Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu đặc điểm tế bào máu và protein bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm tế bào máu tủy xương và protein ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho, cung cấp thông tin quý giá cho y học.

• Tác giả: Đỗ Thị Vinh An
• Người hướng dẫn: Phạm Quang Vinh
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Mô - Phôi Và Tế Bào Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Một Số Đặc Điểm Tế Bào Máu, Tủy Xương, Nhiễm Sắc Thể Và Protein Bệnh Nhân Bạch Cầu Cấp Dòng Lympho
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. QUÁ TRÌNH SINH MÁU
• 1.2. DẤU ẤN MIỄN DỊCH TRÊN BỀ MẶT TẾ BÀO QUA CÁC THỜI KỲ PHÁT TRIỂN
• 1.3. BỆNH BẠCH CẦU CẤP
• 1.3.1. Khái niệm và lịch sử
• 1.3.2. Phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
• 1.4. CÁC NGUYÊN NHÂN GÂY BỆNH BẠCH CẦU CẤP
• 1.4.1. Tiền sử gia đình
• 1.4.2. Phóng xạ
• 1.5. CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH BẠCH CẦU CẤP
• 1.5.1. Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene)
• 1.5.2. Gen ức chế u
• 1.5.3. Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
• 1.5.4. Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho
• 1.6. KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN CÁC BIẾN ĐỔI GEN
• 1.6.1. Các dạng kĩ thuật PCR được áp dụng trong nghiên cứu
• 1.7. HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ PROTEIN TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO
• 1.7.1. Tác động của hệ protein lên hoạt động tế bào
• 1.7.2. Các protein bất thường liên quan đến bệnh bạch cầu cấp
• 1.7.3. Tác động của các protein khác
• 1.7.4. Kĩ thuật phân tích protein
• 1.8. CÁC YẾU TỐ CÓ GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH BẠCH CẦU CẤP
• 1.9. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO Ở VIỆT NAM
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP
• 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2.2. Nội dung và các chỉ số nghiên cứu
• 2.2.3. Các nhóm đối tượng nghiên cứu
• 2.2.4. Kĩ thuật huyết tủy đồ, chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho
• 2.2.5. Kĩ thuật phân tích tế bào di truyền
• 2.2.6. Kĩ thuật phân tích protein
• 2.2.7. Qui trình nghiên cứu
• 2.2.8. XỬ LÍ SỐ LIỆU
• 2.2.9. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU
• 3.1.1. Số bệnh nhân nghiên cứu: 66 bệnh nhân
• 3.1.2. Độ tuổi nhóm bệnh nhân nghiên cứu
• 3.1.3. Phân loại thể bệnh
• 3.2. ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC TỦY SINH MÁU CỦA BN BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO
• 3.2.1. Đặc điểm máu ngoại vi
• 3.2.2. Đặc điểm tế bào tủy xương
• 3.2.3. Tỷ lệ % tế bào non ác tính trong tủy xương bệnh nhân BCC dòng lympho
• 3.3. ĐẶC ĐIỂM TẾ BÀO DI TRUYỀN BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO
• 3.3.1. Kết quả phân tích nhiễm sắc thể
• 3.3.2. Kết quả xác định các chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL
• 3.4. SO SÁNH CÁC NHÓM BỆNH NHÂN CÓ BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ VÀ CÓ CÁC CHUYỂN ĐOẠN GEN MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL VÀ TỶ LỆ TẾ BÀO NON ÁC TÍNH TRƯỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ
• 3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PROTEIN HUYẾT THANH BN BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO
• 3.5.1. Loại bỏ albumin và IgG và phân tích các peptide bằng phương pháp nanoLC MS/MS
• 3.5.2. Kết quả phân tích protein
• 3.6. BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ CỦA CÁC XÉT NGHIỆM HUYẾT HỌC, DI TRUYỀN, MIỄN DỊCH, PHÂN TỬ, DƯỚI PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BẠCH CẦU CẤP
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh bạch cầu cấp dòng lympho và tế bào máu

Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (BCCCL) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trong nhóm bệnh máu. Bệnh này đặc trưng bởi sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho, dẫn đến rối loạn quá trình sinh tổng hợp tế bào máu. Theo thống kê, tỷ lệ mắc mới hàng năm của bệnh này là khoảng 4000 ca, với tỷ lệ tử vong xấp xỉ 1700 ca. Việc hiểu rõ về đặc điểm tế bào máu và protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là rất quan trọng để cải thiện chẩn đoán và điều trị.

1.1. Đặc điểm tế bào máu trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Tế bào máu trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho thường có sự thay đổi về số lượng và hình thái. Các tế bào non ác tính chiếm tỷ lệ cao trong tủy xương, ảnh hưởng đến khả năng sản xuất các tế bào máu bình thường. Nghiên cứu cho thấy, khoảng 60-70% bệnh nhân có các biến đổi di truyền, như chuyển đoạn nhiễm sắc thể, ảnh hưởng đến quá trình điều trị.

1.2. Vai trò của protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Protein trong máu có vai trò quan trọng trong việc xác định tình trạng bệnh nhân. Các nghiên cứu cho thấy, sự biểu hiện bất thường của một số protein có thể liên quan đến sự phát triển và tiến triển của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Việc phân tích protein giúp xác định các chỉ số tiên lượng và hỗ trợ trong việc điều trị.

II. Thách thức trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho gặp nhiều thách thức do sự đa dạng trong biểu hiện lâm sàng và các biến đổi di truyền. Việc phân loại chính xác bệnh là rất quan trọng để lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Các yếu tố như tuổi tác, giới tính và tiền sử gia đình cũng ảnh hưởng đến khả năng chẩn đoán.

2.1. Các khó khăn trong việc xác định đặc điểm tế bào máu

Việc xác định các đặc điểm tế bào máu trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho thường gặp khó khăn do sự biến đổi nhanh chóng của các tế bào. Các kỹ thuật xét nghiệm hiện tại cần được cải thiện để tăng độ chính xác trong chẩn đoán.

2.2. Tác động của các yếu tố bên ngoài đến chẩn đoán

Các yếu tố bên ngoài như môi trường sống, chế độ dinh dưỡng và tiếp xúc với hóa chất có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Việc nghiên cứu các yếu tố này là cần thiết để hiểu rõ hơn về nguyên nhân gây bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm tế bào máu và protein

Nghiên cứu đặc điểm tế bào máu và protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho thường sử dụng các phương pháp hiện đại như PCR, phân tích protein và xét nghiệm di truyền. Những phương pháp này giúp xác định các biến đổi di truyền và protein bất thường, từ đó đưa ra các chỉ số tiên lượng cho bệnh nhân.

3.1. Kỹ thuật PCR trong phân tích biến đổi gen

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện các biến đổi gen trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các đột biến gen, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị.

3.2. Phân tích protein huyết thanh bệnh nhân

Phân tích protein huyết thanh giúp xác định các protein bất thường liên quan đến bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Các nghiên cứu cho thấy, sự thay đổi trong biểu hiện protein có thể là dấu hiệu cảnh báo sớm về sự tiến triển của bệnh.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu trong điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Nghiên cứu về đặc điểm tế bào máu và protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho không chỉ giúp cải thiện chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Việc hiểu rõ về các biến đổi di truyền và protein có thể giúp các bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị chính xác hơn.

4.1. Tác động của nghiên cứu đến phương pháp điều trị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc phân tích các đặc điểm tế bào máu và protein có thể giúp xác định các phương pháp điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân. Điều này giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

4.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng tương lai

Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại có thể cải thiện đáng kể kết quả điều trị cho bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn.

V. Kết luận về nghiên cứu đặc điểm tế bào máu và protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Nghiên cứu về đặc điểm tế bào máu và protein trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là rất quan trọng để cải thiện chẩn đoán và điều trị. Việc hiểu rõ về các biến đổi di truyền và protein có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ tái phát. Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các phương pháp mới trong điều trị bệnh.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong y học

Nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho mà còn có thể áp dụng cho các bệnh lý khác. Việc phát triển các phương pháp phân tích hiện đại sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong y học.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Hướng đi tương lai trong nghiên cứu bệnh bạch cầu cấp dòng lympho cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị cá nhân hóa dựa trên đặc điểm di truyền và protein của từng bệnh nhân. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bạch cầu cấp (hay ung thư máu cấp) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất của hệ thống tạo máu, bao gồm hai nhóm chính: bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Theo số liệu thống kê của Viện Sức khỏe Hoa Kỳ được trích dẫn trong luận án, bệnh bạch cầu cấp có tỷ lệ mắc mới hàng năm khoảng 4.000 ca và số ca tử vong xấp xỉ 1.700 ca, đứng thứ 5 trong số các nguyên nhân gây tử vong do ung thư tại Hoa Kỳ.

Bạch cầu cấp dòng lympho đặc trưng bởi sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho (lymphoblast) do các biến đổi vật chất di truyền, dẫn tới việc chèn ép, lấn át các dòng tế bào sinh máu bình thường trong tủy xương và làm suy giảm chức năng tạo máu của cơ thể. Khoảng 60% đến 70% bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho mang các bất thường tế bào di truyền như đa bội, quá bội, thiểu bội, chuyển đoạn, đảo đoạn hoặc đứt gãy nhiễm sắc thể. Bên cạnh đó, các biến đổi ở mức độ phân tử và dịch mã protein đóng vai trò quyết định đối với cơ chế bệnh sinh, khả năng lui bệnh, nguy cơ tái phát và thời gian sống thêm của bệnh nhân.

Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án được thực hiện, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm tế bào học, miễn dịch học hoặc khảo sát đơn lẻ một số đột biến di truyền, chưa có một công trình nào khảo sát một cách toàn diện và có hệ thống từ cấp độ tế bào máu, tủy xương, nhiễm sắc thể, gen chuyển đoạn cho đến biến đổi của hệ protein (proteomics) trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho. Luận án tiến sĩ sinh học của nghiên cứu sinh Đỗ Thị Vinh An với đề tài "Nghiên cứu một số đặc điểm tế bào máu, tủy xương, nhiễm sắc thể và protein bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho" được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Phân tích các chỉ số tế bào máu và tủy ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho trước và sau điều trị.
2. Phân tích các biến đổi nhiễm sắc thể, biến đổi gen, biến đổi protein ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho.
3. Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm tủy sinh máu, protein, các biến đổi di truyền với kết quả điều trị bước đầu bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu máu ngoại vi và dịch tủy sinh máu của 66 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bạch cầu cấp dòng lympho (gồm 12 trẻ em dưới 15 tuổi và 54 người trưởng thành).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được tiến hành trên các bệnh nhân điều trị tại Khoa Huyết học - Truyền máu và Khoa Nhi thuộc Bệnh viện Bạch Mai, phối hợp phân tích phân tử và protein tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu và theo dõi bệnh nhân từ tháng 03 năm 2008 đến tháng 12 năm 2010.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong Chương 1, tác giả đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu và các cơ sở khoa học liên quan đến bệnh bạch cầu cấp dòng lympho trên thế giới và tại Việt Nam:

• Lịch sử và phân loại bệnh: Bệnh ung thư máu được Velpeau ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1827; đến năm 1845, Bennett đặt tên là Leucocythema. Sau đó, Virchow sử dụng thuật ngữ White blood và chính thức đề xuất tên gọi Leukemia. Năm 1889, Ebstein đưa ra thuật ngữ lơ xê mi cấp. Về quá trình tạo máu, tác giả điểm lại thuyết sinh máu một nguồn từ tế bào gốc vạn năng được công nhận từ năm 1945, cùng các công trình của David Brown và Kevin Gatter (2006) về tỷ lệ phân bố tế bào sinh máu và mô mỡ theo lứa tuổi.
• Biến đổi tế bào di truyền và sinh học phân tử: Luận án tổng hợp các bất thường nhiễm sắc thể và gen dung hợp thường gặp ở bạch cầu cấp dòng lympho theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2001, 2008) và hệ thống phân loại hình thái FAB (L1, L2, L3). Các nghiên cứu của Pui C.H. (2008) về chuyển đoạn $t(4;11)(q21;q23)$ tạo gen lai $MLL/AF4$; các nghiên cứu về chuyển đoạn $t(9;22)(q34;q11)$ tạo gen lai $BCR/ABL$ (sản phẩm 190 kDa ở thể cấp và 210 kDa ở thể mạn); chuyển đoạn $t(1;19)(q23;p13)$ tạo gen lai $E2A/PBX$; chuyển đoạn $t(12;21)(p13;q22)$ tạo gen lai $AML1/TEL$. Các yếu tố tiên lượng được đối chiếu với các công trình của Hoffbrand A. và Robert McKenna.
• Nghiên cứu về proteomics: Tác giả điểm lại các nghiên cứu của Anderson N.L. và cộng sự (2009) về hệ protein huyết thanh; nghiên cứu về các protein chỉ thị như CREB, PRAME (biểu hiện ở 52,9% bệnh nhi theo các tác giả quốc tế), FLT3 (nghiên cứu của Ravandi về mức độ phosphoryl hóa), OP18 (phosphoryl hóa gốc Ser63) và công trình của Yocum và cộng sự về sự thay đổi của 11 protein (trong đó có 6 protein liên quan đến apoptosis) ở bệnh nhân mang chuyển đoạn $t(4;11)$.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Tác giả điểm lại các mốc nghiên cứu trong nước từ năm 1974:
  • Về lâm sàng và hình thái: Đặng Ngọc Tiêu và cộng sự (1977); Bạch Quốc Tuyên và Đỗ Xuân Thiêm (1980) thiết lập bộ xét nghiệm hóa học tế bào chẩn đoán FAB; Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực (thập niên 1980); Lâm Thị Mỹ, Trần Thái Bình, Huỳnh Nghĩa (2004); Bạch Quốc Khánh, Nguyễn Hà Thanh, Đỗ Trung Phấn (2004).
  • Về miễn dịch tế bào: Trần Văn Bé và Lê Hữu Tài (1997); Trần Quốc Dũng và Phan Nguyễn Thanh Vân (2001); Trần Thị Hồng Hà (2007); Nguyễn Triệu Vân (2009).
  • Về di truyền và sinh học phân tử: Nguyễn Ngọc Minh (1986); Trần Thị Hồng Hà, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Công Khanh (1997); Phạm Quang Vinh (2003) thống kê bất thường nhiễm sắc thể trên 200 bệnh nhân; Bùi Ngọc Lan và cộng sự (2007); Nguyễn Thiên Lữ và Phạm Quang Vinh (2007) áp dụng kỹ thuật FISH và PCR phát hiện biến đổi $BCR/ABL$; Vũ Minh Phương (2009).
  • Về protein: Vũ Minh Thành và Phan Văn Chi (2004) báo cáo về protein lai; Trịnh Thị Thanh Hương và Trịnh Hồng Thái (2006); Phan Văn Chi (2009, 2010) nghiên cứu ngân hàng protein huyết thanh người Việt Nam.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là thực hiện một khảo sát đồng bộ, kết hợp xét nghiệm hình thái tủy đồ, hóa tế bào, dấu ấn miễn dịch bề mặt (CD), kỹ thuật di truyền tế bào (karyotype nhuộm băng G), kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR và Nested-PCR xác định 4 chuyển đoạn gen quan trọng) và phân tích proteomics huyết thanh bằng công nghệ sắc ký lỏng nano đa chiều kết nối khối phổ liên tiếp ($nanoLC-MS/MS$) trên cùng một nhóm bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho trước và sau điều trị hóa chất.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết tạo máu một nguồn từ tế bào gốc vạn năng ($pluripotent\ hemopoietic\ stem\ cells$), quá trình biệt hóa dòng lympho qua các giai đoạn từ tế bào gốc lympho, tiền B/tiền T, B/T trung gian đến tế bào trưởng thành với sự biểu hiện của các cụm biệt hóa ($Cluster\ of\ Differentiation - CD$). Cơ chế bệnh sinh ác tính được phân tích thông qua sự kích hoạt các gen sinh ung ($oncogene$) và sự bất hoạt của các gen ức chế u (như gen $p53$ trên nhiễm sắc thể 17p mã hóa protein 53 kDa). Khung phân tích của luận án tích hợp 4 mức độ:

1. Mức độ tế bào và mô học: Mật độ tế bào tủy, tỷ lệ tế bào non ác tính ($blast$), phản ứng hóa tế bào PAS.
2. Mức độ miễn dịch: Dấu ấn bề mặt dòng B ($CD19, CD20, CD10, CD22, CD79a$) và dòng T ($CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8$).
3. Mức độ di truyền học: Bất thường số lượng/cấu trúc nhiễm sắc thể qua lập bộ Karyotype và các chuyển đoạn gen tái tổ hợp ($BCR/ABL, AML1/TEL, MLL/AF4, E2A/PBX$).
4. Mức độ dưới phân tử (Proteomics): Biểu hiện của các chuỗi peptide và protein huyết thanh.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả tiến cứu, định lượng kết hợp xét nghiệm cận lâm sàng chuyên sâu:

• Phân nhóm đối tượng nghiên cứu:

  • Nhóm 1: 66 bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho được đánh giá các đặc điểm máu và tủy trước điều trị (nhóm 1a) và sau điều trị hóa chất (nhóm 1b). Phác đồ điều trị hóa chất được áp dụng là: Doxorubicin + Vincristin + Prednisolon $\pm$ Cyclophosphamid.
  • Nhóm 2: Các bệnh nhân mang 4 loại chuyển đoạn gen: $E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL, MLL/AF4$.
  • Nhóm 3: 05 bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường, không phát hiện bất thường di truyền, được chỉ định phân tích hệ protein huyết thanh trước điều trị.

• Các kỹ thuật xét nghiệm và công cụ phân tích:

  • Huyết tủy đồ và hóa tế bào: Lấy máu ngoại vi và hút dịch tủy xương nhuộm Giemsa, nhuộm hóa học tế bào với Periodic Acid Schiff (PAS), sinh thiết tủy xương để đánh giá mật độ tế bào và tỷ lệ tế bào blast. Tiêu chuẩn chẩn đoán bạch cầu cấp theo WHO là tỷ lệ tế bào blast trong tủy xương $\ge 20%$.
  • Xét nghiệm dấu ấn miễn dịch: Sử dụng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang xác định các CD đặc hiệu dòng B và dòng T.
  • Kỹ thuật di truyền tế bào: Nuôi cấy ngắn hạn tế bào tủy xương, làm tiêu bản và nhuộm băng G để phân tích bộ nhiễm sắc thể (Karyotyping).
  • Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết RNA/DNA từ tế bào tủy và máu ngoại vi; thực hiện phản ứng phiên mã ngược (RT-PCR) và kỹ thuật PCR lồng (Nested-PCR) sử dụng enzyme Taq polymerase, các cặp mồi chuyên biệt để khuếch đại và phát hiện 4 chuyển đoạn gen: $BCR/ABL\ [t(9;22)]$, $MLL/AF4\ [t(4;11)]$, $E2A/PBX\ [t(1;19)]$, $AML1/TEL\ [t(12;21)]$, kiểm tra sản phẩm bằng điện di gel agarose.
  • Kỹ thuật phân tích Proteomics: Mẫu huyết thanh của 05 bệnh nhân được xử lý loại bỏ albumin và IgG, sau đó các chuỗi peptide được phân tích bằng hệ thống Proteomics workflow gồm sắc ký lỏng nano đa chiều (nanoLC Packing, Dionex) kết nối trực tuyến với hệ thống khối phổ QSTAR®XL MS/MS sử dụng nguồn ion hóa NanoSprayTM (MDS SCIEX/Applied Biosystems). Dữ liệu phổ được đối chiếu với cơ sở dữ liệu protein người bình thường và protein ung thư.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày hệ thống cơ sở lý luận về quá trình sinh máu tại gan phôi, lách, tủy xương qua các giai đoạn phát triển cá thể; cấu trúc vi môi trường tủy xương; các dấu ấn miễn dịch CD trong quá trình biệt hóa lympho B và lympho T. Chương này cũng phân tích chi tiết các giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh (yếu tố gia đình, phóng xạ ion hóa, hóa chất độc hại như benzen, thuốc trừ sâu, virus HTLV-I, EBV); cơ chế sinh ung thư do oncogene và gen ức chế u $p53$. Tác giả tổng quan chi tiết về 4 chuyển đoạn gen mục tiêu ($BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX, AML1/TEL$), nguyên lý kỹ thuật RT-PCR, Nested-PCR, nguyên lý phân tích proteome (HUPO, LC-MS/MS) và tổng kết các công trình nghiên cứu bệnh bạch cầu cấp dòng lympho tại Việt Nam từ năm 1974 đến năm 2010.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phương pháp thu thập dữ liệu trên 66 bệnh nhân (12 trẻ em $<15$ tuổi, 54 người lớn $\ge 15$ tuổi) tại Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 03/2008 đến tháng 12/2010. Chương này chuẩn hóa các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân, phác đồ điều trị hóa chất tấn công (Doxorubicin + Vincristin + Prednisolon $\pm$ Cyclophosphamid), quy trình lấy mẫu máu ngoại vi và dịch hút tủy xương. Phương pháp phân tích Karyotype nhuộm băng G, các chu trình nhiệt và cặp mồi trong kỹ thuật RT-PCR/Nested-PCR cho 4 chuyển đoạn gen, quy trình tách chiết loại bỏ albumin/IgG và quy trình chạy sắc ký khối phổ $nanoLC-MS/MS$ tại Viện Công nghệ Sinh học được mô tả rõ ràng, đảm bảo tính lặp lại của nghiên cứu.

Nhóm đối tượng	Quy mô mẫu	Mục tiêu phân tích
Nhóm 1 (1a & 1b)	66 bệnh nhân	Đánh giá chỉ số huyết học, mật độ tủy, tỷ lệ tế bào non ác tính trước và sau điều trị hóa chất
Nhóm 2	Các ca dương tính	Khảo sát tần suất và đặc điểm 4 chuyển đoạn gen ($BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX, AML1/TEL$)
Nhóm 3	05 bệnh nhân	Phân tích biến đổi hệ protein huyết thanh trước điều trị bằng $nanoLC-MS/MS$ (trên nhóm có NST bình thường)

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ 66 bệnh nhân và thảo luận chi tiết:

• Đặc điểm chung và phân loại thể bệnh: Phân loại thể bệnh theo tiêu chuẩn hình thái FAB (thể L1, L2, L3) và phân loại miễn dịch học (dòng B và dòng T). Kết quả nhuộm hóa tế bào PAS cho thấy hình ảnh các hạt dương tính đặc trưng trên bề mặt tế bào non ác tính; xét nghiệm miễn dịch ghi nhận các tế bào dương tính với CD10, CD19, CD20, CD34, âm tính với CD33.
• Đặc điểm huyết học và tủy sinh máu trước - sau điều trị: Đánh giá số lượng bạch cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu ở máu ngoại vi; tình trạng tăng sinh tế bào blast dày đặc trong các khoang sinh máu trên tiêu bản sinh thiết tủy và sự biến mất của các tế bào đầu dòng bình thường trước điều trị. Sau điều trị hóa chất theo phác đồ, tỷ lệ tế bào non ác tính giảm rõ rệt và xuất hiện hình ảnh phục hồi tạo máu bình thường ở các bệnh nhân đáp ứng thuốc.
• Kết quả phân tích tế bào di truyền (Nhiễm sắc thể): Báo cáo tỷ lệ phân tích thành công Karyotype trên tủy xương; xác định các dạng bất thường số lượng (quá bội $>50$ NST, trên lưỡng bội 47-50 NST, thiểu bội $<46$ NST) và bất thường cấu trúc (chuyển đoạn, đảo đoạn, nhiễm sắc thể Philadelphia - $Ph1$).
• Kết quả phân tích 4 chuyển đoạn gen bằng RT-PCR: Luận án xác định tỷ lệ xuất hiện của các chuyển đoạn $BCR/ABL$, $AML1/TEL$, $E2A/PBX$, $MLL/AF4$ qua hình ảnh điện di sản phẩm PCR; so sánh các tỷ lệ này với các công bố quốc tế và trong nước.
• Mối liên quan giữa biến đổi di truyền và kết quả điều trị: Đối chiếu tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy trước và sau điều trị giữa các nhóm bệnh nhân mang các đột biến số lượng NST và các chuyển đoạn gen khác nhau; xác định nhóm chuyển đoạn có tiên lượng lui bệnh thuận lợi hoặc kém đáp ứng.
• Kết quả phân tích Protein huyết thanh bằng nanoLC-MS/MS: Trên 05 bệnh nhân có bộ NST bình thường, phương pháp $nanoLC-MS/MS$ đã nhận dạng nhiều peptide và protein bệnh lý, protein liên quan đến ung thư, protein bền nhiệt và các dạng protein đột biến/protein lai (như việc nhận dạng dấu vết protein liên quan đến $MLL-AF4$). Kết quả này chứng minh rằng ngay cả khi không phát hiện bất thường nhiễm sắc thể ở mức độ tế bào học, hệ protein đã có những sai sót và biểu hiện bệnh lý rõ rệt.
• Đánh giá hệ thống xét nghiệm: Luận án tổng kết ưu điểm và nhược điểm của từng kỹ thuật xét nghiệm (hình thái huyết tủy đồ, di truyền tế bào, miễn dịch tế bào, sinh học phân tử RT-PCR và proteomics) trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học:

   • Cung cấp dẫn liệu khoa học có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam kết hợp đồng bộ 4 mức độ: hình thái tế bào học, miễn dịch học, di truyền tế bào (nhiễm sắc thể), sinh học phân tử (4 chuyển đoạn gen) và phân tích hệ protein (proteomics) trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho.
   • Chứng minh bằng thực nghiệm rằng ở những bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có bộ nhiễm sắc thể bình thường (Karyotype $46,XX$ hoặc $46,XY$), phương pháp proteomics ($nanoLC-MS/MS$) vẫn phát hiện được sự biểu hiện bất thường của các protein ung thư, protein đột biến và protein bệnh lý.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng:

   • Ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật RT-PCR và Nested-PCR để phát hiện nhanh, chính xác 4 chuyển đoạn gen có giá trị tiên lượng cao ($BCR/ABL, AML1/TEL, MLL/AF4, E2A/PBX$) phục vụ chẩn đoán phân loại theo WHO.
   • Thiết lập quy trình phân tích peptide huyết thanh bằng công nghệ $nanoLC-MS/MS$ sau khi đã loại bỏ albumin và IgG, mở ra hướng ứng dụng công nghệ proteomics trong việc tìm kiếm các dấu ấn sinh học ($biomarker$) chẩn đoán bệnh ung thư máu tại Việt Nam.
   • Cung cấp số liệu đánh giá đáp ứng lui bệnh (thay đổi tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy trước và sau điều trị hóa chất) theo từng phân nhóm bất thường di truyền, hỗ trợ các nhà lâm sàng định hướng tiên lượng và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

• Cần áp dụng thường quy kỹ thuật RT-PCR xác định các chuyển đoạn gen $BCR/ABL, AML1/TEL, MLL/AF4, E2A/PBX$ kết hợp với xét nghiệm tủy đồ và dấu ấn miễn dịch cho mọi bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho ngay khi tiếp nhận điều trị.
• Tiếp tục mở rộng nghiên cứu phân tích hệ protein trên cỡ mẫu lớn hơn để xây dựng bộ cơ sở dữ liệu protein chỉ thị bệnh đặc thù cho bệnh nhân ung thư máu người Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Do điều kiện kỹ thuật và chi phí phân tích khối phổ chuyên sâu vào thời điểm nghiên cứu, số lượng mẫu bệnh nhân được phân tích hệ protein bằng $nanoLC-MS/MS$ còn hạn chế ($n = 5$ bệnh nhân thuộc nhóm có bộ nhiễm sắc thể bình thường).
• Đánh giá đáp ứng điều trị mới dừng lại ở kết quả điều trị bước đầu (đáp ứng lui bệnh tủy sau đợt hóa trị tấn công chuẩn: Doxorubicin + Vincristin + Prednisolon $\pm$ Cyclophosphamid), chưa theo dõi thời gian sống thêm toàn bộ ($Overall\ Survival - OS$) và thời gian sống không bệnh ($Disease-Free\ Survival - DFS$) trong thời gian dài (3 - 5 năm).

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng phân tích proteomics trên các nhóm bệnh nhân mang các đột biến gen và chuyển đoạn nhiễm sắc thể cụ thể để so sánh sự khác biệt về biểu hiện hệ protein giữa các phân nhóm di truyền.
• Nghiên cứu phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh (kit xét nghiệm) dựa trên các protein chỉ thị bệnh được phát hiện qua khối phổ nhằm phục vụ theo dõi tồn dư tối thiểu của bệnh ($Minimal\ Residual\ Disease - MRD$).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Bác sĩ chuyên khoa Huyết học - Truyền máu và Ung bướu: Tham khảo quy trình phối hợp các xét nghiệm đa tầng (tủy đồ, miễn dịch CD, Karyotype, RT-PCR) trong phân loại nguy cơ và đánh giá tiên lượng đáp ứng hóa chất ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho người lớn và trẻ em.
• Nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Mô - Phôi và Tế bào học, Di truyền học, Sinh học phân tử: Tham khảo phương pháp thiết kế nghiên cứu thực nghiệm y sinh, kỹ thuật nhuộm băng G phân tích nhiễm sắc thể tủy xương và quy trình RT-PCR/Nested-PCR phát hiện các gen tái tổ hợp.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Công nghệ Sinh học và Proteomics: Quy trình xử lý mẫu huyết thanh (loại bỏ protein dồi dào albumin/IgG) và thông số vận hành hệ thống sắc ký lỏng nano kết nối khối phổ $nanoLC-MS/MS$ ($QSTAR®XL$) là tài liệu tham khảo kỹ thuật hữu ích.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án khảo sát các dạng chuyển đoạn gen nào bằng kỹ thuật sinh học phân tử?

Luận án sử dụng kỹ thuật RT-PCR và Nested-PCR để khảo sát 4 chuyển đoạn gen quan trọng ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho:

• $BCR/ABL$ do chuyển đoạn $t(9;22)(q34;q11)$
• $MLL/AF4$ do chuyển đoạn $t(4;11)(q21;q23)$
• $E2A/PBX$ do chuyển đoạn $t(1;19)(q23;p13)$
• $AML1/TEL$ do chuyển đoạn $t(12;21)(p13;q22)$

2. Hệ thống thiết bị và phương pháp nào được sử dụng để phân tích biến đổi protein huyết thanh?

Luận án sử dụng mẫu huyết thanh bệnh nhân đã được loại bỏ albumin và IgG, sau đó phân tích các chuỗi peptide bằng hệ thống Proteomics workflow gồm: hệ thống sắc ký lỏng nano đa chiều (nanoLC Packing, Dionex, Hà Lan) kết nối trực tuyến với hệ thống khối phổ liên tiếp QSTAR®XL MS/MS sử dụng nguồn ion hóa NanoSprayTM (MDS SCIEX/Applied Biosystems).

3. Quy mô mẫu nghiên cứu của luận án là bao nhiêu và phân bố lứa tuổi như thế nào?

Tổng số bệnh nhân nghiên cứu là 66 bệnh nhân được chẩn đoán bạch cầu cấp dòng lympho điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai, trong đó gồm 12 bệnh nhi dưới 15 tuổi và 54 bệnh nhân người trưởng thành. Trong đó, có 05 bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường được chọn để phân tích chuyên sâu hệ protein huyết thanh trước điều trị.

4. Phác đồ điều trị hóa chất nào đã được áp dụng cho các bệnh nhân trong nghiên cứu?

Phác đồ điều trị hóa chất được áp dụng cho các bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho trong nghiên cứu là phác đồ kết hợp: Doxorubicin + Vincristin + Prednisolon $\pm$ Cyclophosphamid.

5. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp theo WHO được luận án đề cập là gì?

Theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) được trích dẫn trong luận án, tiêu chuẩn xác định bệnh bạch cầu cấp là khi có tỷ lệ tế bào bất thường (tế bào non ác tính - blast) trong tủy xương đạt từ $\ge 20%$.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Thị Vinh An là công trình nghiên cứu thực nghiệm y sinh toàn diện về bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho tại Việt Nam, tích hợp đầy đủ các phương pháp từ tế bào học, dấu ấn miễn dịch, di truyền tế bào đến sinh học phân tử và phân tích hệ protein ($proteomics$). Công trình đã làm rõ đặc điểm tủy sinh máu trước và sau điều trị hóa chất, xác định tần suất 4 chuyển đoạn gen tái tổ hợp quan trọng ($BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX, AML1/TEL$) và bước đầu ứng dụng thành công kỹ thuật $nanoLC-MS/MS$ phát hiện các protein bệnh lý trong huyết thanh bệnh nhân. Các kết quả đạt được cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc cho công tác chẩn đoán phân loại, tiên lượng và định hướng điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bạch cầu cấp - hay ung thƣ máu cấp là một trong những bệnh máu hay gặp nhất trong những bệnh máu ác tính, bao gồm bạch cầu cấp dòng tủy và dòng lympho. Theo thống kê của viện sức khỏe Hoa kỳ, bạch cầu cấp có tỷ lệ mắc mới hàng năm là 4000 bệnh nhân, tỷ lệ tử vong do căn bệnh này xấp xỉ 1.700 bệnh nhân, đứng hàng thứ 5 trong những số những ca tử vong do ung thƣ tại Mỹ. Bạch cầu cấp dòng lympho là một bệnh lí ác tính, đặc trƣng bởi sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho có thay đổi về vật chất di truyền, dẫn đến lấn át các dòng tế bào tạo máu khác, rối loạn quá trình sinh tổng hợp tế bào máu trong cơ thể. Khoảng 60 - 70% bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có các biến đổi tế bào di truyền (nhƣ: trên lƣỡng bội nhiễm sắc thể, thiểu bội nhiễm sắc thể, chuyển đoạn, đảo đoạn, đứt gãy nhiễm sắc thể) [136].

Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều biến đổi gen đƣợc coi nhƣ nguyên nhân gây rối loạn quá trình biệt hóa tế bào. Các biến đổi gen trong bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B có tỷ lệ cao hơn bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng lympho T, các biến đổi gen này đƣợc coi nhƣ một trong các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới khả năng lui bệnh, nguy cơ tái phát và khả năng sống của ngƣời bệnh. Năm 2008, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đƣa ra hệ thống phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho dựa trên các bất thƣờng gen [36]. Đầu những năm 2000, khi ra đời công nghệ proteomic, cho phép phân tích sự biểu hiện của các protein trong cơ thể ngƣời, các nhà nghiên cứu nhận thấy, ngay khi bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp có bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng, do một sai sót nào đó trong quá trình dịch mã đã tạo ra các sản phẩm là các protein khác lạ.

Các protein này họat động nhƣ một enzym tác động vào quá 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trình biệt hóa tế bào hoặc tác động nhƣ một sản phẩm oncogen, làm rối loạn quá trình sinh trƣởng của tế bào dẫn đến tính ác tính- ung thƣ hóa. Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về bất thƣờng gen, nhƣng chƣa có nghiên cứu hệ thống nào về các biến đổi gen, biến đổi protein ở bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Trƣớc nhu cầu thiết thực phục vụ cho chẩn đoán và điều trị bệnh bạch cầu cấp chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm tế bào máu, tủy xƣơng, nhiễm sắc thể và protein bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho” với các mục tiêu sau: 1. Phân tích các chỉ số tế bào máu và tủy ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho trước và sau điều trị.

Phân tích các biến đổi nhiễm sắc thể, biến đổi gen, biến đổi protein ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho. Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm tủy sinh máu, protein, các biến đổi di truyền với kết quả điều trị bước đầu bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.