Nghiên cứu biến đổi di truyền ở bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh

Tài liệu nghiên cứu Nghiên cứu biến đổi di truyền ở một bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh bằng phương pháp giải trình, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Dương Thị Hồng Hạnh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Huy Hoàng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Di Truyền Bệnh Tim Bẩm Sinh Qua Giải Trình Tự Gen
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỞ ĐẦU
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh tim bẩm sinh
• 1.2. Khái niệm về tim bẩm sinh
• 1.3. Nguyên nhân gây ra bệnh tim bẩm sinh
• 1.4. Các dạng dị tật tim bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh tim bẩm sinh
• 1.5. Chuẩn đoán bệnh tim bẩm sinh
• 1.6. Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân
• 1.7. Tình hình nghiên cứu về lĩnh vực liên quan đến đề tài
• 1.8. Các gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu và hóa chất
• 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.4. Phƣơng pháp tách DNA tổng số
• 2.5. Phƣơng pháp kiểm tra nồng độ DNA tổng số
• 2.6. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
• 2.7. Phƣơng pháp giải trình tự vùng gen mã hóa
• 2.8. Thiết kế mồi nhân đoạn gen chứa các đột biến cần kiểm nghiệm
• 2.9. Kỹ thuật PCR
• 2.10. Nguyên lý kỹ thuật PCR
• 2.11. Nhân đoạn gen LRP2 bằng kỹ thuật PCR
• 2.12. Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR đƣợc thực hiện trên máy GeneAmp PCR System 9700 thông qua 3 giai đoạn
• 2.13. Phƣơng pháp tinh sạch sản PCR
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập mẫu máu
• 3.2. Xác định nồng độ tinh sạch DNA. Tách chiết DNA tổng số
• 3.3. Kết quả xác định và chú giải biến thể
• 3.4. Kết quả sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh tim bẩm sinh
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• ĐỀ CƢƠNG TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh

Nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một trong những dị tật bẩm sinh phổ biến nhất, ảnh hưởng đến hàng triệu trẻ em trên toàn thế giới. Việc hiểu rõ về nguyên nhân di truyền của bệnh này có thể giúp cải thiện chẩn đoán và điều trị. Giải trình tự gen là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định các biến thể gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh, từ đó mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học.

1.1. Khái niệm và tầm quan trọng của bệnh tim bẩm sinh

Bệnh tim bẩm sinh là tình trạng bất thường về cấu trúc và chức năng của tim, xảy ra từ khi trẻ mới sinh ra. Tỷ lệ mắc bệnh này dao động từ 0,8% đến 2% ở trẻ sơ sinh, gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng cho sức khỏe. Việc nghiên cứu di truyền giúp xác định nguyên nhân và tìm ra phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Các dạng bệnh tim bẩm sinh phổ biến

Các dạng bệnh tim bẩm sinh bao gồm thông liên nhĩ, thông liên thất, và hẹp van động mạch chủ. Những dị tật này có thể gây ra các triệu chứng nghiêm trọng như khó thở, tím tái và suy tim. Việc nhận diện sớm các dạng bệnh này là rất quan trọng để có biện pháp can thiệp kịp thời.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Việc xác định chính xác các biến thể gen liên quan đến bệnh là một trong những vấn đề lớn nhất. Ngoài ra, sự phức tạp của các hội chứng di truyền cũng làm cho việc nghiên cứu trở nên khó khăn hơn.

2.1. Khó khăn trong việc xác định biến thể gen

Việc xác định các biến thể gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của các gen. Nhiều biến thể có thể không gây ra triệu chứng rõ ràng, làm cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn.

2.2. Tác động của môi trường đến bệnh tim bẩm sinh

Ngoài yếu tố di truyền, môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh tim bẩm sinh. Các yếu tố như dinh dưỡng, nhiễm trùng trong thai kỳ và tiếp xúc với hóa chất có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh.

III. Phương pháp giải trình tự gen trong nghiên cứu bệnh tim bẩm sinh

Giải trình tự gen là một phương pháp hiện đại giúp xác định các biến thể gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh. Phương pháp này cho phép phân tích toàn bộ vùng gen mã hóa, từ đó phát hiện các đột biến có thể gây ra bệnh. Việc áp dụng giải trình tự gen đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và điều trị.

3.1. Quy trình giải trình tự gen

Quy trình giải trình tự gen bao gồm các bước như tách chiết DNA, khuếch đại gen bằng PCR và phân tích dữ liệu. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Ứng dụng của giải trình tự gen trong chẩn đoán

Giải trình tự gen giúp phát hiện sớm các biến thể gen có liên quan đến bệnh tim bẩm sinh, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra chẩn đoán chính xác và kịp thời cho bệnh nhân.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh đã mang lại nhiều kết quả tích cực trong việc phát hiện và điều trị bệnh. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng việc áp dụng giải trình tự gen có thể giúp xác định nguyên nhân di truyền của bệnh, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.1. Kết quả từ các nghiên cứu gần đây

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng giải trình tự gen có thể phát hiện hàng nghìn biến thể gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh. Những kết quả này không chỉ giúp chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

4.2. Ứng dụng trong tư vấn di truyền

Kết quả nghiên cứu cũng có thể được sử dụng trong tư vấn di truyền cho các gia đình có tiền sử bệnh tim bẩm sinh. Điều này giúp họ hiểu rõ hơn về nguy cơ và lựa chọn các biện pháp phòng ngừa thích hợp.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh

Nghiên cứu di truyền bệnh tim bẩm sinh đang trên đà phát triển mạnh mẽ. Với sự tiến bộ của công nghệ giải trình tự gen, hy vọng rằng trong tương lai, việc chẩn đoán và điều trị bệnh sẽ trở nên hiệu quả hơn. Cần tiếp tục đầu tư vào nghiên cứu để tìm ra các phương pháp mới giúp cải thiện sức khỏe cho trẻ em mắc bệnh tim bẩm sinh.

5.1. Tương lai của nghiên cứu di truyền

Trong tương lai, nghiên cứu di truyền có thể giúp phát hiện sớm hơn các bệnh tim bẩm sinh, từ đó nâng cao tỷ lệ sống sót và chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Vai trò của công nghệ trong nghiên cứu

Công nghệ giải trình tự gen sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị bệnh tim bẩm sinh. Việc áp dụng công nghệ mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một tình trạng bất thƣờng về cấu trúc và chức năng của tim. Vấn đề có từ khi trẻ mới đƣợc sinh ra và còn đƣợc gọi là bệnh tim bẩm sinh hay dị tật tim bẩm sinh (Congenital Heart Defects CHDs). Trên thực tế, nhiều trƣờng hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức. Trái tim của em bé bắt đầu phát triển từ khi thụ thai và đƣợc hình thành hoàn toàn sau 8 tuần mang thai.

Các dị tật tim bẩm sinh thƣờng xảy ra trong 8 tuần đầu tiên. Bệnh tim bẩm sinh xảy ra khi tim hoặc các mạch máu gần tim không phát triển bình thƣờng trƣớc khi sinh. Các vấn đề về tim bẩm sinh có thể ở các dạng từ đơn giản đến phức tạp. Một số khiếm khuyết ở tim có thể đƣợc bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc.

Một số trƣờng hợp khác sẽ đƣợc yêu cầu phẫu thuật, đôi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh. Một số em bé có thể mắc một số vấn đề về tim đơn giản. Những khiếm khuyết này có thể tự phục hồi khi em bé lớn lên. Tuy nhiên một vài trƣờng hợp sẽ có những khiếm khuyết cần đƣợc theo dõi và điều trị suốt đời.

Dị tật tim bẩm sinh là các bệnh liên quan đến cấu trúc của tim và buồng tim. Xảy ra khi cấu trúc của tim khác thƣờng hoặc buồng tim có dị tật. Dị tật tim bẩm sinh có thể liên quan đến bất kỳ phần nào của tim bao gồm buồng tim, van tim, vách tim, các động mạch và tĩnh mạch của tim. Chúng đều làm ảnh hƣởng đến dòng chảy bình thƣờng của máu qua tim, khiến cơ thể trẻ không nhận đủ lƣợng oxy cần thiết [1].

Chính vì vậy chuẩn đoán sớm bệnh tim bẩm sinh rất cần thiết. Chẩn đoán muộn bệnh sẽ làm chậm sự bắt đầu của các phƣơng pháp điều trị đặc hiệu dẫn đến những hậu quả đáng tiếc, đe dọa đến cuộc sống bao gồm tình trạng lâm sàng nặng hơn gây tâm lý nặng nề cho bệnh nhân và gia đình, thậm chí tử vong trong trƣờng hợp bệnh tiến triển. Trong Dƣơng Thị Hồng Hạnh 1 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH trƣờng hợp bệnh đƣợc di truyền, các anh chị em khác trong gia đình cũng có nguy cơ bị ảnh hƣởng cao. Đối với những gia đình này, việc không có một chẩn đoán cụ thể và tiếp cận với tƣ vấn di truyền, làm tăng nguy cơ về việc có một đứa trẻ khác bị bệnh đƣợc sinh ra.

Giải trình tự gen thế hệ mới (giải trình tự vùng gen mã hóa – whole exome sequencing, hoặc toàn bộ bộ gen của con ngƣời – whole genome sequencing) [2] có thể đƣợc sử dụng để nghiên cứu các gen bệnh theo di truyền Mendel. Giải trình tự gen thế hệ mới đã đƣợc xem nhƣ là một công cụ hữu hiệu cho phát hiện các gen bệnh mới, đặc biệt giải trình tự vùng mã hóa có thể sẽ trở thành công cụ phổ biến nhất đƣợc sử dụng để xác định gen bệnh theo di truyền Mendel cho những năm tới. Hàng chục nghìn biến thể gen có thể đƣợc xác định trong vùng gen mã hóa trong nhiều bệnh phức tạp nhƣ: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa. Mục đích của đề tài: Đề tài tiến hành giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) ở một số bệnh nhi mắc dị tật tim bẩm sinh để tìm hiểu rõ nguyên nhân di truyền của bệnh, từ đó có phƣơng pháp chẩn đoán, điều trị và tƣ vấn di truyền thích hợp cho bệnh nhân và gia đình.

Nội dung đề tài:  Thu thập mẫu máu của bệnh nhi mắc tim bẩm sinh.  Tách chiết và bảo quản DNA tổng số.  Giải trình tự vùng gen mã hóa của 01 bệnh nhân nhi mắc bệnh dị tật tim bẩm sinh, dự đoán và xác định đột biến gen liên quan đến bệnh.  Kiểm chứng và đánh giá đột biến tìm đƣợc.

Dƣơng Thị Hồng Hạnh 2 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tim bẩm sinh 1.1 Khái niệm về tim bẩm sinh Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là dị tật bẩm sinh phổ biến nhất ở ngƣời và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở trẻ sơ sinh. Các dị tật tim bẩm sinh thƣờng xảy ra trong 8 tuần đầu tiên khi tim hoặc các mạch máu gần tim không phát triển bình thƣờng trƣớc khi sinh. Với tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 0,8 - 2% ở trẻ sơ sinh dự đoán tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tất cả trẻ sơ sinh, bệnh tim bẩm sinh gây ra tỷ lệ thai chết lƣu lớn hơn nhiều [3;4]. Ngoài ra, các dị tật nhẹ chƣa đƣợc chẩn đoán của tim thƣờng xuất hiện muộn hơn ở tuổi trƣởng thành hoặc không đƣợc chẩn đoán suốt đời.

Trong trƣờng hợp này, ngƣời ta dự đoán tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tất cả trẻ sơ sinh. Phần lớn bệnh TBS đƣợc cho là do đột biến gen. Điều này đƣợc quan sát ban đầu về sự di truyền trong các gia đình. Một bằng chứng khác đến từ các hội chứng bẩm sinh do sự mất đoạn của các vùng nhiễm sắc thể sẽ dẫn đến TBS cùng với một số biểu hiện khác.

Trong vài thập kỷ qua, cùng với sự ra đời của giải trình tự gen và các kỹ thuật khác, ngƣời ta có thể xác định đƣợc nguyên nhân di truyền của bệnh TBS. Trong các trƣờng hợp hội chứng, mặc dù có thể xác định đƣợc sự mất đoạn nhiễm sắc thể gây ra bệnh, nhƣng trong nhiều trƣờng hợp, gen chịu trách nhiệm về kiểu hình tim vẫn chƣa đƣợc xác định. Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một tình trạng bất thƣờng về cấu trúc và chức năng của tim. Vấn đề có từ khi trẻ mới đƣợc sinh ra và còn đƣợc gọi là dị tật tim bẩm sinh.

Trên thực tế, đã có nhiều trƣờng hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức. Dƣơng Thị Hồng Hạnh 3 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Các vấn đề về tim bẩm sinh có thể ở các dạng từ đơn giản đến phức tạp. Một số khiếm khuyết ở tim có thể đƣợc bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc. Một số trƣờng hợp khác sẽ đƣợc yêu cầu phẫu thuật, đôi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh.

Một em bé có thể mắc một số vấn đề về tim đơn giản và sẽ tự hồi phục khi lớn lên. Tuy nhiên, một vài trƣờng hợp sẽ có những khiếm khuyết cần đƣợc điều trị suốt đời. Các dấu hiệu bệnh tùy thuộc vào kiểu cụ thể của dị tật có thể nguy hiểm tính mạng. Các triệu chứng thƣờng thấy gồm thở nhanh, tím tái, khó lên cân, và cảm thấy mệt mỏi [5].

Các triệu chứng của bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh và trẻ em có thể bao gồm:  Da, móng tay và môi có màu hơi xanh (các bác sĩ gọi đây là chứng xanh tím, một tình trạng do máu thiếu oxy)  Thở nhanh và bú kém  Tăng cân kém  Nhiễm trùng phổi  Không có khả năng tập thể dục. Bệnh này không gây ra đau ngực. Đa số các vấn đề tim bẩm sinh không xảy ra đồng thời với các bệnh khác. Các biến chúng có thể xảy ra do dị tật tim gồm có suy tim.

Nguyên nhân gây ra bệnh tim bẩm sinh Nguyên nhân của một bất thƣờng tim bẩm sinh thƣờng không rõ [6]. Một số trƣờng hợp có thể là do nhiễm trùng trong giai đoạn mang thai nhƣ nhiễm Rubella, việc sử dụng một số loại dƣợc phẩm hay các chất nhƣ rƣợu hay thuốc lá, bố mẹ có quan hệ cận huyết, hay tình trạng dinh dƣỡng kém hoặc béo phì ở ngƣời mẹ [7]. Bố hoặc mẹ mắc bệnh tim bẩm sinh cũng là một yếu tố nguy cơ [8]. Một số bệnh di truyền có liên quan đến dị tật tim bao gồm hội chứng Down, hội chứng Turner và hội chứng Dƣơng Thị Hồng Hạnh 4 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Marfan.

Các bệnh tim bẩm sinh đƣợc chia thành hai nhóm chính: các bệnh tim bẩm sinh tím và các bệnh tim bẩm sinh không tím, dựa vào việc bệnh nhi có khả năng chuyển màu tím tái hay không. Các bất thƣờng có thể ở thành trong của tim, các van tim, hay các mạch máu lớn dẫn máu đến và đi khỏi tim.  Bệnh tim bẩm sinh do di truyền + Di truyền trên nhiễm sắc thể thƣờng mang gen trội với các hội chứng đa dị tật: Bệnh tim bẩm sinh là dị tật chính nhƣ hội chứng Noonan (bệnh di truyền có liên quan tới tim), hội chứng Marfan (hội chứng di truyền ảnh hƣởng đến mô liên kết). + Di truyền trên nhiễm sắc thể thƣờng mang gen lặn: hội chứng Jervell (quá trình kéo dài, đột tử), hội chứng Ellis Van Creveld (tim chỉ có 1 nhĩ kèm các dị tật khác).

Di truyền theo thể ẩn có liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính: thƣờng bị ở trẻ trai nhƣ hội chứng Hunter (dị tật ở nhiều van tim và động mạch vành), loạn dƣỡng cơ Duchenne. + Đã có nhiều tổn thƣơng tim bẩm sinh do bất thƣờng cấu trúc di truyền đƣợc phát hiện, có thể là đảo đoạn, mất đoạn hay thêm đoạn DNA. Các bất thƣờng hay gặp nhất tại NST số 21, 13 và 18, chiếm khoảng 5 - 8 % trƣờng hợp TBS, trong đó đột biến cấu trúc NST 21 là phổ biến nhất. Ngoài ra cũng đã phát hiện ra tổn thƣơng tại một số NST khác, bao gồm đột biến cấu trúc nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (22q11, Hội chứng DiGeorge), nhánh dài NST số 1 (1q21), nhánh ngắn NST số 8 (8p23).

 Các nguyên nhân từ môi trƣờng gây bệnh tim bẩm sinh + Các tác nhân vật lý nhƣ các loại tia phóng xạ, tia gama, tia quang tuyến X. Nhiễm độc các loại hóa chất, độc chất, các thuốc kháng động kinh, thuốc an thần. Nhiễm trùng virus đặc biệt là Rubella trong 3 tháng đầu có thai. Các bệnh của mẹ mắc khi đang mang thai: đái tháo đƣờng, bệnh Dƣơng Thị Hồng Hạnh 5 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH Lupus ban đỏ (là bệnh tự sinh ra kháng thể chống lại chính bản thân mình).

Đặc biệt nguy hiểm là mẹ bị nhiễm virus cúm trong ba tháng đầu mang thai. Các dạng dị tật tim bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh tim bẩm sinh: Hầu hết các vấn đề về tim bẩm sinh là các vấn đề về cấu trúc nhƣ lỗ và van bị rò rỉ [7]. Cụ thể nhƣ:  Các khuyết tật van tim: Một có thể quá hẹp hoặc đóng hoàn toàn. Điều đó làm cho máu khó đi qua.

Đôi khi, nó không thể vƣợt qua đƣợc. Trong các trƣờng hợp khác, van có thể không đóng đúng cách, do đó máu bị rò rỉ ngƣợc lại.