Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên tập trung giải quyết bài toán khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài dược liệu trong y học cổ truyền Việt Nam: cây ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl., họ Dó đất - Balanophoraceae) và rễ cây vú bò (Ficus hirta Vahl., họ Dâu tằm - Moraceae).
Theo thống kê của Viện Dược liệu Việt Nam (2001–2005), Việt Nam sở hữu khoảng 3.950 loài thực vật bậc cao được sử dụng làm thuốc trong tổng số 10.500 loài đã ghi nhận. Cả hai loài ngọc cẩu và vú bò đều là những vị thuốc dân gian được sử dụng để bồi bổ sức khỏe, điều trị đau nhức xương khớp, bệnh lý tiêu hóa, hậu sản và suy giảm sinh lý. Tuy nhiên, các bằng chứng khoa học thực nghiệm về thành phần hóa học cụ thể cũng như cơ chế tác dụng sinh học của hai loài này tại Việt Nam còn hạn chế. Đặc biệt, loài Ficus hirta Vahl. chưa từng được công bố nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong nước trước thời điểm thực hiện luận án. Do đó, việc nghiên cứu hóa học kết hợp sàng lọc hoạt tính sinh học có ý nghĩa bổ sung cơ sở khoa học cho việc bảo tồn, phát triển nguồn tài nguyên thực vật và định hướng ứng dụng dược dụng.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung chính:
- Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài: loài ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) và loài vú bò (Ficus hirta Vahl.).
- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (2D-NMR: HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY).
- Đánh giá một số hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm (ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7) và hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào tủy xương cấp tính (OCI-AML) của các phân đoạn cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng thực vật: Mẫu toàn cây ngọc cẩu cái (Balanophora laxiflora Hemsl.) thu hái vào tháng 10 năm 2014 tại huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang; mẫu rễ cây vú bò (Ficus hirta Vahl.) thu hái vào tháng 10 năm 2014 tại huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang. Mẫu thực vật được giám định tên khoa học bởi TS. Đỗ Hữu Thư (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) và lưu trữ tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phạm vi thực nghiệm: Phân lập hóa học, đo phổ cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính ức chế NO, gây độc tế bào in vitro (trên các dòng RD, Hep-G2) được thực hiện tại Viện Hóa học và Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; thử nghiệm ức chế dòng tế bào ung thư tủy xương OCI-AML được thực hiện phối hợp tại Đại học Y Perugia (Cộng hòa Italy).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Nghiên cứu về loài ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.)
Chi Balanophora gồm khoảng 120 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương. Ở Việt Nam ghi nhận khoảng 6 loài, trong đó có B. abbreviata, B. fungosa, B. laxiflora và loài đặc hữu B. cucphuongensis. Về mặt hóa học, chi này có các nhóm chất chính gồm tannin thủy phân (đặc biệt là ellagitannin mang khung galloyl, caffeoyl, hexahydroxydiphenoyl - HHDP liên kết glucosid), phenylpropanoid, lignan, flavonoid và terpenoid.
Tại Việt Nam, các công bố trước đây về loài B. laxiflora gồm:
- Cầm Thị Ính và cộng sự (2014): Phân lập được 2 hợp chất pinoresinol và daucosterol.
- Nguyễn Thanh Hương và cộng sự (2015, 2016): Khảo sát tác dụng androgen và ảnh hưởng của dịch chiết nước lên hành vi tình dục của chuột cống đực thực nghiệm ở các mức liều 0,28 g/kg, 1,4 g/kg và 2,8 g/kg trọng lượng cơ thể.
- Trần Thị Hằng và cộng sự (2016): Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, ức chế enzyme tyrosinase và gây độc tế bào ung thư phổi Lu-1 của các dịch chiết phân đoạn từ B. laxiflora.
| Phân đoạn dịch chiết (B. laxiflora) |
Chống oxy hóa DPPH $IC_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$) |
Ức chế tyrosinase $IC_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$) |
Độc tế bào Lu-1 $IC_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$) |
| Dịch chiết n-Hexane |
75,89 |
31,81 |
3,45 |
| Dịch chiết EtOAc |
22,81 |
7,90 |
> 128 |
| Dịch chiết n-BuOH |
60,71 |
15,12 |
> 128 |
| Dịch chiết Nước |
2037,40 |
128,42 |
> 128 |
| Đối chứng (Acid ascorbic / Kojic acid / Ellipticine) |
18,53 |
2,60 |
0,31 |
Trên thế giới, các tác giả quốc tế đã xác định hơn 50 hợp chất từ B. laxiflora:
- Kai-Chung Cheng và cộng sự (2008): Cao EtOAc và n-BuOH thể hiện khả năng quét gốc tự do DPPH với $IC_{50}$ lần lượt là 5,6 $\mu\text{g/ml}$ và 5,7 $\mu\text{g/ml}$; quét gốc superoxide với $IC_{50}$ là 4,3 $\mu\text{g/ml}$ và 2,5 $\mu\text{g/ml}$ (mạnh hơn chất đối chứng (+)-catechin có $IC_{50} = 11,7\ \mu\text{g/ml}$).
- Gai-Mei She và cộng sự (2009): Phân lập 19 hợp chất gồm các dẫn xuất tannin thủy phân, lignan và acid phenolic; xác định nhóm tannin thủy phân có hoạt tính diệt gốc DPPH vượt trội ($SC_{50}$ từ 4,2 đến 10,4 $\mu\text{M}$).
- Shang-Tse Ho và cộng sự (2010, 2012): Xác định cây ngọc cẩu đực có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn cây cái; các chất 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-HHDP-$\beta$-D-glucopyranose và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-HHDP-$\beta$-D-glucopyranose có giá trị $IC_{50}$ khử DPPH lần lượt là 2,7 $\mu\text{g/ml}$ và 3,2 $\mu\text{g/ml}$; cao chiết EtOAc có khả năng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình chuột thực nghiệm.
- Wen Fei Chiou và cộng sự (2011): Đánh giá hoạt tính kháng viêm qua ức chế sản sinh NO, chứng minh hợp chất isolariciresinol ($IC_{50} = 0,81\ \mu\text{g/ml}$) và methyl caffeate ($IC_{50} = 7,29\ \mu\text{g/ml}$) có hoạt lực cao hơn chất đối chứng aminoguanidine (AMG, $IC_{50} = 20,94\ \mu\text{g/ml}$).
Nghiên cứu về chi Sung (Ficus) và loài vú bò (Ficus hirta Vahl.)
Chi Ficus (họ Moraceae) có hơn 950 loài trên thế giới; tại Việt Nam có khoảng 100–200 loài (theo Nguyễn Tiến Bân). Các nhóm hoạt chất phổ biến trong chi gồm alkaloid phenanthroindolizidine (như ficuseptine, tylophorine), coumarin và furocoumarin (như umbelliferon, bergapten, psoralen), flavonoid glycoside, sterol và triterpenoid khung oleanane, ursane, lupane.
- Các nghiên cứu quốc tế trên Ficus hirta: Chunpeng Wan và cộng sự (2016, 2017) phân lập các hợp chất kháng nấm và 11 hợp chất từ quả; Ji Ya và cộng sự (2017), Jun Cheng và cộng sự phân lập các hợp chất phenolic, pyranocoumarin và flavanone từ rễ và thân cây F. hirta.
- Các nghiên cứu trong nước trên chi Ficus: Nhóm tác giả Viện Hóa học (1998, 2002) và Nguyễn Mạnh Cường (2003) phân lập verrucarin L acetate từ F. fistulosa có hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum ($IC_{50} < 1\ \mu\text{g/ml}$); Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh và cộng sự (2011, 2012) phân lập C-glycosylflavone từ F. pumila và các hợp chất kích thích tiết insulin từ F. drupacea; Nguyễn Xuân Cường và cộng sự phân lập 50 hợp chất từ F. elastica, F. drupacea và F. microcarpa.
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết
Mặc dù Balanophora laxiflora đã có một số nghiên cứu quốc tế, dữ liệu hóa thực vật và phổ cấu trúc chi tiết của các hợp chất phân lập từ nguồn mẫu thu hái tại Việt Nam còn rất ít. Đối với loài Ficus hirta, chưa có công trình nào trong nước công bố hệ thống thành phần hóa học của phần rễ và đánh giá độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư người cũng như dòng tế bào tủy xương cấp tính OCI-AML. Luận án thực hiện phân lập sâu, xác định cấu trúc các hợp chất và kiểm tra hoạt tính sinh học để lấp đầy khoảng trống này.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Quy trình chiết tách và phân lập
- Xử lý mẫu: Mẫu thực vật khô (toàn cây ngọc cẩu cái và rễ cây vú bò) được xay nhỏ thành bột, chiết ngấm kiệt hoặc chiết hỗ trợ siêu âm ở nhiệt độ 40–50 °C bằng dung môi methanol hoặc ethanol–nước ($\text{EtOH}:\text{H}_2\text{O} = 7:3$) từ 3 đến 4 lần. Dịch chiết gộp lại, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên máy cô quay chân không để thu cặn chiết tổng.
- Chiết phân bố lỏng - lỏng: Cặn chiết tổng được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane (hoặc chloroform), ethyl acetate (EtOAc) và n-butanol (n-BuOH).
- Kỹ thuật sắc ký:
- Sắc ký cột pha thường: Sử dụng chất hấp phụ Silica gel 60 ($0,040 - 0,063\text{ mm}$ hoặc $0,063 - 0,200\text{ mm}$).
- Sắc ký cột pha đảo: Sử dụng Silica gel YMC ODS-A ($50\ \mu\text{m}$).
- Sắc ký rây phân tử và trao đổi ion: Sử dụng gel Sephadex LH-20 và nhựa Diaion HP-20.
- Kiểm tra sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng Silica gel $60\text{ F}{254}$ và $\text{RP}{18}\text{ F}_{254}$, hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric ($\text{H}_2\text{SO}_4$) 10% trong ethanol và gia nhiệt.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên thiết bị phổ Bruker Avance tại Viện Hóa học (tần số 500 MHz cho $^1\text{H}$ và 125 MHz cho $^{13}\text{C}$), sử dụng các dung môi deuterat hóa như $\text{CDCl}_3$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{DMSO-}d_6$. Sử dụng kết hợp phổ 1D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và 2D ($^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY).
- Phổ khối lượng: Ghi phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) để xác định khối lượng phân tử chính xác và thiết lập công thức phân tử.
- Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo ở dạng viên nén KBr trên máy IMPACT 410 (Nicolet-Carl Zeiss Jena, Đức) để phát hiện các nhóm chức đặc trưng (hydroxyl, carbonyl, nhân thơm, liên kết đôi).
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
- Phương pháp thử độc tính tế bào (SRB và MTT):
- Thử nghiệm MTT/SRB tiến hành trên các dòng tế bào ung thư người gồm RD (ung thư cơ vân/mô liên kết), HepG2 (ung thư biểu mô gan) và OCI-AML (dòng tế bào ung thư bạch cầu tủy cấp tính).
- Môi trường nuôi cấy: RPMI-1640 hoặc DMEM/MEME bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS), kháng sinh PSF (penicillin, streptomycin, fungizone) trong điều kiện $37\ ^\circ\text{C}$, 5% $\text{CO}_2$.
- Đánh giá sự sống của tế bào, tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và phân tích sự phân bố các pha trong chu trình tế bào sau 24 giờ xử lý mẫu tại Đại học Y Perugia.
- Phương pháp ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO): Nuôi cấy dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7, kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS), đo hàm lượng nitrite tích lũy trong môi trường qua phản ứng Griess nhằm xác định hoạt tính kháng viêm in vitro.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, phân loại học, kinh nghiệm sử dụng dân gian và tổng quan các công trình nghiên cứu trong nước, quốc tế về thành phần hóa học cùng hoạt tính sinh học của chi Balanophora (tập trung vào Balanophora laxiflora Hemsl.) và chi Ficus (tập trung vào Ficus hirta Vahl.).
Chương tổng quan đã tổng hợp các dẫn liệu về:
- Các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp chính trong loài B. laxiflora gồm dẫn xuất tannin thủy phân mang nhóm galloyl và caffeoyl, phenylpropanoid đơn phân và dime, lignan dạng monoepoxy và bisepoxy, flavonoid và triterpenoid.
- Dẫn liệu dược lý thực nghiệm của B. laxiflora trên thế giới về khả năng khử gốc tự do DPPH, superoxide, ức chế phản ứng viêm thông qua con đường sinh tổng hợp NO và tác dụng hạ acid uric huyết.
- Dữ liệu hóa học và dược lý của các bộ phận quả, lá, vỏ, thân, nhựa mủ và rễ của các loài thuộc chi Ficus (họ Moraceae), khẳng định tiềm năng chứa các hợp chất coumarin, flavonoid và alkaloid có hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn và bảo vệ gan.
- Xác lập tính cần thiết của việc triển khai nghiên cứu hóa học và thử nghiệm sinh học đối với nguồn nguyên liệu B. laxiflora và F. hirta thu hái tại tỉnh Tuyên Quang, Việt Nam.
Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, quy trình chiết xuất, tách phân đoạn và các quy trình thử nghiệm sinh học.
- Mẫu thực vật: Thu hái mẫu B. laxiflora (cây cái) tại Na Hang và rễ F. hirta tại Yên Sơn, Tuyên Quang (tháng 10/2014).
- Quy trình phân lập từ ngọc cẩu (B. laxiflora): Cặn chiết tổng MeOH được phân bố với dichloromethane, EtOAc và n-BuOH. Tiến hành phân lập trên sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo, thu được 20 hợp chất ký hiệu từ BL-1 đến BL-20.
- Quy trình phân lập từ rễ vú bò (F. hirta): Cặn chiết tổng được phân đoạn thành các cặn chiết EtOAc và n-BuOH. Kết hợp sắc ký hấp phụ silica gel, sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 để thu nhận các hợp chất sạch ký hiệu F-1 đến F-11.
- Quy trình chuẩn bị dung dịch thử nghiệm hoạt tính và bố trí lô thí nghiệm đối với các phép thử độc tế bào in vitro (HepG2, RD, OCI-AML) và thử nghiệm ức chế NO trên tế bào RAW 264.7.
Mẫu thực vật khô (B. laxiflora / F. hirta)
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày chi tiết kết quả phân lập, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ hai loài thực vật và kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học.
1. Thành phần hóa học phân lập từ cây ngọc cẩu (Balanophora laxiflora)
Luận án đã phân lập và biện giải cấu trúc của 20 hợp chất (BL-1 đến BL-20):
- Hợp chất mới:
- BL-10 (Balanochalcone): Xác định công thức phân tử và cấu trúc dựa trên phổ HR-ESI-MS, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC và các tương tác dị nhân tầm xa tiêu biểu trên phổ HMBC.
- Các hợp chất phenylpropanoid và dẫn xuất:
- BL-1: 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde
- BL-2: Methyl 4-hydroxycinnamate
- BL-4: Methyl 3,4-dihydroxycinnamate
- BL-9: Methyl gallate
- BL-11: $\beta$-Hydroxydihydrochalcone
- BL-13: p-Coumaric acid
- Các hợp chất lignan:
- BL-3: Pinoresinol
- BL-6: (+)-Lariciresinol
- BL-7: (+)-Isolariciresinol
- BL-14: Isolariciresinol 4-O-$\beta$-D-glucopyranoside
- BL-20: Lariciresinol 4-O-$\beta$-D-glucopyranoside
- Các hợp chất coumarin, flavonoid, xanthone và glycoside khác:
- BL-5: 7-Hydroxy-6-methoxycoumarin (scopoletin)
- BL-8: Quercetin
- BL-12: Dimethyl 6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate
- BL-15: Daucosterol
- BL-16: 5-Hydroxymethylfurfural
- BL-17: Methyl $\beta$-D-glucopyranoside
- BL-18: Methyl 4-O-$\beta$-D-glucopyranosylconiferyl ether
- BL-19: 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl glucopyranoside
| Ký hiệu mẫu |
Tên hợp chất |
Nhóm cấu trúc hóa học |
| BL-1 |
4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde |
Phenylpropanoid |
| BL-2 |
Methyl 4-hydroxycinnamate |
Phenylpropanoid ester |
| BL-3 |
Pinoresinol |
Bisepoxylignan |
| BL-4 |
Methyl 3,4-dihydroxycinnamate |
Phenylpropanoid ester |
| BL-5 |
Scopoletin (7-hydroxy-6-methoxycoumarin) |
Coumarin |
| BL-6 |
(+)-Lariciresinol |
Monoepoxylignan |
| BL-7 |
(+)-Isolariciresinol |
Cyclolignan |
| BL-8 |
Quercetin |
Flavonoid |
| BL-9 |
Methyl gallate |
Dẫn xuất phenolic |
| BL-10 |
Balanochalcone (hợp chất mới) |
Chalcone |
| BL-11 |
$\beta$-Hydroxydihydrochalcone |
Dihydrochalcone |
| BL-12 |
Dimethyl 6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate |
Dẫn xuất Benzo[kl]xanthene |
| BL-13 |
p-Coumaric acid |
Acid phenolic |
| BL-14 |
Isolariciresinol 4-O-$\beta$-D-glucopyranoside |
Cyclolignan glycoside |
| BL-15 |
Daucosterol |
Sterol glycoside |
| BL-16 |
5-Hydroxymethylfurfural |
Dẫn xuất Furan |
| BL-17 |
Methyl $\beta$-D-glucopyranoside |
Monosaccharide glycoside |
| BL-18 |
Methyl 4-O-$\beta$-D-glucopyranosylconiferyl ether |
Phenylpropanoid ether glycoside |
| BL-19 |
4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl glucopyranoside |
Acid phenolic glycoside |
| BL-20 |
Lariciresinol 4-O-$\beta$-D-glucopyranoside |
Monoepoxylignan glycoside |
2. Thành phần hóa học phân lập từ rễ cây vú bò (Ficus hirta)
Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các phân đoạn cặn chiết EtOAc và n-BuOH của rễ cây vú bò:
- Hợp chất F-1: Xác định cấu trúc qua phổ FT-IR, HR-ESI-MS ($[M+\text{Na}]^+$), $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC và HMBC.
- Hợp chất F-2: Umbelliferon (7-hydroxycoumarin), xác định dựa trên so sánh dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân với tài liệu tham khảo.
- Hợp chất F-3, F-4, F-5, F-6 (xác định cấu trúc chi tiết và tương tác tầm xa tiêu biểu trên phổ HMBC trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$).
- Hợp chất F-7: So sánh tương quan phổ NMR với khung $\beta$-adenosine.
- Các hợp chất F-8, F-9, F-10, F-11.
3. Đánh giá hoạt tính sinh học
- Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất từ B. laxiflora: Tiến hành thử nghiệm các chất BL-4, BL-10, BL-11, BL-12 ở các dải nồng độ 0,5; 2; 8; 32; 128 $\mu\text{g/ml}$ trên các dòng tế bào ung thư.
- Khảo sát trên dòng tế bào tủy xương cấp tính OCI-AML (thực hiện tại Đại học Y Perugia, Italy):
- Đánh giá số lượng tế bào sống sót OCI-AML sau 24 giờ tiếp xúc với mẫu thử so với đối chứng dung môi MeOH.
- Đánh giá tỷ lệ tế bào đi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) sau 24 giờ.
- Phân tích sự thay đổi phân bố các pha trong chu trình tế bào của dòng OCI-AML khi xử lý ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau.
- Hoạt tính ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO) và ức chế tế bào RAW 264.7: Xác định mức độ ức chế sản sinh NO của các mẫu cặn chiết và hợp chất sạch phân lập từ B. laxiflora và F. hirta.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
-
Về thành phần hóa học:
- Phân lập và xác định cấu trúc của 20 hợp chất từ cây ngọc cẩu cái (Balanophora laxiflora Hemsl.), trong đó xác định được 01 hợp chất mới thuộc nhóm chalcone đặt tên là balanochalcone (hợp chất BL-10).
- Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân lập và xác định cấu trúc một cách hệ thống các hợp chất từ rễ cây vú bò (Ficus hirta Vahl.), bao gồm các dẫn xuất coumarin (như umbelliferon F-2), nucleoside (F-7 tương quan với $\beta$-adenosine) và các dẫn xuất phenolic liên quan.
- Cung cấp tập dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR, HR-ESI-MS và FT-IR chuẩn xác cho các hợp chất lignan, chalcone, phenylpropanoid và coumarin từ hai loài nghiên cứu.
-
Về hoạt tính sinh học:
- Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập từ loài B. laxiflora (BL-4, BL-10, BL-11, BL-12).
- Cung cấp bằng chứng thực nghiệm sinh học về tác động của các mẫu nghiên cứu đối với dòng tế bào ung thư tủy xương cấp tính (OCI-AML), chứng minh khả năng gây giảm sinh khối tế bào, kích hoạt con đường chết theo chương trình (apoptosis) và làm biến đổi chu trình tế bào OCI-AML.
- Xác định khả năng ức chế sinh tổng hợp nitric oxide (NO) trên tế bào đại thực bào RAW 264.7, góp phần minh chứng cơ chế kháng viêm của các bài thuốc dân gian sử dụng ngọc cẩu và vú bò.
Kiến nghị và định hướng ứng dụng
- Sử dụng các cặn chiết giàu hoạt tính sinh học của B. laxiflora và F. hirta làm nguồn nguyên liệu để nghiên cứu phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị chống viêm, tăng cường miễn dịch và hỗ trợ ức chế tăng sinh tế bào bất thường.
- Cần mở rộng quy mô chiết tách để thu hồi lượng lớn hơn đối với hợp chất mới balanochalcone (BL-10) và các dẫn xuất lignan nhằm phục vụ các thử nghiệm dược lý chuyên sâu.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ thu hái tại một địa bàn duy nhất (huyện Na Hang và huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang) vào thời điểm tháng 10 năm 2014; chưa đánh giá sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ, độ tuổi của cây và các vùng sinh thái địa lý khác nhau.
- Thử nghiệm sinh học đối với dòng OCI-AML và các dòng tế bào ung thư khác mới dừng lại ở quy mô sàng lọc in vitro, chưa triển khai thử nghiệm trên các mô hình động vật sống (in vivo).
- Một số hợp chất sạch thu nhận được với khối lượng nhỏ, chưa đủ để khảo sát toàn diện nhiều loại hoạt tính sinh học khác nhau.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Khảo sát định lượng hàm lượng các hoạt chất chính (như balanochalcone, umbelliferon, isolariciresinol) trong các mẫu ngọc cẩu và vú bò thu thập tại nhiều vùng địa lý khác nhau bằng phương pháp HPLC hoặc LC-MS/MS.
- Mở rộng khảo sát cơ chế phân tử chi tiết của hợp chất mới balanochalcone (BL-10) trên các đích phân tử liên quan đến phản ứng viêm và chu trình chết tế bào ung thư.
- Đánh giá độc tính bán trường diễn và hoạt tính dược lý in vivo trên động vật thực nghiệm của các cao chiết chuẩn hóa.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị trong các lĩnh vực Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học cổ truyền:
- Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa học, Dược học: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chiết phân bố lỏng - lỏng, phương pháp tách sắc ký phân đoạn trên pha thường, pha đảo (ODS), Sephadex LH-20; đặc biệt là tập hợp dữ liệu biện giải phổ NMR 2 chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) đối với các khung cấu trúc phức tạp như chalcone, cyclolignan, bisepoxylignan và ellagitannin.
- Đối với các nhà nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc: Các số liệu sàng lọc độc tính tế bào trên dòng OCI-AML, HepG2, RD và hoạt tính ức chế sinh NO trên RAW 264.7 cung cấp dẫn liệu tham khảo để định hướng thiết kế các cấu trúc dẫn xuất hoặc xây dựng tiêu chuẩn bán thành phẩm dược liệu.
- Đối với các cơ quan quản lý và bảo tồn tài nguyên dược liệu: Tài liệu cung cấp cơ sở nhận dạng hóa học và giá trị dược dụng thực nghiệm của hai loài thực vật Balanophora laxiflora Hemsl. và Ficus hirta Vahl. tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã phát hiện ra hợp chất mới nào và cấu trúc thuộc nhóm gì?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 01 hợp chất mới từ cây ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) ký hiệu là BL-10, được đặt tên là balanochalcone. Cấu trúc của hợp chất này thuộc nhóm chalcone (một phân nhóm của flavonoid), được xác định đầy đủ cấu trúc bằng phổ phân giải cao HR-ESI-MS, 1D-NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT) và 2D-NMR (HSQC, HMBC).
2. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu thập ở đâu và ai là người định danh tên khoa học?
- Cây ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl., cây cái): Thu hái vào tháng 10/2014 tại huyện Na Hang, tỉnh Tuyên Quang.
- Rễ cây vú bò (Ficus hirta Vahl.): Thu hái vào tháng 10/2014 tại huyện Yên Sơn, tỉnh Tuyên Quang.
Cả hai mẫu đều được TS. Đỗ Hữu Thư thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học.
3. Những dòng tế bào ung thư nào được sử dụng để đánh giá hoạt tính sinh học trong luận án?
Luận án đã sử dụng các dòng tế bào gồm:
- Dòng tế bào ung thư cơ vân/mô liên kết ở người (RD).
- Dòng tế bào ung thư biểu mô gan ở người (HepG2).
- Dòng tế bào ung thư tủy xương cấp tính ở người (OCI-AML), được thử nghiệm tại Đại học Y Perugia (Italy).
- Dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 dùng trong thử nghiệm ức chế sản sinh NO.
4. Hợp chất nào được phân lập từ rễ cây vú bò (Ficus hirta) trong luận án?
Từ rễ cây vú bò (F. hirta), luận án đã phân lập các hợp chất ký hiệu từ F-1 đến F-11, trong đó có hợp chất F-2 được xác định là umbelliferon (7-hydroxycoumarin), hợp chất F-6 được xác định cấu trúc phổ chi tiết và F-7 có tương quan phổ với $\beta$-adenosine, cùng các dẫn xuất phenolic khác.
5. Phương pháp phổ nào được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất trong luận án?
Các phương pháp phổ thực nghiệm bao gồm: phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) đo trên viên nén KBr bằng máy IMPACT 410; phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT-90, DEPT-135) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ($^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY).
Kết luận
Luận án đã thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài dược liệu Balanophora laxiflora Hemsl. và Ficus hirta Vahl. thu hái tại tỉnh Tuyên Quang, Việt Nam. Kết quả đã phân lập và xác định cấu trúc của 20 hợp chất từ cây ngọc cẩu (trong đó có 01 hợp chất mới balanochalcone BL-10) cùng các hợp chất sạch từ rễ cây vú bò (bao gồm dẫn xuất coumarin umbelliferon và nucleoside). Các thử nghiệm sinh học in vitro đã chứng minh tác dụng gây độc tế bào ung thư, ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào tủy xương cấp tính OCI-AML và khả năng ức chế sinh tổng hợp NO gây viêm của các phân đoạn chiết và hợp chất sạch. Công trình là nguồn tư liệu khoa học hoàn chỉnh, cung cấp cơ sở dữ liệu hóa thực vật và dược lý phục vụ công tác bảo tồn, nghiên cứu và khai thác dược liệu trong nước.
