Nghiên Cứu Thu Nhận Vancomycin Từ Môi Trường Lên Men Chủng Xạ Khuẩn S. orientalis

• Tác giả: Hoàng Thị Nương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Phương Nhuệ
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Thu Nhận Vancomycin Từ Môi Trường Lên Men Chủng S. orientalis
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin
• 1.2. Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin
• 1.3. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin
• 1.4. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin
• 1.5. Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn
• 1.6. Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin
• 1.7. Nguồn bột đao
• 1.8. Nguồn cao nấm men
• 1.9. Tối ưu hóa môi trường
• 1.9.1. Khái niệm về tối ưu môi trường
• 1.9.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng
• 1.10. Phương pháp tách chiết vancomycin
• 1.10.1. Tách chiết bằng dung môi hữu cơ
• 1.10.2. Tách chiết bằng hấp phụ
• 1.10.3. Tách chiết bằng trao đổi ion
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Môi trường nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp bảo quản giống
• 2.4. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng S.
• 2.5. Phương pháp lên men
• 2.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh
• 2.7. Phương pháp tách chiết vancomycin
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912
• 3.1.1. Đặc điểm hình thái
• 3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
• 3.2. Lựa chọn môi trường lên men
• 3.3. Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường lên men
• 3.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S.
• 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S.
• 3.6. Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp vancomycin từ chủng S. orientalis 4912 theo phương pháp bề mặt đáp ứng
• 3.7. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912 trên môi trường tối ưu
• 3.8. Nghiên cứu chế độ lên men vancomycin
• 3.8.1. Chế độ lên men vancomycin theo mẻ
• 3.8.2. Chế độ lên men bán liên tục
• 3.9. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng dung môi
• 3.9.1. Khả năng tách chiết vancomycin của các loại dung môi khác nhau
• 3.9.2. Tỉ lệ phối trộn dung môi và dịch lên men phù hợp cho tách chiết vancomycin
• 3.9.3. Xác định thời gian tách chiết
• 3.10. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phương pháp hấp phụ
• 3.10.1. Khả năng hấp phụ vancomycin của một số chất hấp phụ
• 3.10.2. Nồng độ than hoạt tính và dung môi sử dụng để nhả hấp phụ
• 3.10.3. Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ
• 3.10.4. Xác định tỷ lệ hỗn hợp dung môi
• 3.11. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phương pháp trao đổi ion
• 3.11.1. Tách chiết vancomycin với một số chất trao đổi ion
• 3.11.2. Kiểm tra vancomycin tách chiết được từ dịch lên men
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vancomycin từ S

Vancomycin, một kháng sinh glycopeptide, đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương. Được phân lập lần đầu từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis, vancomycin đã trở thành một vũ khí quan trọng chống lại các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA). Nghiên cứu này tập trung vào việc thu nhận vancomycin từ môi trường lên men của chủng S. orientalis, với mục tiêu tối ưu hóa quy trình sản xuất và giảm giá thành sản phẩm. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc đòi hỏi sự phát triển liên tục của các phương pháp sản xuất kháng sinh hiệu quả hơn. Nghiên cứu này hứa hẹn đóng góp vào việc cải thiện quy trình sản xuất vancomycin hiện tại.

1.1. Lịch Sử Phát Triển Vancomycin Ứng Dụng Lâm Sàng

Vancomycin được phát hiện vào năm 1956 từ Streptomyces orientalis, đánh dấu một bước tiến quan trọng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương. Ban đầu, nó được xem là 'vũ khí cuối cùng' chống lại Staphylococcus aureus kháng penicillin. Đến nay, vancomycin vẫn là lựa chọn hàng đầu cho nhiễm trùng MRSA, đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm trùng máu. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng MRSA giảm nhạy cảm với glycopeptide đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các loại thuốc mới. Các thuốc như Linezolid đã ra đời nhưng vẫn chưa thể thay thế hoàn toàn vancomycin do chi phí và kinh nghiệm sử dụng. Vì vậy, vancomycin vẫn là ưu tiên hàng đầu trong điều trị MRSA.

'Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit có tác dụng tích cực trong điều trị nhiều loại bệnh, từng đƣợc coi là thần dƣợc hay là phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do nhóm vi khuẩn Staphylococcus (nhóm này có khả năng kháng lại penixillin và methixillin) gây nên.'

1.2. Cấu Trúc Phân Tử và Đặc Tính Hóa Lý của Vancomycin

Vancomycin có công thức phân tử C66H75Cl2N9O24 và trọng lượng phân tử khoảng 1449. Cấu trúc của nó bao gồm ba hệ thống vòng, hai nhóm cacbonhydrat, và nhiều nhóm chức khác nhau, tạo nên một phân tử phức tạp và độc đáo. Đặc biệt, sự có mặt của một disaccharide ở vị trí axit amin thứ tư cho phép gắn các phân tử ngoại lai, mở ra khả năng tạo ra các dẫn xuất vancomycin bán tổng hợp với hoạt tính cao hơn và bền vững hơn. Vancomycin thường tồn tại ở dạng vô định hình, không màu, có tính lưỡng tính và hòa tan tốt trong nước ở pH axit và bazơ. Độ bền của nó trong dung dịch nước phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. Sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và đặc tính hóa lý của vancomycin là rất quan trọng cho việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và phát triển các dẫn xuất mới. Vancomycin khác với các kháng sinh khác thuộc nhóm glycopeptit bởi cấu trúc phức tạp, đặc biệt sự khác biệt đó là bởi trong cấu trúc của vancomycin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai để tạo nên các vancomycin bán tổng hợp hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng.

II. Thách Thức và Vấn Đề trong Thu Nhận Vancomycin 59 ký tự

Mặc dù vancomycin là một kháng sinh quan trọng, quá trình sản xuất và thu nhận nó vẫn còn đối mặt với nhiều thách thức. Hiệu suất lên men vancomycin thường thấp, dẫn đến chi phí sản xuất cao. Việc tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men cũng đòi hỏi các quy trình phức tạp và tốn kém. Hơn nữa, sự biến đổi của chủng S. orientalis và sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn trong quá trình lên men có thể ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của sản phẩm cuối cùng. Nghiên cứu này nhằm giải quyết những thách thức này bằng cách tối ưu hóa môi trường lên men và quy trình tách chiết, từ đó nâng cao hiệu suất và giảm chi phí sản xuất vancomycin.

2.1. Hiệu Suất Lên Men Thấp và Chi Phí Sản Xuất Cao

Việc sản xuất vancomycin ở quy mô công nghiệp vẫn còn gặp nhiều khó khăn do hiệu suất lên men thấp của chủng S. orientalis. Điều này dẫn đến chi phí sản xuất cao, làm hạn chế khả năng tiếp cận của bệnh nhân với loại thuốc quan trọng này. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lên men bao gồm thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, và đặc tính di truyền của chủng. Do đó, việc nghiên cứu và tối ưu hóa môi trường lên men, cũng như cải thiện chủng S. orientalis thông qua kỹ thuật di truyền, là rất cần thiết để giảm chi phí sản xuất và tăng tính cạnh tranh của vancomycin trên thị trường. Các nhà khoa học cũng phải xem xét các Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin để đảm bảo chi phí thấp nhất.

2.2. Quy Trình Tách Chiết Vancomycin Phức Tạp Tốn Kém

Quy trình tách chiết vancomycin từ dịch lên men là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất, nhưng cũng là một trong những yếu tố tốn kém nhất. Các phương pháp tách chiết truyền thống như sử dụng dung môi hữu cơ hoặc hấp phụ thường đòi hỏi nhiều công đoạn và sử dụng các hóa chất độc hại. Hơn nữa, dịch lên men thường chứa nhiều tạp chất, gây khó khăn cho việc tinh chế vancomycin với độ tinh khiết cao. Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp tách chiết hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường và ít tốn kém hơn là rất quan trọng để giảm chi phí sản xuất vancomycin.

III. Phương Pháp Tối Ưu Môi Trường Lên Men Vancomycin 58 ký tự

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa thành phần môi trường lên men, bao gồm nguồn carbon và nguồn nitơ. RSM là một kỹ thuật thống kê hiệu quả để xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men và tìm ra điều kiện tối ưu để đạt được hiệu suất sản xuất vancomycin cao nhất. Các thí nghiệm được thiết kế để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần môi trường khác nhau đến sự sinh trưởng của chủng S. orientalis và khả năng tổng hợp vancomycin. Kết quả được phân tích bằng phần mềm thống kê để xây dựng mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa các yếu tố và đáp ứng.

3.1. Ảnh Hưởng Của Nguồn Cacbon Đến Sinh Tổng Hợp Vancomycin

Nguồn carbon là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis. Nghiên cứu này đã đánh giá ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau, chẳng hạn như glucose, sucrose, và tinh bột, đến hiệu suất lên men. Kết quả cho thấy một số nguồn carbon có khả năng kích thích sự sinh trưởng của chủng và tăng cường quá trình tổng hợp vancomycin hơn so với các nguồn khác. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc lựa chọn nguồn carbon tối ưu cho môi trường lên men.

3.2. Ảnh Hưởng Của Nguồn Nitơ Đến Sinh Tổng Hợp Vancomycin

Tương tự như nguồn carbon, nguồn nitơ cũng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis. Nghiên cứu này đã đánh giá ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau, chẳng hạn như peptone, cao nấm men, và ammonium sulfate, đến hiệu suất lên men. Kết quả cho thấy một số nguồn nitơ có khả năng kích thích quá trình tổng hợp vancomycin hơn so với các nguồn khác. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc lựa chọn nguồn nitơ tối ưu cho môi trường lên men. Cần đánh giá những Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin để tối ưu chi phí.

IV. Nghiên Cứu Chế Độ Lên Men Vancomycin Mẻ và Bán Liên Tục 57 ký tự

Nghiên cứu này so sánh hai chế độ lên men khác nhau: lên men mẻ và lên men bán liên tục. Lên men mẻ là một quy trình đơn giản và dễ thực hiện, nhưng có thể bị hạn chế bởi sự tích tụ các sản phẩm phụ và sự cạn kiệt các chất dinh dưỡng. Lên men bán liên tục, mặt khác, cho phép duy trì điều kiện ổn định hơn và kéo dài thời gian sản xuất vancomycin. Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá hiệu suất của hai chế độ lên men và xác định điều kiện tối ưu cho từng quy trình. Kết quả được sử dụng để lựa chọn chế độ lên men phù hợp nhất cho sản xuất vancomycin ở quy mô công nghiệp.

4.1. So Sánh Hiệu Quả Lên Men Mẻ và Bán Liên Tục

Lên men mẻ là phương pháp truyền thống, trong đó tất cả các thành phần được thêm vào lúc bắt đầu quá trình. Lên men bán liên tục cho phép bổ sung các chất dinh dưỡng và loại bỏ một phần dịch lên men trong quá trình, giúp duy trì môi trường ổn định và kéo dài thời gian sản xuất. So sánh hiệu quả của hai phương pháp này giúp xác định phương pháp nào tối ưu hơn cho sản xuất vancomycin.

4.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Lên Men cho Từng Chế Độ

Mỗi chế độ lên men đòi hỏi các điều kiện tối ưu khác nhau để đạt hiệu suất cao nhất. Ví dụ, lên men mẻ có thể cần điều chỉnh nồng độ ban đầu của các chất dinh dưỡng, trong khi lên men bán liên tục cần điều chỉnh tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng và loại bỏ dịch lên men. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là rất quan trọng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra hiệu quả và đạt được sản lượng vancomycin cao nhất.

V. Tách Chiết Vancomycin Từ Dịch Lên Men Phương Pháp Hấp Phụ 60 ký tự

Nghiên cứu này tập trung vào phương pháp tách chiết vancomycin bằng hấp phụ, sử dụng than hoạt tính làm chất hấp phụ. Than hoạt tính có khả năng hấp phụ cao các chất hữu cơ, bao gồm cả vancomycin, từ dịch lên men. Quá trình tách chiết bao gồm các bước hấp phụ vancomycin lên than hoạt tính, rửa loại bỏ tạp chất, và giải hấp phụ vancomycin bằng dung môi thích hợp. Các thí nghiệm được thực hiện để tối ưu hóa các điều kiện hấp phụ và giải hấp phụ, chẳng hạn như nồng độ than hoạt tính, pH, và loại dung môi.

5.1. Khả Năng Hấp Phụ Vancomycin Của Than Hoạt Tính

Than hoạt tính có cấu trúc xốp với diện tích bề mặt lớn, cho phép nó hấp phụ một lượng lớn các chất hữu cơ. Nghiên cứu này đánh giá khả năng hấp phụ vancomycin của than hoạt tính từ dịch lên men, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ, chẳng hạn như nồng độ vancomycin, pH và nhiệt độ. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc thiết kế quy trình tách chiết hiệu quả.

5.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Giải Hấp Phụ Vancomycin

Sau khi vancomycin được hấp phụ lên than hoạt tính, nó cần được giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. Nghiên cứu này đánh giá khả năng giải hấp phụ vancomycin của các dung môi khác nhau, xác định điều kiện tối ưu cho quá trình giải hấp phụ, chẳng hạn như loại dung môi, pH và thời gian. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng cho việc lựa chọn dung môi và điều kiện giải hấp phụ để thu được vancomycin với hiệu suất cao nhất.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Thu Nhận Vancomycin Tiếp Theo 56 ký tự

Nghiên cứu này đã thành công trong việc tối ưu hóa môi trường lên men và quy trình tách chiết vancomycin từ chủng S. orientalis. Kết quả cho thấy phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một công cụ hiệu quả để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Phương pháp hấp phụ bằng than hoạt tính cũng cho thấy tiềm năng lớn trong việc tách chiết vancomycin từ dịch lên men. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để cải thiện hơn nữa hiệu suất và giảm chi phí sản xuất vancomycin. Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể bao gồm cải thiện chủng S. orientalis bằng kỹ thuật di truyền, phát triển các phương pháp tách chiết thân thiện với môi trường hơn, và nghiên cứu ứng dụng vancomycin trong các lĩnh vực khác nhau.

6.1. Ứng Dụng và Tiềm Năng Phát Triển Của Vancomycin

Vancomycin tiếp tục là một kháng sinh quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương kháng thuốc. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu tiếp tục để cải thiện quy trình sản xuất và giảm chi phí, đồng thời khám phá các ứng dụng mới của vancomycin trong các lĩnh vực khác nhau, chẳng hạn như y học, thú y, và công nghiệp thực phẩm.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Thu Nhận Vancomycin Tương Lai

Để nâng cao hiệu quả sản xuất vancomycin, các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào cải thiện chủng S. orientalis thông qua kỹ thuật di truyền để tăng khả năng sinh tổng hợp vancomycin. Bên cạnh đó, cần phát triển các phương pháp tách chiết thân thiện với môi trường hơn và có chi phí thấp hơn. Cuối cùng, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng và sự kháng thuốc của vancomycin để phát triển các dẫn xuất mới có hoạt tính cao hơn và ít bị kháng thuốc hơn.

Tổng quan nghiên cứu

Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptit quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các chủng Staphylococcus kháng penicillin và methicillin. Từ khi được phát hiện vào năm 1956, vancomycin đã trở thành "thuốc cuối cùng" trong điều trị các nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn đa kháng thuốc, như MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Tuy nhiên, hiệu suất sản xuất vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis hiện còn thấp, dẫn đến giá thành cao và phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu.

Nghiên cứu này tập trung thu nhận vancomycin từ môi trường lên men chủng S. orientalis 4912, với mục tiêu tối ưu hóa môi trường lên men sử dụng nguyên liệu trong nước như bột đao và cao nấm men, đồng thời khảo sát các phương pháp tách chiết vancomycin hiệu quả. Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2015.

Việc nâng cao hiệu suất sản xuất vancomycin trong nước không chỉ góp phần giảm chi phí nhập khẩu, mà còn thúc đẩy phát triển ngành công nghệ sinh học và y dược trong nước, đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu cũng nhằm xây dựng quy trình sản xuất vancomycin quy mô công nghiệp phù hợp với điều kiện Việt Nam, góp phần bảo vệ sức khỏe trước nguy cơ kháng thuốc toàn cầu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin: Vancomycin ức chế tổng hợp peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn Gram dương, làm giảm tính bền vững của thành tế bào và dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn. Cơ chế này bao gồm giai đoạn gắn phân tử vancomycin vào đoạn N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của peptidoglycan, ngăn cản liên kết chéo peptit.

• Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn: Quá trình tổng hợp vancomycin do enzym NRPSs (nonribosomal protein synthase) điều khiển, tạo thành chuỗi heptapeptit từ các axit amin đặc hiệu, sau đó trải qua các biến đổi enzym như chlorination, hydroxylation và glycosylation để tạo thành phân tử hoạt tính.

• Tối ưu hóa môi trường lên men bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM): RSM là kỹ thuật thống kê dùng để xác định điều kiện tối ưu của các biến đầu vào (như nồng độ bột đao, cao nấm men) nhằm tối đa hóa hoạt tính kháng sinh vancomycin. Phương pháp này cho phép đánh giá tác động đồng thời và tương tác giữa các yếu tố.

• Phương pháp tách chiết vancomycin: Bao gồm tách chiết bằng dung môi hữu cơ, hấp phụ trên than hoạt tính hoặc nhựa trao đổi ion, nhằm thu hồi và tinh chế vancomycin từ dịch lên men.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu, nuôi cấy trong các môi trường lên men khác nhau. Các nguyên liệu trong nước như bột đao (nguồn cacbon) và cao nấm men (nguồn nitơ) được khảo sát.

• Phương pháp chọn mẫu: Chủng S. orientalis 4912 được bảo quản và hoạt hóa theo quy trình chuẩn, nuôi cấy trong môi trường MT3 và các môi trường thay thế để đánh giá khả năng sinh tổng hợp vancomycin.

• Phương pháp phân tích: Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 làm vi sinh vật kiểm định. Nồng độ vancomycin được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật học theo Dmitrieva và phân tích độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

• Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa: Sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm (CCD) trong RSM với 3 biến chính: nồng độ bột đao, cao nấm men và dầu đậu nành, mỗi biến được khảo sát ở 5 mức khác nhau. Tổng cộng 13 thí nghiệm được thực hiện, mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần.

• Timeline nghiên cứu: Quá trình lên men kéo dài 144 giờ, lấy mẫu định kỳ để theo dõi sinh khối và hoạt tính kháng sinh. Các thí nghiệm tách chiết và tinh chế vancomycin được thực hiện song song.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Đặc điểm sinh học của chủng S. orientalis 4912: Chủng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 28-30°C và pH 6-8, không sinh trưởng ở pH dưới 5 hoặc trên 9. Khuẩn lạc có kích thước 3-5 mm, bề mặt khô, xù xì, bào tử hình trụ dài 0,5-1 x 2-3 μm. Khả năng đồng hóa đa dạng các nguồn đường, trong đó glucose và bột đao là nguồn cacbon ưu việt.

2. Lựa chọn môi trường lên men: Môi trường MT3 (glucose 20 g/l, pepton 5 g/l, MgSO4 0,75 g/l, NaCl 1 g/l, KCl 0,5 g/l, dung dịch muối vi lượng 10 ml/l, pH 7) cho hoạt tính kháng sinh cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn 22,7 mm, vượt trội so với các môi trường khác (dao động 14,5-18,8 mm).

3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ: Bột đao là nguồn cacbon tối ưu với hoạt tính vancomycin đạt 23 mm và sinh khối 29,6 mg/ml, vượt trội so với glucose (21 mm, 31,55 mg/ml) và các nguồn khác. Nồng độ bột đao tối ưu là 25 g/l. Cao nấm men là nguồn nitơ hiệu quả nhất với hoạt tính kháng sinh 23,16 mm và sinh khối 25,61 mg/ml, nồng độ tối ưu 5 g/l.

4. Tối ưu hóa môi trường bằng RSM: Thiết kế CCD cho thấy sự tương tác giữa bột đao và cao nấm men ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính vancomycin. Môi trường tối ưu đạt được hoạt tính kháng sinh cao nhất khi bột đao ở 25 g/l và cao nấm men 5 g/l.

5. Phương pháp tách chiết vancomycin: Dung môi n-butanol tỉ lệ 2:1 với dịch lên men cho hiệu quả tách chiết cao nhất, vòng vô khuẩn đạt kích thước lớn nhất sau 2 giờ lắc. Than hoạt tính với nồng độ 3 g/100 ml dịch lên men hấp phụ vancomycin hiệu quả, dung môi nhả hấp phụ tốt nhất là hỗn hợp n-butanol và nước tỉ lệ 3:2 ở pH 7 trong 60 phút. Trao đổi ion với nhựa Dowex 50 H+ và Dowex 80 Cl- cho độ tinh sạch vancomycin trên 90% theo phân tích HPLC.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo trước đây về điều kiện sinh trưởng và tổng hợp vancomycin của S. orientalis. Việc lựa chọn bột đao làm nguồn cacbon chính không chỉ nâng cao hiệu suất sản xuất mà còn tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ, sẵn có tại Việt Nam, góp phần giảm chi phí sản xuất. Cao nấm men cung cấp nguồn nitơ hữu cơ giàu axit amin thiết yếu, hỗ trợ quá trình tổng hợp chuỗi heptapeptit của vancomycin.

Phương pháp tối ưu hóa RSM giúp xác định chính xác điều kiện môi trường lên men, đồng thời tiết kiệm thời gian và chi phí thí nghiệm so với phương pháp khảo sát từng yếu tố riêng lẻ. Các phương pháp tách chiết dung môi, hấp phụ và trao đổi ion được đánh giá là phù hợp để thu hồi và tinh chế vancomycin trong quy mô phòng thí nghiệm và có tiềm năng ứng dụng công nghiệp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ bề mặt đáp ứng thể hiện tương tác giữa bột đao và cao nấm men, bảng so sánh hoạt tính kháng sinh trên các môi trường và các phương pháp tách chiết, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả từng điều kiện.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng môi trường lên men tối ưu: Sử dụng bột đao 25 g/l và cao nấm men 5 g/l trong môi trường MT3 để nâng cao hiệu suất sản xuất vancomycin. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng. Chủ thể: các nhà máy sản xuất dược phẩm và viện nghiên cứu.

2. Triển khai quy trình tách chiết hiệu quả: Ưu tiên sử dụng dung môi n-butanol tỉ lệ 2:1 kết hợp với hấp phụ than hoạt tính và trao đổi ion để thu hồi vancomycin tinh khiết. Thời gian: 6 tháng. Chủ thể: phòng thí nghiệm và nhà máy sản xuất.

3. Phát triển quy mô công nghiệp: Xây dựng dây chuyền lên men và tách chiết vancomycin quy mô pilot, đánh giá khả năng mở rộng và tối ưu chi phí sản xuất. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: doanh nghiệp công nghệ sinh học.

4. Nghiên cứu cải tiến chủng vi sinh vật: Áp dụng công nghệ sinh học phân tử để cải tiến chủng S. orientalis 4912 nhằm tăng cường khả năng sinh tổng hợp vancomycin. Thời gian: 2-3 năm. Chủ thể: viện nghiên cứu, trường đại học.

5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật lên men và tách chiết vancomycin cho cán bộ kỹ thuật và nhà quản lý. Thời gian: liên tục. Chủ thể: viện nghiên cứu, doanh nghiệp.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học và vi sinh vật: Nghiên cứu về quy trình lên men, tối ưu hóa môi trường và sinh tổng hợp kháng sinh từ vi sinh vật.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm: Áp dụng quy trình sản xuất vancomycin trong nước, giảm chi phí nhập khẩu và nâng cao năng lực sản xuất.

3. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, dược học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, thiết kế thí nghiệm và phân tích dữ liệu trong lĩnh vực lên men và kháng sinh.

4. Cơ quan quản lý y tế và khoa học công nghệ: Đánh giá tiềm năng phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh trong nước, xây dựng chính sách hỗ trợ nghiên cứu và sản xuất.

Câu hỏi thường gặp

1. Vancomycin là gì và tại sao quan trọng?
   Vancomycin là kháng sinh glycopeptit dùng để điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các chủng kháng thuốc như MRSA. Nó được xem là "thuốc cuối cùng" trong điều trị các trường hợp kháng thuốc nghiêm trọng.

2. Tại sao chọn chủng S. orientalis 4912 để nghiên cứu?
   Chủng này có khả năng sinh tổng hợp vancomycin hiệu quả, được nhập khẩu từ Hàn Quốc và đã được xác định đặc điểm sinh học phù hợp với điều kiện lên men trong nước.

3. Nguồn nguyên liệu nào được sử dụng trong môi trường lên men?
   Bột đao (nguồn cacbon) và cao nấm men (nguồn nitơ) là các nguyên liệu trong nước được sử dụng, giúp giảm chi phí và tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có.

4. Phương pháp nào được dùng để xác định hoạt tính vancomycin?
   Phương pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633 được sử dụng để đo đường kính vòng vô khuẩn, phản ánh hoạt tính kháng sinh.

5. Làm thế nào để tách chiết vancomycin hiệu quả từ dịch lên men?
   Sử dụng dung môi n-butanol tỉ lệ 2:1, kết hợp hấp phụ trên than hoạt tính và tinh chế bằng trao đổi ion giúp thu hồi vancomycin với độ tinh sạch cao, phù hợp cho sản xuất quy mô lớn.

Kết luận

• Vancomycin được thu nhận hiệu quả từ chủng S. orientalis 4912 trong môi trường lên men tối ưu sử dụng bột đao 25 g/l và cao nấm men 5 g/l.
• Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) giúp xác định điều kiện tối ưu môi trường lên men, nâng cao hoạt tính kháng sinh.
• Dung môi n-butanol, than hoạt tính và nhựa trao đổi ion là các công cụ tách chiết và tinh chế vancomycin hiệu quả.
• Nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình sản xuất vancomycin trong nước, giảm chi phí nhập khẩu và thúc đẩy phát triển công nghệ sinh học.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng quy mô sản xuất pilot, cải tiến chủng vi sinh và chuyển giao công nghệ cho doanh nghiệp.

Hành động ngay: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp nên phối hợp triển khai ứng dụng quy trình tối ưu này để nâng cao năng lực sản xuất vancomycin trong nước, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng trước thách thức kháng thuốc.