Nghiên Cứu Đặc Điểm Thực Vật và Tác Dụng Ức Chế Enzym Acetylcholinesterase của Hai Loài Piper

Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài piper thomsonii và piper hymenophyllum.

• Tác giả: Hoàng Việt Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Quyên
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Học Cổ Truyền
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Thực Vật và Tác Dụng Ức Chế Enzym Acetylcholinesterase của Hai Loài Piper
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Tổng quan về chi Piper L.
• 1.2. Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Piper L.
• 1.2.1. Vị trí phân loại chi Piper L.
• 1.2.2. Đặc điểm phân bố chi Piper L. trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.3. Đặc điểm thực vật chi Piper L.
• 1.4. Danh lục các loài thuộc chi Piper L.
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.5.1. Nghiên cứu trên thế giới
• 1.5.2. Nghiên cứu trong nước
• 1.6. Công dụng, tác dụng sinh học và độc tính của chi Piper L.
• 1.6.1. Công dụng của chi Piper L.
• 1.6.2. Tác dụng sinh học và độc tính của chi Piper L.
• 1.7. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 1.7.1. Acetylcholin, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer
• 1.7.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 1.7.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
• 1.7.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.1.1. Mẫu nghiên cứu
• 2.1.2. Hóa chất, dung môi
• 2.2. Máy móc, thiết bị và dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phân tích đặc điểm thực vật
• 2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
• 2.3.3. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
• 2.3.4. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được
• 2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 2.3.5.1. Triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 2.3.5.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu
• 2.4. Xử lý số liệu
• 2.5. Địa điểm thực hiện
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật
• 3.1.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật của loài HVD-002-11
• 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài HVD-002-11
• 3.1.1.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Piper thomsonii (C.
• 3.1.1.3. Đặc điểm bột phần trên mặt đất của loài Piper thomsonii (C.
• 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về thực vật của loài HVD-004-11
• 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài HVD-004-11
• 3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Piper hymenophyllum Miq.
• 3.1.2.3. Đặc điểm bột phần trên mặt đất của loài Piper hymenophyllum Miq.
• 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học
• 3.2.1. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của loài Piper thomsonii (C.
• 3.2.2. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Piper thomsonii (C.
• 3.2.3. Kết quả nhận dạng hợp chất phân lập được từ loài Piper thomsonii (C.
• 3.2.4. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của loài Piper hymenophyllum Miq.
• 3.2.5. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Piper hymenophyllum Miq.
• 3.2.6. Kết quả nhận dạng hợp chất phân lập được từ loài Piper hymenophyllum Miq.
• 3.3. Kết quả triển khai phương pháp và áp dụng để đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu
• 3.3.1. Triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 3.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu
• 3.3.3. Hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các mẫu cắn chiết xuất từ hai loài nghiên cứu
• 3.3.4. Hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu
• 3.4. Về đặc điểm thực vật
• 3.4.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của hai loài nghiên cứu
• 3.4.2. Đặc điểm vi học của hai loài nghiên cứu
• 3.5. Về thành phần hóa học
• 3.6. Về nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 3.6.1. Về triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
• 3.6.2. Về kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các mẫu thử được chiết xuất và phân lập từ hai loài nghiên cứu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đặc điểm thực vật chi Piper

Chi Piper, thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), bao gồm nhiều loài thực vật có giá trị dược liệu. Nghiên cứu này tập trung vào hai loài chính là Piper thomsonii và Piper hymenophyllum. Các loài này không chỉ có giá trị trong y học mà còn có nhiều ứng dụng trong đời sống hàng ngày. Việc tìm hiểu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của chúng sẽ giúp khai thác tiềm năng dược liệu của chi này.

1.1. Đặc điểm phân loại và phân bố của chi Piper

Chi Piper được phân loại theo nhiều hệ thống khác nhau. Theo Takhtajan (2009), chi này bao gồm khoảng 700 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, chi Piper có khoảng 5 loài chính, trong đó Piper nigrum và Piper betle là những loài phổ biến nhất.

1.2. Đặc điểm hình thái của hai loài Piper

Hai loài Piper thomsonii và Piper hymenophyllum có những đặc điểm hình thái riêng biệt. Piper thomsonii thường có lá lớn, trong khi Piper hymenophyllum có lá nhỏ hơn và mọc thành cụm. Những đặc điểm này giúp phân biệt chúng trong tự nhiên.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) là một thách thức lớn trong lĩnh vực dược học. AChE có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh nồng độ acetylcholin trong não, ảnh hưởng đến nhiều chức năng thần kinh. Việc tìm kiếm các chất ức chế AChE từ thực vật như chi Piper có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh Alzheimer.

2.1. Tác động của enzym Acetylcholinesterase trong y học

AChE là enzym chịu trách nhiệm phân hủy acetylcholin, một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng. Sự mất cân bằng của enzym này có thể dẫn đến các rối loạn thần kinh, đặc biệt là bệnh Alzheimer. Do đó, việc tìm kiếm các chất ức chế AChE từ thiên nhiên là rất cần thiết.

2.2. Thách thức trong việc sàng lọc hoạt tính ức chế enzym

Quá trình sàng lọc hoạt tính ức chế AChE thường gặp nhiều khó khăn. Các phương pháp thử nghiệm in vitro cần được tối ưu hóa để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy. Việc lựa chọn mẫu và phương pháp thử nghiệm phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

III. Phương pháp nghiên cứu và giải pháp chính trong đánh giá hoạt tính

Nghiên cứu này áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá hoạt tính ức chế AChE của hai loài Piper. Các phương pháp này bao gồm phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và các phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất. Việc áp dụng các phương pháp này giúp xác định được hoạt tính ức chế của các mẫu chiết xuất.

3.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Phương pháp Ellman là một trong những phương pháp phổ biến nhất để đánh giá hoạt tính ức chế AChE. Phương pháp này cho phép đo lường nồng độ acetylcholin còn lại sau khi phản ứng với enzym, từ đó xác định được hoạt tính ức chế của mẫu thử.

3.2. Phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất

Sắc ký là một kỹ thuật quan trọng trong việc phân lập các hợp chất từ dịch chiết thực vật. Các phương pháp sắc ký như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) giúp tách biệt và xác định các hợp chất có hoạt tính ức chế AChE trong hai loài Piper.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của hai loài Piper

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả hai loài Piper thomsonii và Piper hymenophyllum đều có hoạt tính ức chế AChE đáng kể. Các hợp chất phân lập từ hai loài này có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các rối loạn thần kinh. Việc khai thác các hợp chất này có thể dẫn đến phát triển các loại thuốc mới hiệu quả hơn.

4.1. Hoạt tính ức chế AChE của dịch chiết từ hai loài

Dịch chiết từ Piper thomsonii và Piper hymenophyllum cho thấy hoạt tính ức chế AChE cao. Các mẫu thử này đã được kiểm nghiệm và cho kết quả tích cực trong việc giảm nồng độ acetylcholin trong các thí nghiệm in vitro.

4.2. Ứng dụng trong phát triển thuốc điều trị bệnh Alzheimer

Các hợp chất từ hai loài Piper có thể được nghiên cứu thêm để phát triển thành thuốc điều trị bệnh Alzheimer. Việc sử dụng các hợp chất tự nhiên này không chỉ an toàn mà còn có thể mang lại hiệu quả cao trong việc cải thiện chức năng thần kinh.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hai loài Piper thomsonii và Piper hymenophyllum đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Việc tiếp tục nghiên cứu và khai thác các hợp chất từ chi Piper sẽ mở ra nhiều cơ hội trong lĩnh vực y học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu dược liệu từ thiên nhiên

Nghiên cứu dược liệu từ thiên nhiên không chỉ giúp phát hiện các hợp chất mới mà còn góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật. Việc khai thác hợp lý các loài thực vật như Piper sẽ mang lại lợi ích lớn cho y học.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc

Hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc từ các hợp chất tự nhiên sẽ giúp tạo ra các sản phẩm an toàn và hiệu quả hơn. Việc kết hợp giữa nghiên cứu khoa học và thực tiễn sẽ là chìa khóa cho sự thành công trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ dược học của tác giả Hoàng Việt Dũng mang tên: "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C. DC.) và Piper hymenophyllum Miq., họ Hồ tiêu (Piperaceae)", thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của TS. Đỗ Quyên và PGS. Nguyễn Minh Chính, chuyên ngành Dược học cổ truyền (Mã số: 62.06), bảo vệ năm 2014.

Nghiên cứu phát triển thuốc mới bắt đầu từ giai đoạn nghiên cứu sàng lọc hoạt tính trên số lượng lớn các mẫu dược liệu và hợp chất tự nhiên. Trong các phương pháp thử nghiệm, thử nghiệm in vitro được ưu tiên áp dụng nhờ khả năng triển khai đồng thời nhiều mẫu, tiêu tốn ít nguyên liệu, thời gian thực hiện nhanh và chi phí hợp lý. Điều kiện tiên quyết để xây dựng hệ thống thử nghiệm in vitro là phải xác định được đích phân tử của bệnh lý (thụ thể, enzym, protein).

Năm 1982, Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer, từ đó enzym acetylcholinesterase (AChE) được xác định là một đích phân tử quan trọng trong cơ chế bệnh sinh và điều trị hội chứng suy giảm trí nhớ này. Trên thực tế lâm sàng, hai trong số năm loại thuốc được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh Alzheimer là Galanthamin và Huperzin A đều là các chất ức chế enzym AChE có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật.

Chi Hồ tiêu (Piper L.) là một chi lớn thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) với hơn 1.000 loài trên thế giới và 46 loài đã được ghi nhận tại Việt Nam. Các nghiên cứu sàng lọc quốc tế và bước đầu trong nước cho thấy dịch chiết của một số loài thuộc chi Piper L. và hoạt chất piperin thể hiện tác dụng ức chế AChE in vitro, ex vivo cũng như cải thiện trí nhớ trên mô hình động vật thực nghiệm in vivo. Tuy nhiên, hai loài Piper thomsonii (C. DC.) và Piper hymenophyllum Miq. phân bố tại Việt Nam vẫn chưa được khảo sát đầy đủ và có hệ thống về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cũng như hoạt tính ức chế AChE.

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học của 2 loài nghiên cứu (Piper thomsonii và Piper hymenophyllum).
2. Xác định được thành phần hóa học của 2 loài nghiên cứu.
3. Triển khai được phương pháp và áp dụng để đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro của dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn và hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là mẫu thực vật của 2 loài thuộc chi Piper L., thu hái tại Việt Nam và được gắn mã hiệu mẫu nghiên cứu gồm HVD-002-11 (Piper thomsonii (C. DC.)) và HVD-004-11 (Piper hymenophyllum Miq.). Phạm vi nghiên cứu bao gồm: khảo sát đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu vi phẫu thân lá, đặc điểm bột dược liệu; chiết xuất phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần; phân lập các hợp chất tinh khiết bằng các kỹ thuật sắc ký; xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ hiện đại (MS, 1D-NMR, 2D-NMR); triển khai, tối ưu hóa quy trình thử nghiệm đo quang đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE in vitro và xác định hoạt tính của các phân đoạn dịch chiết cùng các hợp chất phân lập.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Về phân loại học, chi Piper L. thuộc họ Piperaceae, bộ Piperales, phân lớp Magnoliidae, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta theo các hệ thống phân loại của Hutchinson (1974), Cronquist A. (1988) và Takhtajan (2009). Sự phân chia nội bộ họ Piperaceae từng có nhiều quan điểm: Miquel (1843-1844) chia làm 2 phân nhóm (Piperae gồm 15 chi, 304 loài và Peperomeae gồm 5 chi, 209 loài); De Candolle (1869) xác định gồm 2 chi Piper và Peperomia với trên 1.000 loài; Rendle (1956) ghi nhận Piper (>700 loài) và Peperomia (>600 loài) cùng 7 chi nhỏ; Takhtajan (2009) ghi nhận họ có 7 chi. Tại Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào, họ Hồ tiêu có 5 chi (Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, Lepianthes), riêng chi Piper L. có 46 loài.

Về mặt di truyền học thực vật, Joseph Jose và cộng sự (1985) khi nghiên cứu 8 loài chi Piper L. ghi nhận số lượng nhiễm sắc thể thay đổi từ $2n = 24$ đến $195$, số nhiễm sắc thể cơ bản thường là bội số của 13, kích thước nhiễm sắc thể dao động từ $0,56 - 2,41,\mu\text{m}$. Rosabelle Samuel (1987) nghiên cứu trên 11 loài cũng xác nhận số lượng cơ bản $n = 13$, kích thước nhiễm sắc thể ở dạng nhị bội ($2n$) từ $1,0 - 2,8,\mu\text{m}$ và dạng tứ bội ($4n$) từ $0,6 - 1,2,\mu\text{m}$. Một số tài liệu khác báo cáo số lượng cơ bản dao động trong khoảng $n = 8 - 12$.

STT	Quốc gia / Vùng lãnh thổ	Số lượng loài ghi nhận	Tài liệu tham khảo
1	Brazil	330	[49]
2	Vùng Amazon	300	[67]
3	Vùng Andes	300	[67]
4	Trung Mỹ	200	[67]
5	Rừng Đại Tây Dương	150	[67]
6	Ecuador	100	[119]
7	Trung Quốc	60	[37]
8	Ấn Độ	45	[60]
9	Honduras	45	[28]
10	Việt Nam	46	[5], [16]
11	Thái Lan	38	[31]
12	Hồng Kông	6	[144]
13	Nhiệt đới Châu Phi	15	[67]

Về thành phần hóa học, tổng kết các công trình từ năm 1907 đến năm 1996 trên thế giới cho thấy có 85 loài trên tổng số hơn 1.000 loài thuộc chi Piper L. được khảo sát, phân lập được 555 hợp chất. Nhóm alcaloid chiếm số lượng lớn nhất với 145 hợp chất (tính đến thời điểm thực hiện luận án đã có thêm khoảng 135 alcaloid mới được công bố, nâng tổng số lên 280 alcaloid phân lập từ 61 loài).

Các nhóm cấu trúc chính của alcaloid trong chi Piper L. bao gồm:

• Khung piperidin: 41 hợp chất monomer (27 dẫn xuất nhân thơm, 14 dạng mạch thẳng) và 24 dimer (điển hình như piperin, N-formylpiperidin).
• Khung $\Delta^3$-piperidin-2-on: 15 hợp chất (14 monomer, 1 dimer, ví dụ piplartin).
• Khung pyrrolidin: 53 monomer và 5 dimer (ví dụ piperamin, trichonin, hexadecanoylpyrrolidin).
• Khung aporphin: 8 hợp chất (cepharadion A, cepharadion B, norcepharadion B).
• Khung piperolactam: 16 hợp chất (cepharanon B, piperolactam A, piperolactam B).
• Alcaloid không có dị vòng nitơ: 87 monomer và 6 dimer (nhóm thế mạch thẳng từ 2 đến 32 carbon, nhóm thế isobutyl, isopentyl).
• Các nhóm hợp chất khác: Tinh dầu (112 cấu tử từ 30 loài, gồm 53 monoterpen, 57 sesquiterpen, 2 diterpen); flavonoid (61 hợp chất thuộc các phân nhóm chalcon, dihydrochalcon, flavanon, flavon); alkanpolyenylbenzen (90 hợp chất thuộc 4 phân nhóm: allylbenzen, prop-1-en-1-yl-benzen, polyprenylbenzen và alkenylbenzen khác); lignan (57 hợp chất, điển hình là sesamin); cùng neolignan, kawapyron, sterol.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu hóa học trước đó tập trung chủ yếu vào tinh dầu và một số loài phổ biến: Đậu Xuân Đức và Hoàng Văn Lựu; Đỗ Đình Rãng và Nguyễn Thúy Hằng (nghiên cứu tinh dầu và các chất sitosterol, poriferasterol); Lê Thanh, Trần Đình Thắng và Nguyễn Xuân Dũng (2007) phân lập từ dịch chiết methanol của loài Piper 12 alcaloid mới cùng 29 alcaloid đã biết; Phạm Hoàng Ngọc...

Về mặt tác dụng sinh học, tài liệu ghi nhận các công trình về:

• Độc tính tế bào trên các dòng HeLa, KB, HepG2.
• Tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro (piperlotin E với $\text{IC}{50} = 11,5,\mu\text{g/ml}$, 1-trans-cinnamoylpyrrolidin với $\text{IC}{50} = 7,3,\mu\text{g/ml}$ của Lê Thanh và cộng sự 2007).
• Kháng khuẩn (Reddy Venkat S. và cộng sự 2001; Carola Valdivia và cộng sự 2008).
• Kháng nấm trên Cladosporium cladosporioides, Candida albicans, Cryptococcus neoformans.
• Tác dụng ức chế AChE: Ingkaninan K. và cộng sự chứng minh dịch chiết methanol hạt và thân Piper ức chế 58% và 65%; Adewusi E. và cộng sự xác định dịch chiết EtOAc rễ Piper có $\text{IC}_{50} = 0,041,\text{mg/ml}$; Đỗ Quyên và cộng sự xác định tỷ lệ ức chế của 2 loài Piper tại Việt Nam đạt 44,61% và 33,38% ở nồng độ $100,\mu\text{g/ml}$.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là thực hiện nghiên cứu toàn diện từ hình thái, vi học đến phân lập thành phần hóa học và định lượng hoạt tính ức chế AChE in vitro của hai loài Piper thomsonii (C. DC.) và Piper hymenophyllum Miq., vốn chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý thử nghiệm

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết cholinergic trong bệnh suy giảm trí nhớ Alzheimer (Whitehouse, 1982). Sự thoái hóa của các tế bào thần kinh cholinergic dẫn đến suy giảm nồng độ chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin (ACh) tại khe synap. Enzym acetylcholinesterase (AChE) có chức năng thủy phân ACh thành cholin và acid acetic. Việc ức chế enzym này tại các vị trí hoạt động trong hẻm xúc tác (catalytic gorge) giúp duy trì nồng độ ACh, cải thiện dẫn truyền thần kinh.

Phương pháp sàng lọc in vitro được luận án triển khai dựa trên nguyên lý phản ứng đo quang của Ellman:

1. Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị enzym AChE thủy phân tạo ra thiocholin và acetat.
2. Thiocholin sinh ra phản ứng với thuốc thử DTNB (acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic) tạo thành hợp chất có màu vàng là acid 5-thio-2-nitrobenzoic (TNB).
3. Đo mật độ quang (Absorbance - A) ở bước sóng xác định theo thời gian để đánh giá tốc độ phản ứng và tính toán phần trăm ức chế ($I%$) cũng như nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym ($\text{IC}_{50}$).

Bên cạnh đó, luận án điểm lại phương pháp phát hiện trên sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử Ellman hoặc muối Fast Blue B (tạo phức màu diazo với $\alpha$-naphthol sinh ra từ phản ứng thủy phân $\alpha$-naphthyl acetat).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp thực nghiệm thực vật học, hóa học tự nhiên và sinh học phân tử in vitro:

• Phương pháp phân tích thực vật:

  • Hình thái học: Quan sát, đo đạc kích thước các cơ quan sinh dưỡng (thân, cành, cuống lá, phiến lá, gân lá) và cơ quan sinh sản (cụm hoa, hoa trần, lá bắc, bộ nhị, bộ nhụy, quả, hạt). So sánh với các bản mô tả phân loại thực vật để xác định tên khoa học.
  • Vi học: Cắt lát vi phẫu thân và lá bằng phương pháp cắt tay, nhuộm kép bằng lục iod và đỏ carmin; soi và chụp ảnh cấu trúc giải phẫu dưới kính hiển vi. Nghiền mẫu khô phần trên mặt đất thành bột, soi kính hiển vi để xác định các đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu (mảnh biểu bì, lỗ khí, lông che chở, tế bào tiết, mảnh mạch, mô mềm).

• Phương pháp chiết xuất và phân lập:

  • Chiết xuất: Chiết ngấm kiệt hoặc chiết hồi lưu bột dược liệu phần trên mặt đất bằng dung môi methanol (MeOH), thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được cắn toàn phần (PTM, PHM). Phân tán cắn toàn phần vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexan (PTH, PHH), cloroform (PTC, PHC), ethyl acetat (PTE, PHE), $n$-butanol (PTB, PHB), thu được các cắn phân đoạn tương ứng và phần nước dư (PTN, PHN).
  • Phân lập: Sử dụng sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) với các pha tĩnh silica gel pha thường ($40 - 63,\mu\text{m}$, $63 - 200,\mu\text{m}$) và pha đảo ODS ($30 - 50,\mu\text{m}$); sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC); sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC); sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative HPLC). Quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện màu bằng đèn tử ngoại (254 nm, 365 nm) và phun thuốc thử hiện màu thích hợp.

• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:

  • Phổ khối lượng: Khảo sát khối lượng phân tử và mảnh ion bằng phổ khối ion hóa điện tử (EI-MS), ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS), bắn phá nguyên tử nhanh (FAB-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-MS).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Ghi phổ $^1\text{H-NMR}$ ($500,\text{MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125,\text{MHz}$) và DEPT; phổ tương tác 2 chiều gồm COSY ($^1\text{H}-^1\text{H}$ correlation), HSQC ($^1\text{H}-^{13}\text{C}$ one-bond correlation) và HMBC ($^1\text{H}-^{13}\text{C}$ multiple-bond correlation) trên máy Bruker AVANCE. Độ dịch chuyển hóa học ($\delta$) tính bằng ppm, hằng số tương tác ($J$) tính bằng Hz.

• Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro:

  • Khảo sát tối ưu hóa điều kiện phản ứng: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ATCI, nồng độ thuốc thử DTNB, hoạt độ của enzym AChE và nồng độ dung môi hòa tan mẫu DMSO trong hỗn hợp phản ứng đến độ hấp thụ quang và độ tuyến tính của phản ứng.
  • Đo độ hấp thụ quang trên máy quang phổ đo đĩa vi thể đa giếng (Microplate Reader) ở bước sóng thích hợp theo thời gian thực (kinetics).
  • Xử lý số liệu: Tính toán độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD), phần trăm ức chế ($I%$) và xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ bằng phương pháp hồi quy tuyến tính/phi tuyến.

• Địa điểm thực hiện: Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội; Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y; Viện Hóa sinh biển, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Dược, Đại học Catholic, Daegu, Hàn Quốc.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu chuyên ngành gồm 4 mảng nội dung chính:

• Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Piper L.: Chi có trên 1.000 loài trên thế giới, tập trung đa dạng nhất ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ (Amazon 300 loài, Andes 300 loài, Trung Mỹ 200 loài), Châu Á có khoảng 300 loài, Châu Phi có khoảng 15 loài. Tại Việt Nam ghi nhận 46 loài, phân bố nhiều tại Tây Nguyên (>15 loài), Vườn quốc gia Cúc Phương, Vườn quốc gia Ba Vì, độ cao phổ biến từ $150 - 1.500,\text{m}$. Các đặc điểm hình thái về dạng sống (dây leo, bụi), lá đơn mọc cách/đối, cụm hoa bông, hoa trần đơn tính hoặc lưỡng tính, quả hạch một hạt cùng đặc điểm số lượng nhiễm sắc thể ($n=13$) được tổng hợp chi tiết.
• Thành phần hóa học của chi Piper L.: Tổng thuật chi tiết 280 alcaloid (chia thành 6 nhóm cấu trúc: piperidin, $\Delta^3$-piperidin-2-on, pyrrolidin, aporphin, piperolactam, không có dị vòng nitơ), 112 cấu tử tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, diterpen), 61 flavonoid (chalcon, dihydrochalcon, flavanon, flavon), 90 alkanpolyenylbenzen (allylbenzen, prop-1-en-1-yl-benzen, polyprenylbenzen), 57 lignan cùng các hợp chất khác. Điểm lại các nghiên cứu hóa học của tác giả trong nước.
• Công dụng, tác dụng sinh học và độc tính: Tổng hợp các công dụng chữa bệnh dân gian trên thế giới (bệnh tiêu hóa, giảm đau, chống viêm, hạ sốt) và tại Việt Nam (lá lốt, trầu không, tất bạt, hồ tiêu); các chế phẩm thương mại kết hợp piperin và curcumin (tăng sinh khả dụng 20 lần theo Shoba et al., 1997), Eupolin, Armorex; các tác dụng dược lý hiện đại (độc tính tế bào, chống kết tập tiểu cầu, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế AChE); các dữ liệu về độc tính cấp ($\text{LD}_{50}$) và độc tính bán trường diễn trên chuột cống, chuột nhắt, thỏ, chó.
• Tổng quan về thử nghiệm ức chế AChE in vitro: Trình bày chi tiết cấu trúc khe hoạt động của AChE, cơ chế xúc tác, so sánh phương pháp đo quang dùng thuốc thử Ellman và phương pháp hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Fast Blue B.

Chương 2. Nguyên vật liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết:

• Nguyên vật liệu: Mẫu nghiên cứu HVD-002-11 (Piper thomsonii (C. DC.)) và HVD-004-11 (Piper hymenophyllum Miq.).
• Hóa chất, dung môi, thiết bị: Các dung môi hữu cơ tinh khiết dùng cho chiết xuất và sắc ký (MeOH, $n$-hexan, $\text{CHCl}_3$, EtOAc, BuOH, DMSO); các chất chuẩn và sinh phẩm thử hoạt tính (AChE, ATCI, DTNB, physostigmin); hệ thống máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AVANCE, máy đo quang phổ đĩa microplate reader, máy sắc ký lỏng MPLC, PHPLC.
• Quy trình phương pháp: Thiết lập các bảng khảo sát thông số thử nghiệm đo quang (Bảng 2.1: khảo sát nồng độ ATCI và DTNB; Bảng 2.2: khảo sát hoạt độ AChE; Bảng 2.3: khảo sát tỷ lệ DMSO). Sơ đồ hóa quy trình chiết ngấm kiệt, chiết phân đoạn lỏng - lỏng, quy trình sắc ký phân lập và công thức tính toán $I%$, $\text{IC}_{50}$.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

Kết quả nghiên cứu về thực vật

• Loài HVD-002-11 (Piper thomsonii (C. DC.)):
  • Hình thái: Dây leo bám, thân có rãnh dọc, đốt phình to; lá đơn mọc cách, phiến lá hình trứng đến hình mác, gốc lá hơi lệch, gân lá hình chân vịt - lông chim; cụm hoa bông mọc đối diện lá; lá bắc hình tròn/khiên; hoa trần đơn tính khác gốc; quả hạch nhỏ. Định danh tên khoa học là Piper thomsonii (C. DC.).
  • Vi phẫu: Vi phẫu thân có biểu bì phủ cutin, lớp hạ bì, mô dày, mô mềm vỏ chứa tế bào tiết tinh dầu; các bó libe-gỗ xếp thành vòng, có sợi trụ bì bao bọc; tủy ở giữa. Vi phẫu lá thể hiện biểu bì trên và dưới, hạ bì, mô giậu một lớp, mô khuyết, gân giữa lồi ở mặt dưới với các bó mạch dẫn kèm mô dày.
  • Đặc điểm bột: Bột có màu xanh xám/nâu nhạt, gồm mảnh biểu bì mang lỗ khí, tế bào tiết chứa giọt tinh dầu màu vàng, mảnh mô mềm, mảnh mạch vạch, mạch mạng và sợi.
• Loài HVD-004-11 (Piper hymenophyllum Miq.):
  • Hình thái: Cây bụi hoặc dây leo mọc bò/bám; cành non có lông tơ mịn; lá mỏng như màng (hymenophyllus), phiến lá hình elip-trứng thuôn, gốc lá hơi tròn hoặc hình tim nhẹ; gân lá nổi rõ ở mặt dưới; cụm hoa bông mảnh, dài. Định danh tên khoa học là Piper hymenophyllum Miq.
  • Vi phẫu và bột: Xác định rõ cấu trúc giải phẫu của biểu bì, mô dày, hệ thống dẫn libe-gỗ, tế bào tiết và mô mềm; bột phần trên mặt đất có các mảnh biểu bì mang lông che chở đơn bào/đa bào, tinh thể calci oxalat dạng hạt/cát, tế bào mô cứng, mạch dẫn.

Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

• Loài Piper thomsonii (C. DC.): Từ cắn phân đoạn $n$-hexan (PTH) và ethyl acetat (PTE), đã phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất ký hiệu từ PT1 đến PT6:
  • Hợp chất PT1: Phân lập từ cắn $n$-hexan, cấu trúc xác định qua phổ NMR (Bảng 3.1) và các tương tác HMBC, COSY (Hình 3.12), có cấu trúc liên quan đến dẫn xuất phenol/alkanpolyenylbenzen gibbilimbol B (PT1a).
  • Hợp chất PT2 đến PT6: Phân lập từ các phân đoạn tương ứng, cấu trúc xác định chi tiết qua bảng số liệu phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HMBC, COSY) từ Bảng 3.2 đến Bảng 3.6 và Hình 3.13 đến Hình 3.22.
• Loài Piper hymenophyllum Miq.: Từ cắn phân đoạn cloroform (PHC) và ethyl acetat (PHE), đã phân lập và xác định cấu trúc 8 hợp chất ký hiệu từ PH1 đến PH8:
  • Hợp chất PH1 và PH2: Xác định cấu trúc so sánh với hợp chất tham khảo PH1a, PH2a qua số liệu NMR (Bảng 3.7, Bảng 3.8; Hình 3.25 - 3.28).
  • Hợp chất PH3 đến PH8: Xác định đầy đủ công thức hóa học thông qua số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bảng 3.9 đến Bảng 3.14; Hình 3.29 đến Hình 3.37).

Kết quả triển khai phương pháp và đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro

• Chuẩn hóa điều kiện thử nghiệm:
  • Xác định nồng độ thích hợp của dung dịch cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB đảm bảo phản ứng đo quang tuyến tính và có độ hấp thụ quang tối ưu (Bảng 3.15).
  • Khảo sát hoạt độ của AChE: Chọn mức hoạt độ enzym thích hợp để vận tốc phản ứng tỷ lệ thuận với thời gian trong khoảng thời gian đo (Hình 3.38).
  • Khảo sát nồng độ dung môi DMSO: Xác định nồng độ DMSO tối đa trong hỗn hợp phản ứng mà không làm ức chế hoặc ảnh hưởng tiêu cực đến hoạt tính enzym nền (Bảng 3.16).
  • Thiết lập thành phần hỗn hợp phản ứng tiêu chuẩn và ban hành sơ đồ quy trình thử nghiệm hoàn chỉnh (Bảng 3.17, Hình 3.39).
• Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế AChE:
  • Trên các mẫu cắn chiết xuất: Khảo sát hoạt tính của các cắn phân đoạn PTM, PTH, PTC, PTE, PTB, PTN từ P. thomsonii (Bảng 3.18) và PHM, PHH, PHC, PHE, PHB, PHN từ P. hymenophyllum (Bảng 3.19). Các phân đoạn có độ phân cực trung bình như cloroform và ethyl acetat thể hiện tỷ lệ ức chế enzym cao hơn so với phân đoạn nước và $n$-butanol.
  • Trên các hợp chất tinh khiết: Khảo sát hoạt tính của toàn bộ 14 hợp chất tinh khiết (PT1-PT6 và PH1-PH8) (Bảng 3.20). Xác định được 3 hợp chất phân lập từ loài Piper hymenophyllum Miq. thể hiện hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro mạnh nhất (Bảng 4.3).

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung biện giải các phát hiện:

• Về đặc điểm thực vật: Đối chiếu các đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu vi phẫu của P. thomsonii và P. hymenophyllum với khóa phân loại chi Piper L. của các tác giả trong nước và quốc tế; chỉ ra các đặc điểm vi học đặc trưng có giá trị ứng dụng trong kiểm nghiệm phân biệt hai loài này với các loài khác trong chi.
• Về thành phần hóa học: Bàn luận về tính đa dạng cấu trúc của 14 hợp chất phân lập được (thuộc các nhóm alkanpolyenylbenzen, dẫn xuất phenol, alcaloid/amid, flavonoid/lignan); so sánh đặc điểm cấu trúc hóa học của các chất từ hai loài nghiên cứu với các hợp chất đã được công bố từ các loài Piper khác trên thế giới (như P. gibbilimbum, P. taiwanense, P. nigrum).
• Về phương pháp và hoạt tính ức chế AChE in vitro: Bàn luận về độ tin cậy của quy trình thử nghiệm chuẩn hóa; giải thích mối tương quan giữa nồng độ DMSO và độ ổn định của AChE; phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính ức chế AChE của 3 hợp chất có hoạt tính mạnh nhất phân lập từ loài Piper hymenophyllum Miq.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Về thực vật học: Đã cung cấp bộ dữ liệu khoa học hoàn chỉnh và chuẩn xác về đặc điểm hình thái học, cấu tạo vi phẫu thân, vi phẫu lá và đặc điểm bột dược liệu phần trên mặt đất của 2 loài Piper thomsonii (C. DC.) và Piper hymenophyllum Miq. thu hái tại Việt Nam. Các dữ liệu này cung cấp cơ sở phục vụ công tác giám định loài và kiểm nghiệm dược liệu.
2. Về hóa học: Đã chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất tinh khiết từ 2 loài nghiên cứu (gồm 6 hợp chất PT1 - PT6 từ loài Piper thomsonii và 8 hợp chất PH1 - PH8 từ loài Piper hymenophyllum).
3. Về hoạt tính sinh học: Đã triển khai, tối ưu hóa và áp dụng quy trình đo quang sử dụng thuốc thử Ellman trên hệ thống đĩa vi thể để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro; chứng minh các phân đoạn chiết và các hợp chất phân lập từ 2 loài có tác dụng ức chế AChE, trong đó phát hiện 3 hợp chất từ loài Piper hymenophyllum Miq. có hoạt tính ức chế mạnh nhất.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án mới dừng lại ở việc đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE trên mô hình in vitro. Chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật bị gây suy giảm trí nhớ thực nghiệm, cũng như chưa khảo sát độc tính cấp và bán trường diễn của các hợp chất tinh khiết phân lập được.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác phân tử (molecular docking, động học enzym) của 3 hợp chất có hoạt tính ức chế AChE mạnh từ loài Piper hymenophyllum Miq.
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính cải thiện trí nhớ trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo) và đánh giá các chỉ tiêu an toàn sinh học của các hợp chất tiềm năng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên ngành Dược học, Thực vật học: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp giám định hình thái - vi phẫu thực vật chi Piper; quy trình chiết xuất phân đoạn, sắc ký phân lập các hợp chất tự nhiên và kỹ thuật phân tích cấu trúc bằng phổ NMR 1D/2D, MS.
• Đối với lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc: Cung cấp quy trình thử nghiệm chuẩn hóa sàng lọc chất ức chế enzym AChE in vitro bằng phương pháp Ellman và bổ sung cơ sở dữ liệu về các hợp chất tự nhiên có tiềm năng định hướng nghiên cứu thuốc điều trị suy giảm trí nhớ và bệnh Alzheimer.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng giả thuyết nào về cơ chế bệnh sinh của Alzheimer để làm cơ sở cho nghiên cứu?
Luận án dựa trên giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer do Whitehouse đưa ra năm 1982. Theo giả thuyết này, sự suy giảm acetylcholin tại synap thần kinh là một nguyên nhân then chốt dẫn đến suy giảm nhận thức, do đó enzym acetylcholinesterase (AChE) được lựa chọn làm đích phân tử để sàng lọc chất ức chế.

2. Phương pháp thử nghiệm in vitro nào được luận án triển khai và chuẩn hóa?
Luận án triển khai và chuẩn hóa phương pháp đo quang phổ sử dụng thuốc thử Ellman (cơ chất acetylthiocholin iodid - ATCI và thuốc thử acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic - DTNB), thực hiện trên hệ thống máy đo quang đĩa vi thể (Microplate Reader).

3. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất tinh khiết từ hai loài nghiên cứu?
Tổng cộng có 14 hợp chất tinh khiết được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, bao gồm 6 hợp chất từ loài Piper thomsonii (ký hiệu PT1 đến PT6) và 8 hợp chất từ loài Piper hymenophyllum (ký hiệu PH1 đến PH8).

4. Loài nào trong hai loài nghiên cứu chứa các hợp chất có hoạt tính ức chế AChE in vitro mạnh nhất?
Loài Piper hymenophyllum Miq. chứa 3 hợp chất (trong số các chất PH1 đến PH8) thể hiện hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro mạnh nhất trong toàn bộ các hợp chất được khảo sát.

5. Chi Piper L. có bao nhiêu loài đã được ghi nhận tại Việt Nam và trên thế giới theo tổng quan tài liệu của luận án?
Theo các tài liệu tổng quan được luận án trích dẫn, chi Piper L. có trên 1.000 loài phân bố trên thế giới và tại Việt Nam đã ghi nhận có 46 loài thuộc chi này.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Hoàng Việt Dũng đã giải quyết một cách có hệ thống các mục tiêu nghiên cứu về thực vật học, hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Piper thomsonii (C. DC.) và Piper hymenophyllum Miq. thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) tại Việt Nam. Công trình đã xác định chính xác đặc điểm hình thái, giải phẫu vi phẫu và đặc điểm bột dược liệu; phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 14 hợp chất tự nhiên tinh khiết; đồng thời chuẩn hóa quy trình đo quang đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro. Kết quả phát hiện 3 hợp chất có hoạt tính ức chế AChE mạnh từ loài Piper hymenophyllum Miq. đóng góp thêm dữ liệu khoa học giá trị cho hướng nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên phục vụ hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu phát triển thuốc mới là một quá trình gian nan, tốn nhiều thời gian và chi phí bởi quá trình này phải trải qua nhiều giai đoạn. Mặc dù có nhiều hướng tiếp cận vấn đề nghiên cứu khác nhau nhưng quá trình nghiên cứu thường được bắt đầu với việc đánh giá hoạt tính của một lượng lớn các mẫu dược liệu hoặc hợp chất. Giai đoạn này mang tính định hướng và được gọi là giai đoạn nghiên cứu sàng lọc. Ở giai đoạn này, phương pháp thử in vitro được ưu tiên sử dụng bởi có ưu điểm là tiến hành đồng thời nhiều mẫu, lượng mẫu cần cho thử nghiệm ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp.

Mặc dù vậy, để có thể xây dựng được một phương pháp thử in vitro thì đích phân tử của bệnh (thụ thể, enzym, protein) phải được xác định. Với việc Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer vào năm 1982, AChE cũng được xác định là một trong những đích phân tử đối với bệnh này. Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng. Trong đó, phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro của dược liệu và hợp chất hiện nay.

Đây cũng là hướng nghiên cứu thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới bởi 2 trong số 5 thuốc được sử dụng phổ biến để điều trị bệnh Alzheimer hiện nay là Galanthamin và Huperzin A đều có tác dụng ức chế R R AChE và có nguồn gốc thực vật [61], [88]. Gần đây, kết quả nghiên cứu sàng lọc dược liệu cho thấy dịch chiết của một số loài thuộc chi Piper L. có tác dụng ức chế AChE in vitro [17], [63]. Trong một vài nghiên cứu khác, hợp 1 chất piperin (alcaloid phổ biến nhất có mặt trong chi Piper L.) thể hiện tác dụng ức chế AChE trên thử nghiệm ex vivo và tác dụng cải thiện trí nhớ trên thử nghiệm in vivo [38], [143].

Bên cạnh đó, tiềm năng nghiên cứu về chi Piper L. là khá lớn bởi có hơn 1.000 loài thuộc chi này phân bố trên thế giới. Chỉ riêng ở Việt Nam, số loài thuộc chi Piper L. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘‘Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C.

thomsonii và Piper hymenophyllum Miq., họ Hồ tiêu (Piperaceae)” với 3 mục tiêu sau: 1. Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học của 2 loài nghiên cứu. Xác định được thành phần hóa học của 2 loài nghiên cứu. Triển khai được phương pháp và áp dụng để đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro của dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn và hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu.

Tổng quan về chi Piper L. Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Piper L. Vị trí phân loại chi Piper L. Theo hệ thống phân loại thực vật của 3 tác giả gồm: Hutchinson (1974) [6], Cronquist A.

(1988) [40] và Takhtajan (2009) [26], chi Hồ tiêu (Piper L.) được xếp nằm trong họ Hồ tiêu (Piperaceae), thuộc bộ Hồ tiêu (Piperales), phân lớp Ngọc Lan (Magnoliidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta). Trên thế giới, họ Hồ tiêu (Piperaceae) có khoảng 2. Sự phân nhóm đối với các loài và chi của họ này cho đến nay vẫn chưa đạt được sự thống nhất. Tác giả Miquel (1843-1844) chia họ này thành hai nhóm là Piperae gồm 15 chi với 304 loài và Peperomeae có 5 chi với 209 loài.

De Candolle (1869) xác định họ này gồm 2 chi Piper và Peperomia với trên 1. Theo Rendle (1956), họ Hồ tiêu gồm 2 chi lớn là Piper với trên 700 loài và Peperomia với trên 600 loài, ngoài ra, còn thêm 7 chi nhỏ khác. Tuy nhiên, theo Lawrence (1957), họ này có 10 – 12 chi với 2 chi lớn là Piper và Peperomia. Theo phân loại của Takhtajan (2009), họ Piperaceae gồm có 7 chi [26].

Theo hai tác giả Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào, họ Hồ tiêu phân bố ở Việt Nam có 5 chi gồm: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, Lepianthes, trong đó, chi Piper L. Đặc điểm phân bố chi Piper L. trên thế giới và ở Việt Nam * Trên thế giới Chi Piper L. là một thành viên của gia đình họ Hồ tiêu (Piperaceae).

Với số lượng trên 1.000 loài, chi Piper L. là một trong những chi lớn nhất trong ngành thực vật hạt kín. Chi này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận 3 nhiệt đới, tại các vùng núi hoặc ở tầng cây thấp của các khu rừng ẩm nhưng cũng có thể mọc ở những khoảng đất trống, mọc ven sông suối, ven đường hoặc gần khu dân cư [31], [67]. Hầu hết các loài thuộc chi Piper L.

phân bố ở độ cao dưới 2.500 m, chỉ một số ít loài phân bố ở độ cao trên 3. Các loài thuộc chi này có thể phân bố mang tính đặc hữu vùng hoặc phân bố rộng rãi. Đặc điểm phân bố các loài thuộc chi Piper L. trên thế giới được thấy rõ hơn ở hình 1.

Trung Mỹ 200 loài Nhiệt đới Châu Á Amazon 300 loài 300 loài Andes 300 loài Nhiệt đới Châu Phi Nam Thái Bình Dương 15 loài 40 loài Rừng Đại Tây Dương 150 loài Hình 1. Đặc điểm phân bố các loài thuộc chi Piper L. trên thế giới [67] Bảng 1. Đặc điểm phân bố các loài thuộc chi Piper L.

ở một số nước trên thế giới STT Phân bố Số lượng loài TLTK 1 Ấn Độ 45 [60] 2 Brazil 330 [49] 3 Ecuador 100 [119] 4 Honduras 45 [28] 5 Hồng Kông 6 [144] 6 Thái Lan 38 [31] 7 Trung Quốc 60 [37] Hình 1.1 cho thấy khu vực nhiệt đới Châu Mỹ (gồm Trung và Nam Mỹ) có sự phân bố đa dạng nhất của các loài thuộc chi Piper L. và tập trung chủ yếu ở một số trung tâm đa dạng sinh học như: vùng rừng nhiệt đới Amazon (300 loài), vùng núi Andes (200 loài), khu vực Trung Mỹ (200 loài). Đứng thứ hai về sự đa dạng loài thuộc chi Piper L. trên thế giới là khu vực Châu Á với số lượng khoảng 300 4 loài và nơi có ít loài Piper L.

phân bố nhất là vùng nhiệt đới Châu Phi với chỉ khoảng 15 loài. * Ở Việt Nam Theo hai tác giả Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào, ở nước ta có 46 loài thuộc chi Piper L., trong đó, có hai loài phân bố rộng khắp cả nước gồm: P. (lá lốt) và một loài được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam là P. Tây Nguyên là vùng có nhiều loài thuộc chi Piper L.

phân bố nhất với trên 15 loài. Một số vùng khác cũng thấy có sự xuất hiện của khá nhiều loài thuộc chi này là Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Vườn quốc gia Ba Vì (Hà Nội), đây cũng chính là hai trong số những trung tâm đa dạng sinh học của nước ta. Các loài thuộc chi Piper L. ở nước ta thường mọc trong rừng ẩm ở độ cao từ 150 – 1.500 m, thường gặp ở độ cao 600 – 1.000 m, cá biệt có loài gặp ở độ cao trên 1.

Một số ít loài phân bố ở gần khu vực dân cư sinh sống, ven rừng, ven đường [5], [16]. Đặc điểm thực vật chi Piper L. - Dạng sống: cây bụi với những nhánh thẳng đứng hoặc trải rộng, cây leo với rễ mọc ở đốt, bám vào thân cây khác; đôi khi có dạng thân thảo bò trên mặt đất hoặc sống bì sinh; hiếm khi có dạng cây gỗ nhỏ và thường có mùi [5], [135]. - Lá: đơn, mép nguyên; mọc đối hoặc mọc cách; có thể có hoặc không có lá kèm (rụng sớm để lại sẹo ở mấu khá rõ).

Lá rất khác nhau về hình dạng và kích thước giữa các loài. Lá có các dạng: hình mác, hình trứng, hình tim, hình elip. Trên cùng một cây có thể có nhiều hình dạng lá khác nhau với đặc điểm lá già thường to và nổi bật hơn so với những lá còn lại. Phiến lá có thể mỏng hoặc dày; nhẵn bóng, nhăn nheo hoặc thô ráp; có thể có lông.

Lông che chở mầu nâu hoặc trắng; có thể đơn bào hoặc đa bào; bao phủ bề mặt lá và/hoặc toàn thân cây. Gốc lá cân đối hoặc lệch; dạng hình tròn hoặc hình tim. Cuống lá ngắn hoặc dài khoảng vài centimet. Gân lá thường tạo thành các cặp 5 xuất phát từ một số điểm như: gốc lá, điểm sát gốc lá, điểm giữa hoặc điểm phía trên của gân giữa lá.

Một số lá có hệ gân thứ cấp chạy dọc theo gân giữa, có dạng đường cong từ gốc đến đỉnh của lá, có hình chân vịt hoặc có một phần xẻ lông chim [135]. - Hoa: cụm hoa dạng bông, mọc đối diện với lá hoặc ở nách lá; hiếm khi mọc ở đỉnh cành và cũng hiếm khi tạo thành cụm gồm nhiều bông mọc ở nách lá. Cụm hoa có dạng vươn thẳng hoặc uốn cong nhẹ và có thể bị rủ xuống khi chín. Hoa trần, thường đơn tính (đa số khác gốc, ít khi cùng gốc) hoặc lưỡng tính, không có cuống.

Hoa có thể có màu hồng, màu hạt dẻ, màu xanh xám, màu vàng xanh, màu trắng đục… Lá bắc nhỏ; mọc đối diện với hoa, đôi khi dính với trục cụm hoa; hình khiên, hình tam giác hoặc hình tròn; thường nhẵn hoặc có lông mịn. Bộ nhị 2-6, chỉ nhị ngắn; bao phấn 2, 2-4 thùy. Bộ nhụy có bầu nhụy rời hoặc đôi khi ôm lấy trục, 1 ô, 1 noãn; núm nhụy 2-5 [134], [135]. - Quả: loại quả hạch, có hoặc không có cuống; dạng hình trứng, hình cầu, hình trứng ngược hoặc có mặt cắt hình tam giác, hiếm khi hình bầu dục; khi chín thường có màu đỏ hoặc vàng.

Quả thường nhẵn hoặc đôi khi có lông tơ; mỗi quả có 1 hạt. Hạt gần hình cầu, vỏ hạt mỏng; phôi nhỏ, ngoại nhũ dạng bột và cứng [135], [136]. - Nhiễm sắc thể: kết quả nghiên cứu của tác giả Joseph Jose và cộng sự (1985) cho thấy số lượng nhiễm sắc thể (NST) của 8 loài thuộc chi Piper L. nghiên cứu thay đổi từ 2n = 24 đến 195.

Theo nhóm tác giả này, số NST của các loài thuộc chi Piper L. nghiên cứu thường là bội số của 13, trừ loài P. Kích thước NST của các loài nghiên cứu nằm trong khoảng 0,56 – 2,41 μm, riêng kích thước NST của loài P. Nhóm tác giả cũng đưa ra nhận định rằng thể đa bội có thể là yếu tố quan trọng của quá trình tiến hóa [70].