin và các kháng sinh khác thuộc nhóm glycopeptit đạt đƣợc từ việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Vancomycin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan (PG) [25], [31], lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trƣờng.
Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp PG bị phá huỷ thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động và kết quả là tế bào bị chết [29]. Quá trình ức chế này xảy ra qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Vancomycin không xâm nhập vào tế bào chất mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất, ức chế các chất bên ngoài màng tế bào. Giai đoạn 2: Khi không có mặt vancomycin, các peptit cơ chất đƣợc glycosyl hóa nhờ enzym transglycosylaza tạo thành các disacaryl pentapeptit sau đó liên kết chéo peptit đƣợc tạo thành giữa các cơ chất này nhờ transpetidaza để tạo nên PG thành tế bào vi khuẩn. Đích tác dụng của vancomycin là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của enzym.
Khi đó, phân tử vancomycin có dạng hình chiếc cốc liên kết ái lực cao nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của cầu liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit. Giai đoạn 3: Vancomycin không tấn công disacaryl pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hoá trị, giảm tính bền cơ học của lớp PG và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải do thay đổi áp suất thẩm thấu, dẫn đến vi khuẩn bị tiêu diệt [29], [31].