Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh tim bẩm sinh (Congenital Heart Defects - CHDs) là tình trạng bất thường về cấu trúc và chức năng của tim xuất hiện ngay từ khi trẻ mới sinh ra. Quá trình hình thành tim diễn ra từ khi thụ thai và hoàn thiện sau 8 tuần đầu của thai kỳ, do đó các dị tật tim bẩm sinh chủ yếu phát sinh trong giai đoạn 8 tuần đầu này. Bệnh có tỷ lệ mắc dao động từ 0,8% đến 2% ở trẻ sơ sinh sống và có thể lên tới 4% nếu tính cả các dị tật nhẹ xuất hiện muộn ở tuổi trưởng thành. Trên quy mô toàn cầu, năm 2015 ghi nhận khoảng 48,9 triệu người mắc và là nguyên nhân gây ra 303.300 ca tử vong ở trẻ em. Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 20.000 trẻ sinh ra mắc bệnh tim bẩm sinh, tuy nhiên chỉ có khoảng 1/10 trường hợp được can thiệp phẫu thuật kịp thời.

Nguyên nhân gây bệnh tim bẩm sinh bao gồm yếu tố môi trường (nhiễm trùng Rubella, hóa chất, phóng xạ, đái tháo đường thai kỳ) và yếu tố di truyền. Bất thường di truyền có thể do sai lệch số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể (như đột biến tại NST 21, 13, 18, 22q11, 1q21, 8p23) hoặc các đột biến đơn gen liên quan đến quá trình phát triển tim (như MYH6, GATA4, TBX5, NKX2-5, TBX1, LRP2). Việc chẩn đoán muộn gây nguy cơ suy tim nặng, giảm chất lượng sống và tử vong. Phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (Whole Exome Sequencing - WES) cho phép khảo sát hàng chục nghìn biến thể trên 85% các vùng gen gây bệnh đã biết, hỗ trợ xác định chính xác nguyên nhân phân tử phục vụ tư vấn di truyền.

Khóa luận xác định mục đích nghiên cứu là tiến hành giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở bệnh nhi mắc dị tật tim bẩm sinh nhằm làm rõ nguyên nhân di truyền, từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho chẩn đoán, định hướng điều trị và tư vấn di truyền cho gia đình.

Nhiệm vụ nghiên cứu được văn bản xác định gồm 4 nội dung:

  1. Thu thập mẫu máu của bệnh nhi mắc tim bẩm sinh.
  2. Tách chiết và bảo quản DNA tổng số.
  3. Giải trình tự vùng gen mã hóa của 01 bệnh nhân nhi mắc bệnh dị tật tim bẩm sinh, dự đoán và xác định đột biến gen liên quan đến bệnh.
  4. Kiểm chứng và đánh giá đột biến tìm được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Mẫu máu của 01 bệnh nhân nhi mắc dị tật tim bẩm sinh (có triệu chứng lâm sàng: thông liên nhĩ, hở hàm ếch, teo thận, biểu hiện hội chứng Donnai-Barrow) cùng các thành viên trực hệ trong gia đình (bố, mẹ).
  • Phạm vi không gian: Mẫu bệnh phẩm được thu thập tại Khoa Tim mạch - Bệnh viện E Hà Nội; các thực nghiệm sinh học phân tử và giải trình tự gen được thực hiện tại Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu hoàn thành vào tháng 5 năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của đề tài dựa trên di truyền học phân tử về bệnh tim bẩm sinh và hội chứng Donnai-Barrow (DBS/FOAR). Gen LRP2 (định vị tại vùng nhiễm sắc thể 2q31.1, kích thước 235.489 bp) mã hóa protein megalin (low-density lipoprotein receptor-related protein 2). Megalin là một thụ thể nội bào đa phối tử biểu hiện chủ yếu ở tế bào biểu mô ống thận và các cơ quan phát triển phôi thai, giữ vai trò tái hấp thu lipoprotein, vitamin, hormone và dẫn truyền tín hiệu tế bào. Đột biến mất chức năng trên gen LRP2 dẫn đến hội chứng Donnai-Barrow với các biểu hiện đa dị tật gồm dị tật tim, teo thận, hở hàm ếch, chậm phát triển và bất thường thần kinh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích dữ liệu bao gồm:

  1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) và GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo) tách chiết DNA từ 200 µl mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA (1,5 mg/ml).

  2. Phương pháp kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA:

  • Đo mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng máy đo quang phổ. Nồng độ DNA được tính theo công thức: $$C_{\text{DNA}} (\text{ng/}\mu\text{l}) = A_{260} \times 50 \times \text{Độ pha loãng}$$
  • Đánh giá độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (ngưỡng chuẩn 1,8 – 2,0).
  • Kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trên gel agarose 1%, nhuộm Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại trên hệ thống Bio-Rad.
  1. Phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES):
  • Tạo thư viện exome bằng bộ kít SureSelect All Exon V6 (Agilent/Illumina).
  • Kiểm tra phân bố kích thước thư viện trên máy Agilent 2100 Bioanalyzer bằng chip DNA 1000.
  • Giải trình tự thế hệ mới trên hệ thống Illumina.
  1. Phương pháp tin sinh học phân tích và chú giải biến thể:
  • Kiểm tra chất lượng dữ liệu đọc thô bằng phần mềm FastQC.
  • Gióng hàng trình tự với hệ gen người tham chiếu (hg19) bằng phần mềm BWA (Burrows-Wheeler Aligner).
  • Loại bỏ các phân tử trùng lặp và xử lý dữ liệu sau gióng hàng bằng công cụ Picard.
  • Phát hiện biến thể di truyền bằng phần mềm Genome Analysis Toolkit (GATK v3.4).
  • Chú giải và dự đoán tác động chức năng của biến thể bằng phần mềm SnpEff v4.1.
  • Tiêu chí sàng lọc biến thể: Nằm trên các gen liên quan đến dị tật tim bẩm sinh và hội chứng liên quan; tần số alen trong quần thể (MAF) < 1% trên cơ sở dữ liệu 1000 Genomes Project; dự đoán làm thay đổi chức năng protein; loại bỏ các biến thể đã được phân loại là lành tính trên ClinVar.
  1. Phương pháp thiết kế mồi và kiểm chứng Sanger:
  • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu dựa trên trình tự gen LRP2 (Ensembl ID: ENSG00000081479) bằng công cụ Primer-BLAST:
    • Mồi xuôi (LRP2_14_F): 5’-AGGGAGCATACTTCTTTTGTGTATC-3’
    • Mồi ngược (LRP2_14_R): 5’-CTGAGGAGTCCCTGCAATCA-3’
    • Kích thước sản phẩm khuếch đại lý thuyết: 240 bp.
  • Phản ứng PCR thực hiện trên máy GeneAmp PCR System 9700 với tổng thể tích 25 µl (chứa Taq polymerase 1 U/µl, dNTP 10 mM, mồi mỗi loại 10 mM, DNA khuôn 100 ng/µl). Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 95°C trong 3 phút; 30 chu kỳ gồm (95°C trong 1 phút, gắn mồi 60,5°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 1 phút); kéo dài kết thúc 72°C trong 8 phút; giữ ở 4°C.
  • Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit GeneJET Gel Extraction (Thermo) và tiến hành giải trình tự kiểm chứng bằng phương pháp Sanger.

Nguồn dữ liệu: Mẫu máu lâm sàng tại Bệnh viện E; cơ sở dữ liệu hệ gen tham chiếu hg19, dbSNP142, 1000 Genomes Project, ClinVar, Ensembl.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp cơ sở lý luận và các nghiên cứu liên quan đến bệnh tim bẩm sinh:

  • Định nghĩa, dịch tễ học và phân loại: Tim bẩm sinh được chia thành hai nhóm lớn là nhóm đi kèm hội chứng di truyền (Down, Turner, Noonan, Marfan, Ellis-Van Creveld, DiGeorge, Donnai-Barrow...) và nhóm không đi kèm hội chứng. Phân loại theo lâm sàng gồm tim bẩm sinh tím và không tím.
  • Cơ chế phân tử: Liệt kê các yếu tố phiên mã và gen cấu trúc điều hòa quá trình tạo tim như MYH6, GATA4, TBX5, NKX2-5, TBX1, NOTCH1, NOS3, CELA1.
  • Cấu trúc và chức năng gen LRP2: Nằm trên nhiễm sắc thể 2 (2q31.1), gồm 235.489 bp, mã hóa thụ thể megalin tham gia vào cơ chế nhập bào và vận chuyển dưỡng chất. Đột biến mất chức năng gen này gây ra hội chứng Donnai-Barrow (DBS) và hội chứng facio-oculo-acoustico-renal (FOAR).
  • Nguyên lý công nghệ giải trình tự thế hệ mới WES: Phân tích ưu thế của WES trong việc tầm soát các biến dị gây bệnh thuộc vùng exome chiếm 2% hệ gen nhưng đại diện cho 85% nguyên nhân bệnh đơn gen di truyền Mendel.

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng:

  • Tiêu chuẩn đạo đức y sinh: Nghiên cứu được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học - Viện Nghiên cứu hệ gen thông qua trên cơ sở đồng thuận tự nguyện của gia đình bệnh nhân.
  • Quy trình 12 bước tách chiết DNA bằng cột silica (QIAamp DNA Blood Mini Kit).
  • Quy trình đo quang phổ UV-Vis ở 260 nm và 280 nm xác định nồng độ và độ sạch DNA.
  • Quy trình kiểm tra kích thước thư viện exome (SureSelect All Exon V6) bằng Agilent 2100 Bioanalyzer.
  • Quy trình phân tích dữ liệu giải trình tự thô thông qua chuỗi công cụ tin sinh học FastQC, BWA, Picard, GATK v3.4, SnpEff v4.1 và bộ lọc tần số alen MAF < 1%.
  • Quy trình PCR khuếch đại phân đoạn gen LRP2 dài 240 bp trên máy GeneAmp PCR System 9700 và quy trình 9 bước tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit GeneJET Gel Extraction phục vụ giải trình tự Sanger.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình xét nghiệm di truyền:

  • Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của gia đình bệnh nhân: Mẫu bệnh nhi đạt nồng độ 41,3 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,91$); mẫu bố đạt 72,38 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,87$); mẫu mẹ đạt 71,52 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,90$). Bản điện di gel agarose 1% cho thấy các vạch DNA gọn, rõ, không bị đứt gãy.
  • Kết quả kiểm tra thư viện WES: Kích thước phân đoạn thư viện đạt 357 bp, nồng độ đạt 35,5 ng/µl.
  • Thông số kỹ thuật giải trình tự và gióng hàng: Dữ liệu đạt 59.604 lượt đọc với độ dài trung bình 149,85 bp, tổng sản lượng 8.923 Mbp. Tỷ lệ gióng hàng thành công với hệ gen hg19 đạt 99,8% (59.262 đoạn), sau khi loại bỏ trùng lặp đạt 92,0% (54.940 đoạn). Độ sâu bao phủ trung bình đạt 90,4X.
  • Thống kê biến thể di truyền: Xác định được 82.420 biến thể nucleotide đơn (SNP) và 11.514 biến thể thêm/mất nucleotide (Indel). Tỷ lệ Ts/Tv đạt 2,3; tỷ lệ dị hợp tử/đồng hợp tử (Het/Hom) là 1,3; tỷ lệ biến thể đã ghi nhận trong dbSNP142 đạt 95,8%.
  • Sàng lọc và kiểm chứng biến thể: Phát hiện đột biến mất 3 nucleotide c.428-10_428-8delTTT trên gen LRP2. Sản phẩm khuếch đại PCR đoạn gen chứa điểm đột biến cho băng sáng đơn kích thước chính xác 240 bp trên gel agarose 1%. Kết quả giải trình tự Sanger xác nhận sự hiện diện của biến thể này ở gia đình người bệnh.

Phần IV: Kết luận

Khóa luận tổng kết việc thực hiện hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật từ tách chiết mẫu, giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa WES, phân tích tin sinh học đến kiểm chứng Sanger. Nghiên cứu đã xác định được đột biến mất nucleotide c.428-10_428-8delTTT trên gen LRP2 ở bệnh nhân dị tật tim bẩm sinh kèm các hội chứng đa dị tật.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và xử lý thành công hệ thống dữ liệu thực nghiệm sinh học phân tử từ mẫu bệnh nhân tim bẩm sinh và gia đình. Các kết quả định lượng chính được tổng hợp trong các bảng sau:

Đối tượng mẫu Nồng độ DNA (ng/µl) Tỷ số $A_{260}/A_{280}$
Bệnh nhi mắc bệnh 41,30 1,91
Bố bệnh nhi 72,38 1,87
Mẹ bệnh nhi 71,52 1,90
Chỉ số chất lượng giải trình tự và gióng hàng Giá trị định lượng
Kích thước thư viện DNA (Bioanalyzer 2100) 357 bp
Nồng độ thư viện DNA 35,5 ng/µl
Tổng số trình tự đọc (Reads) 59.604
Độ dài đọc trung bình 149,85 bp
Tổng sản lượng dữ liệu 8.923 Mbp
Độ sâu bao phủ trung bình của vùng mục tiêu 90,4X
Tỷ lệ gióng hàng thành công ban đầu 99,8% (59.262 đoạn)
Tỷ lệ gióng hàng sau khi lọc phân tử trùng lặp 92,0% (54.940 đoạn)
Tỷ lệ biến thể đã có trong dbSNP142 95,8%
Tỷ lệ chuyển tiếp/đảo chuyển (Ts/Tv) 2,3
Tỷ lệ dị hợp tử/đồng hợp tử (Het/Hom) 1,3
Loại biến thể di truyền phát hiện từ WES Số lượng biến thể
Tổng số SNP 82.420
- Biến thể đồng nghĩa 11.787
- Biến thể sai nghĩa 11.325
- Thêm bộ ba mã hóa kết thúc (Stop-gain) 118
- Mất bộ ba mã hóa kết thúc (Stop-loss) 42
Tổng số Indel 11.514
- Biến thể dịch khung (Frameshift) 349
- Thêm bộ ba mã hóa (Codon insertion) 189
- Mất bộ ba mã hóa (Codon deletion) 217

Đóng góp khoa học và thực tiễn của khóa luận:

  • Phát hiện đột biến mất 3 nucleotide c.428-10_428-8delTTT trên gen LRP2. Đây là một biến thể mới chưa từng được công bố trên các cơ sở dữ liệu di truyền quốc tế trước thời điểm nghiên cứu.
  • Xác định nguyên nhân di truyền ở cấp độ phân tử gây nên hội chứng Donnai-Barrow ở bệnh nhân mang kiểu hình tim bẩm sinh (thông liên nhĩ) phối hợp cùng dị tật hở hàm ếch và teo thận.
  • Cung cấp dẫn liệu di truyền chính xác giúp các bác sĩ lâm sàng đưa ra chẩn đoán xác định, xây dựng phác đồ theo dõi điều trị phù hợp và thực hiện tư vấn di truyền cho bố mẹ bệnh nhân nhằm đánh giá nguy cơ tái mắc ở các lần sinh tiếp theo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Phạm vi nghiên cứu mới chỉ thực hiện trên cỡ mẫu đơn lẻ gồm 01 bệnh nhân và người thân trực hệ (bố, mẹ), chưa mở rộng khảo sát trên quần thể bệnh nhân tim bẩm sinh quy mô lớn.
  • Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) tập trung vào vùng exon nên chưa bao quát được các biến đổi cấu trúc lớn (CNV) hoặc các đột biến nằm sâu trong vùng intron và vùng điều hòa phiên mã (intergenic).
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức độ phát hiện và kiểm chứng trình tự đột biến thông qua Sanger, chưa tiến hành các thử nghiệm chức năng in vitro hoặc in vivo để đánh giá trực tiếp mức độ suy giảm biểu hiện của thụ thể megalin do biến thể c.428-10_428-8delTTT gây ra.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng quy mô giải trình tự WES trên các nhóm bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh đơn thuần và tim bẩm sinh dạng hội chứng khác.
  • Thực hiện các phân tích chức năng protein và sinh học tế bào đối với biến thể c.428-10_428-8delTTT trên gen LRP2 nhằm làm rõ cơ chế bệnh sinh phân tử.
  • Thu thập thêm mẫu từ các thế hệ khác trong gia đình để hoàn thiện sơ đồ phả hệ và xác định chính xác phương thức di truyền của biến thể.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Sinh học phân tử và Tim mạch nhi khoa.

Các nội dung có giá trị tham khảo thực tiễn cao bao gồm:

  • Quy trình chuẩn bị thư viện giải trình tự WES sử dụng kít SureSelect All Exon V6 và quy trình kiểm định chất lượng thư viện trên Agilent 2100 Bioanalyzer.
  • Chuỗi quy trình tin sinh học (Bioinformatics pipeline) kết hợp các công cụ FastQC, BWA, Picard, GATK v3.4 và SnpEff v4.1 trong xử lý dữ liệu giải trình tự NGS và lọc biến thể theo tần số alen MAF.
  • Thông số kỹ thuật thiết kế cặp mồi đặc hiệu LRP2_14 và chu trình nhiệt PCR tối ưu hóa trên máy GeneAmp PCR System 9700 phục vụ kiểm chứng đột biến gen LRP2 bằng phương pháp Sanger.

Câu hỏi thường gặp

1. Bệnh nhân nhi trong nghiên cứu có những đặc điểm bệnh lý lâm sàng cụ thể nào?

Bệnh nhân nhi tham gia nghiên cứu được chẩn đoán mắc dị tật tim bẩm sinh với tổn thương thông liên nhĩ, đồng thời xuất hiện các dị tật phối hợp gồm hở hàm ếch, teo thận và các triệu chứng đặc trưng của hội chứng Donnai-Barrow.

2. Biến thể di truyền mới được phát hiện trong khóa luận là gì và nằm trên gen nào?

Khóa luận đã phát hiện và xác định biến thể mất 3 nucleotide ký hiệu là c.428-10_428-8delTTT nằm trên gen LRP2 (gen định vị tại nhiễm sắc thể số 2, vùng 2q31.1, mã hóa protein thụ thể megalin). Biến thể này chưa từng được công bố trước đó trên các cơ sở dữ liệu biến dị di truyền.

3. Chất lượng và nồng độ DNA tách chiết từ các mẫu máu trong nghiên cứu đạt mức nào?

Mẫu máu toàn phần được tách chiết bằng kít QIAamp DNA Blood Mini Kit, cho kết quả nồng độ DNA của bệnh nhi là 41,3 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,91$), bố bệnh nhi là 72,38 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,87$) và mẹ bệnh nhi là 71,52 ng/µl ($A_{260}/A_{280} = 1,90$). Các tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đều nằm trong giới hạn chuẩn từ 1,8 đến 2,0, đảm bảo độ sạch và độ nguyên vẹn cho phản ứng PCR và tạo thư viện WES.

4. Dữ liệu giải trình tự exome thế hệ mới (WES) đạt được các thông số kỹ thuật nào?

Thư viện DNA tạo bởi kít SureSelect All Exon V6 có kích thước 357 bp và nồng độ 35,5 ng/µl. Quá trình giải trình tự trên hệ thống Illumina thu được 59.604 đoạn đọc với độ dài trung bình 149,85 bp, tổng sản lượng 8.923 Mbp. Dữ liệu sau khi gióng hàng với hệ gen hg19 đạt tỷ lệ thành công 99,8% (92,0% sau khi khử trùng lặp) và độ sâu bao phủ trung bình đạt 90,4X.

5. Cặp mồi và điều kiện phản ứng PCR nào được sử dụng để kiểm chứng đột biến gen LRP2?

Đoạn gen chứa điểm đột biến được khuếch đại bằng cặp mồi LRP2_14: mồi xuôi 5’-AGGGAGCATACTTCTTTTGTGTATC-3’ và mồi ngược 5’-CTGAGGAGTCCCTGCAATCA-3’ (kích thước sản phẩm 240 bp). Chu trình nhiệt tối ưu gồm: biến tính 95°C trong 3 phút; 30 chu kỳ lặp lại (95°C trong 1 phút, gắn mồi 60,5°C trong 1 phút, kéo dài 72°C trong 1 phút); kéo dài kết thúc 72°C trong 8 phút.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Dương Thị Hồng Hạnh đã ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES) kết hợp chuỗi phân tích tin sinh học để khảo sát hệ biến thái di truyền ở bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh. Nghiên cứu đã phát hiện một đột biến mới dạng mất nucleotide c.428-10_428-8delTTT trên gen LRP2 liên quan đến hội chứng Donnai-Barrow và kiểm chứng thành công bằng kỹ thuật PCR-Sanger với sản phẩm đặc hiệu 240 bp. Kết quả này cung cấp cơ sở phân tử quan trọng phục vụ chẩn đoán bệnh chính xác và tư vấn di truyền lâm sàng cho gia đình người bệnh.