Nghiên Cứu Đặc Điểm Của Chủng Xạ Khuẩn Sinh Kháng Sinh Chống Bệnh Hại Cây Trồng

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp sinh học nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ khuẩn thsd sinh kháng sinh chống bệnh hại cây, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất

• Tác giả: Lê Thị Thanh Nga
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Thanh
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm TP.Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vi Sinh
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Chủng Xạ Khuẩn Sinh Kháng Sinh Chống Bệnh Hại Cây Trồng
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2001
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn
• 1.2. Hoạt tính sinh học của chất kháng sinh từ xạ khuẩn
• 1.3. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc xạ khuẩn
• 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo chất kháng sinh ở xạ khuẩn
• 1.5. Phòng chống dịch hại cây trồng

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đặc Điểm Chủng Xạ Khuẩn Sinh Kháng Sinh

Nghiên cứu về xạ khuẩn sinh kháng sinh là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Các chủng xạ khuẩn có khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh tự nhiên, giúp bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh hại cây trồng. Việc tìm hiểu đặc điểm của các chủng này không chỉ giúp nâng cao năng suất cây trồng mà còn bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới cho nền nông nghiệp bền vững.

1.1. Đặc Điểm Của Xạ Khuẩn Trong Nông Nghiệp

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn nhưng khác biệt ở khả năng hình thành bào tử. Đặc điểm này giúp xạ khuẩn tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt và sản sinh ra các chất có hoạt tính sinh học cao.

1.2. Vai Trò Của Kháng Sinh Tự Nhiên Trong Nông Nghiệp

Kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch hại. Chúng giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại, bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Việc ứng dụng kháng sinh tự nhiên trong nông nghiệp đang trở thành xu hướng phát triển bền vững.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Xạ Khuẩn

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng gặp phải nhiều thách thức. Việc phân lập và xác định các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh hiệu quả là một nhiệm vụ khó khăn. Ngoài ra, sự cạnh tranh giữa các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến khả năng sản xuất kháng sinh.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Chủng Xạ Khuẩn

Phân lập các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh là một thách thức lớn. Nhiều chủng xạ khuẩn không phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn, dẫn đến khó khăn trong việc nghiên cứu và ứng dụng.

2.2. Tác Động Của Môi Trường Đến Khả Năng Sinh Kháng Sinh

Môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng cần được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao nhất trong sản xuất kháng sinh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Xạ Khuẩn Sinh Kháng Sinh

Để nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh, các nhà khoa học thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phân lập, nuôi cấy, và phân tích hóa học để xác định hoạt tính sinh học của các chất kháng sinh được sản sinh.

3.1. Phương Pháp Phân Lập Và Nuôi Cấy

Phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất hoặc nước là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Sau đó, các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để đánh giá khả năng sinh kháng sinh.

3.2. Phân Tích Hóa Học Các Chất Kháng Sinh

Sau khi thu được các chủng xạ khuẩn, việc phân tích hóa học các chất kháng sinh là cần thiết. Các phương pháp như sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thường được sử dụng để xác định cấu trúc và hoạt tính của các chất này.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kháng Sinh Từ Xạ Khuẩn

Kháng sinh từ xạ khuẩn không chỉ có ứng dụng trong y học mà còn trong nông nghiệp. Chúng được sử dụng để phòng trừ các bệnh hại cây trồng, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Việc ứng dụng này đang được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ.

4.1. Ứng Dụng Trong Bảo Vệ Thực Vật

Kháng sinh từ xạ khuẩn có thể được sử dụng để kiểm soát các bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra. Chúng giúp giảm thiểu thiệt hại cho cây trồng và tăng cường sức đề kháng tự nhiên.

4.2. Tác Động Đến Năng Suất Cây Trồng

Việc sử dụng kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn đã chứng minh hiệu quả trong việc nâng cao năng suất cây trồng. Nghiên cứu cho thấy rằng các cây trồng được xử lý bằng kháng sinh có khả năng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Xạ Khuẩn Sinh Kháng Sinh

Nghiên cứu về xạ khuẩn sinh kháng sinh mở ra nhiều triển vọng cho nông nghiệp bền vững. Việc phát triển và ứng dụng các kháng sinh tự nhiên không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn bảo vệ môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Xạ Khuẩn

Nghiên cứu về xạ khuẩn sẽ tiếp tục được mở rộng, với nhiều ứng dụng mới trong nông nghiệp và y học. Các nhà khoa học đang tìm kiếm các chủng xạ khuẩn mới có khả năng sinh kháng sinh mạnh mẽ hơn.

5.2. Hướng Đi Mới Trong Nông Nghiệp Bền Vững

Việc ứng dụng kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn sẽ là một phần quan trọng trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững. Điều này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hàng năm, các loại dịch hại cây trồng gây thiệt hại ước tính khoảng 15% đến 20% tổng sản lượng nông nghiệp toàn cầu, làm suy giảm nghiêm trọng phẩm chất nông sản và đe dọa an ninh lương thực. Trong nhiều thập kỷ qua, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học tổng hợp đã gây ô nhiễm môi trường đất và nguồn nước, dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây bệnh và đe dọa trực tiếp sức khỏe cộng đồng. Trước yêu cầu cấp thiết về phát triển nền nông nghiệp bền vững, việc nghiên cứu khai thác các hoạt chất sinh học tự nhiên, đặc biệt là kháng sinh từ vi sinh vật, trở thành xu hướng tất yếu. Trong số hơn 6.000 chất kháng sinh tự nhiên được phát hiện trên thế giới, có khoảng 60% đến 70% hợp chất có nguồn gốc từ xạ khuẩn đất.

Nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề kiểm soát sinh học các bệnh hại nguy hiểm trên cây trồng bằng việc đánh giá toàn diện đặc điểm sinh học và khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn THsp. Mục tiêu cụ thể là xác định các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa, thiết lập các thông số lên men tối ưu gồm thành phần môi trường, độ pH, chế độ thông khí, thời gian nuôi cấy, đồng thời đánh giá phổ kháng sinh đối với vi khuẩn kiểm định, 5 loài nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm và khảo sát sơ bộ tác động lên tuyến trùng nốt sưng. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện thực nghiệm tại phòng thí nghiệm chuyên ngành Vi sinh học thuộc Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc sản xuất các chế phẩm thuốc trừ nấm sinh học đạt hiệu lực ức chế 100% đối với 3 loài nấm hại lúa và hoa màu chủ lực trong điều kiện in vitro.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết đối kháng vi sinh vật và cơ chế sinh tổng hợp các chất trao đổi chất bậc hai của xạ khuẩn đất. Theo học thuyết về hiện tượng kháng sinh học do Alexander Fleming và Selman Waksman khởi xướng, các vi sinh vật trong quá trình trao đổi chất có khả năng tiết ra các phân tử đặc hiệu nhằm ức chế hoặc tiêu diệt các đối tượng cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống. Đồng thời, nghiên cứu vận dụng mô hình động học lên men vi sinh vật hai pha: pha sinh trưởng tạo sinh khối và pha sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bậc hai.

Nghiên cứu làm rõ 5 khái niệm chuyên ngành cốt lõi:

1. Xạ khuẩn: Nhóm vi sinh vật nhân sơ đơn bào, phân bố rộng trong đất, có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh không vách ngăn và có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học đa dạng.
2. Chất kháng sinh sinh học: Hợp chất hữu cơ do sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế chọn lọc vi sinh vật gây hại ở nồng độ rất thấp mà không gây tồn dư độc hại trong chuỗi thức ăn.
3. Tuyến trùng nốt sưng: Nhóm ký sinh trùng thực vật thuộc chi Meloidogyne chuyên xâm nhiễm rễ cây, tiết hormone gây phì đại mô rễ tạo nốt sưng và làm suy kiệt cây trồng.
4. Phổ kháng vi sinh vật chọn lọc: Phạm vi tác động ức chế đặc hiệu của hoạt chất lên từng nhóm vi khuẩn Gram dương, Gram âm hoặc vi nấm xác định.
5. Lên men chìm hiếu khí: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng dịch thể có khuấy đảo và cung cấp oxy hòa tan liên tục.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu sinh học gồm chủng xạ khuẩn THsp được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, 2 chủng vi khuẩn kiểm định gồm Bacillus subtilis và Escherichia coli, cùng 5 chủng nấm gây bệnh thực vật do Trung tâm nghiên cứu sản xuất hóa chất nông dược cung cấp: Pyricularia oryzae gây đạo ôn, Rhizoctonia solani gây khô vằn, Fusarium oxysporum gây héo vàng, Sclerotium sp gây tiêm hạch và Colletotrichum sp gây thán thư. Mẫu tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp được phân lập trực tiếp từ rễ cây mã đề và đất canh tác nhiễm bệnh.

Quy trình phân tích thực nghiệm tuân thủ chặt chẽ các chuẩn mực vi sinh học:

• Quan sát đại thể và vi thể: Đánh giá khuẩn lạc trên môi trường dịch chiết khoai tây sau 7 đến 10 ngày và giải phẫu cuống sinh bào tử qua kỹ thuật phòng ẩm trên lam kính ở độ phóng đại 40 lần.
• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm: Sử dụng phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch với đường kính lỗ đục 8 mm và phương pháp nuôi cấy dịch thể. Cỡ mẫu cho mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần độc lập nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê.
• Tối ưu hóa điều kiện lên men: Khảo sát 5 môi trường dinh dưỡng gồm Gauze 1, A-4, A-12, A-4H và dịch chiết khoai tây trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường với tỷ lệ cấy giống 2% thể tích. Quá trình lên men được kiểm soát qua các thang pH từ 5 đến 9, tốc độ lắc từ 100 đến 150 vòng mỗi phút và theo dõi động học trong 120 giờ.
• Xác định sinh khối khô: Mẫu dịch lên men 5 ml được lọc, rửa bằng axit clohydric 0,1N và sấy khô ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi.
• Khảo nghiệm độ bền nhiệt: Dịch kháng sinh sau ly tâm 3.000 vòng mỗi phút trong 5 phút được xử lý nhiệt tại các mức 30°C, 40°C, 60°C, 80°C và 100°C trong các mốc thời gian 10, 20, 40 và 60 phút.

Lý do lựa chọn phương pháp khuếch tán lỗ thạch và lên men dịch thể lắc là khả năng định lượng trực tiếp hiệu lực kháng sinh thông qua đường kính vòng vô khuẩn và cho phép kiểm soát chính xác các yếu tố môi trường trong suốt chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng về đặc tính sinh học và khả năng ứng dụng của chủng xạ khuẩn THsp:

Thứ nhất, chủng THsp mang các đặc điểm hình thái và sinh lý điển hình của chi Streptomyces. Khuẩn lạc phát triển trên môi trường khoai tây sau 7 ngày đạt đường kính 8 mm, cấu trúc chắc mịn, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo các vòng tròn đồng tâm đổi từ màu trắng sang xám đen sau 30 ngày, khuẩn ty cơ chất màu vàng nâu và tiết sắc tố vàng ra môi trường. Dưới kính hiển vi, cuống sinh bào tử có dạng xoắn lò xo từ 2 đến 8 vòng xoắn, bào tử hình trụ. Chủng thể hiện hoạt tính amilaza ngoại bào mạnh với đường kính vòng phân giải tinh bột đạt 37 mm và hiệu suất phân giải đạt 27 mm, đồng thời có khả năng chịu nồng độ muối natri clorua cao lên đến 7,0%.

Thứ hai, hoạt chất kháng sinh do chủng THsp sinh ra có tính chọn lọc cao. Kháng sinh ức chế mạnh vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis với đường kính vòng vô khuẩn trung bình đạt 34,0 mm, trong khi hoàn toàn không ức chế vi khuẩn Gram âm Escherichia coli với đường kính vòng vô khuẩn bằng 0 mm.

Thứ ba, các thông số lên men đã được xác định tối ưu. Trong 5 môi trường thử nghiệm, môi trường A-4 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn đạt 34,6 mm, cao hơn 62,4% so với môi trường A-12 mặc dù môi trường A-12 cho sinh khối khô cao nhất đạt 43,6 g/l. Độ pH tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh là pH 7,0 đạt vòng kháng khuẩn 34,0 mm. Chế độ thông khí ở tốc độ lắc 150 vòng mỗi phút cho hoạt tính kháng sinh đạt 33,6 mm, tăng vượt trội so với đối chứng không lắc chỉ đạt 18,3 mm. Động học lên men đạt đỉnh tổng hợp kháng sinh tối ưu tại thời điểm 96 giờ nuôi cấy.

Thứ tư, dịch nuôi cấy thể hiện hoạt tính kháng nấm thực vật phổ rộng và độ bền nhiệt xuất sắc. Hoạt chất ức chế hoàn toàn 3 trong số 5 chủng nấm gây bệnh gồm Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum, đạt tỷ lệ ức chế 60% các đối tượng nấm khảo sát. Đáng chú ý, hoạt tính kháng sinh duy trì ổn định ngay cả khi đun cách thủy ở 100°C trong 60 phút với đường kính vòng kháng khuẩn đạt 30,0 mm so với 33,0 mm ở nhiệt độ phòng 30°C.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt về sinh khối và hiệu suất sinh kháng sinh giữa môi trường A-4 và A-12 được giải thích thông qua hiện tượng ức chế dị hóa cacbon. Môi trường A-12 chứa nồng độ dinh dưỡng quá cao kích thích sự tăng sinh khối tế bào trong pha sinh trưởng nhưng lại kìm hãm các enzyme tham gia tổng hợp kháng sinh trong pha thứ cấp. Ngược lại, môi trường A-4 với tỷ lệ bột đậu tương 10 g/l và glucoza 10 g/l tạo sự cân bằng dinh dưỡng, thúc đẩy chủng chuyển sang pha sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai hiệu quả.

Động học lên men phản ánh mối tương quan chặt chẽ giữa sự tích lũy sinh khối và nồng độ kháng sinh. Trong 24 giờ đầu, vi sinh vật tập trung phát triển sinh khối; từ 48 đến 96 giờ, sinh khối đạt giá trị cực đại đồng thời hoạt tính kháng sinh tăng vọt và đạt mức cao nhất tại 96 giờ trước khi khuẩn ty bắt đầu tự phân do cạn kiệt nguồn photphat và nitơ. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu kinh điển về xạ khuẩn đất, khẳng định 96 giờ là thời điểm thu hoạch dịch lên men lý tưởng. Dữ liệu động học này có thể được biểu diễn trực quan qua biểu đồ đường kép thể hiện đường cong sinh khối song hành cùng đường biến thiên đường kính vòng vô khuẩn theo thời gian. Tương tự, hiệu quả của các mức pH và tốc độ lắc có thể được so sánh hiệu quả thông qua biểu đồ cột phân nhóm.

Khả năng bền nhiệt cao ở 100°C trong 60 phút là đặc tính ưu việt hiếm thấy, mở ra triển vọng lớn cho công nghệ bào chế. Kháng sinh không bị biến tính bởi nhiệt độ cao giúp đơn giản hóa quy trình cô đặc, sấy phun và kéo dài thời hạn bảo quản chế phẩm sinh học ngoài đồng ruộng dưới điều kiện nắng nóng nhiệt đới.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ và sớm đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất, 4 giải pháp trọng tâm được đề xuất:

1. Nâng cấp quy mô lên men pilot từ 50 lít đến 100 lít: Thực hiện bởi các Trung tâm Công nghệ Sinh học Nông nghiệp trong thời gian 12 đến 18 tháng, áp dụng hệ thống nồi lên men tự động kiểm soát oxy hòa tan và bổ sung cơ chất nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi kháng sinh thêm khoảng 25% đến 30%.
2. Tinh sạch và giải mã cấu trúc hóa học phân tử: Các phòng thí nghiệm trọng điểm về Hóa sinh cần thực hiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp khối phổ MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR trong vòng 6 đến 12 tháng để xác định chính xác công thức hóa học và nhóm hoạt chất của kháng sinh do chủng THsp tiết ra.
3. Thử nghiệm đồng ruộng và đăng ký chế phẩm bảo vệ thực vật: Viện Bảo vệ Thực vật phối hợp với các doanh nghiệp sản xuất nông dược tiến hành khảo nghiệm diện rộng trên đồng ruộng trong 2 vụ canh tác liên tiếp khoảng 24 tháng, đánh giá hiệu lực phòng trị bệnh đạo ôn và khô vằn trên lúa với nồng độ xử lý thử nghiệm từ 0,5% đến 1,0%.
4. Mở rộng đánh giá độc tính sinh thái và hiệu lực diệt tuyến trùng: Bộ môn Bệnh cây cần tiến hành thử nghiệm in vivo trên cây trồng bầu đất trong thời hạn 12 tháng, đánh giá mức độ giảm mật độ nốt sưng của Meloidogyne spp trên cây cà chua và cây hồ tiêu, đồng thời kiểm tra độc tính đối với cá và thiên địch có ích.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ Sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn mực về phân lập, định danh hình thái vi sinh vật, kỹ thuật phòng ẩm và phương pháp luận thiết lập thông số động học lên men vi sinh.
2. Các nhà khoa học và nghiên cứu viên tại các Viện Bảo vệ Thực vật: Cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm giá trị về phổ kháng nấm hại cây trồng của xạ khuẩn, làm tiền đề phát triển các chủng vi sinh vật đối kháng bản địa.
3. Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và phân bón hữu cơ vi sinh: Tiếp cận công thức môi trường lên men A-4 kinh tế, các thông số kỹ thuật tối ưu hóa pH, độ lắc và dữ liệu về độ bền nhiệt để ứng dụng trực tiếp vào quy trình sản xuất thương mại.
4. Cán bộ khuyến nông và kỹ sư nông nghiệp hữu cơ: Hiểu rõ cơ chế tác động sinh học của xạ khuẩn để xây dựng các mô hình quản lý dịch hại tổng hợp IPM, giảm thiểu sự phụ thuộc vào hóa chất nông nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

Chủng xạ khuẩn THsp có những đặc điểm sinh lý nào đáng chú ý? Chủng THsp có khả năng sinh enzyme amilaza mạnh với hiệu suất phân giải tinh bột đạt 27 mm và chịu được nồng độ muối natri clorua lên tới 7,0%. Chủng sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ phòng từ 28°C đến 32°C và môi trường pH trung tính.

Tại sao môi trường A-4 lại cho hiệu quả kháng sinh vượt trội hơn môi trường A-12? Mặc dù môi trường A-12 cho sinh khối khô cao nhất đạt 43,6 g/l nhờ hàm lượng dinh dưỡng cao, môi trường này lại gây ức chế sinh tổng hợp kháng sinh. Môi trường A-4 tạo sự cân bằng dinh dưỡng tối ưu, giúp đường kính vòng vô khuẩn đạt 34,6 mm.

Chất kháng sinh từ chủng THsp ức chế được những loại nấm bệnh nào? Trong thử nghiệm in vitro, dịch nuôi cấy chủng THsp ức chế hoàn toàn 3 loại nấm nguy hiểm gồm nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae, nấm khô vằn Rhizoctonia solani và nấm héo vàng Fusarium oxysporum theo cả hai phương pháp đục lỗ và dịch thể.

Độ bền nhiệt của hoạt chất kháng sinh này có ý nghĩa gì trong thực tiễn? Kháng sinh từ chủng THsp giữ vững hoạt tính ức chế đạt đường kính 30,0 mm sau khi đun ở 100°C suốt 60 phút. Đặc tính này giúp chế phẩm chịu được nhiệt độ môi trường khắc nghiệt, thuận lợi cho quá trình sấy khô công nghiệp và bảo quản lâu dài.

Tiềm năng ứng dụng của chủng THsp trong phòng trừ tuyến trùng nốt sưng ra sao? Nghiên cứu đã bước đầu phân lập và xác định được các pha phát triển của tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp trên cây mã đề. Đây là cơ sở thực nghiệm quan trọng để tiếp tục triển khai các thử nghiệm ức chế tuyến trùng tuổi 2 trong điều kiện nhà lưới.

Kết luận

• Chủng xạ khuẩn THsp đã được định danh thuộc chi Streptomyces với các đặc tính hình thái, sinh hóa điển hình, khả năng thủy phân tinh bột mạnh và chịu mặn đến 7,0% NaCl.
• Hoạt chất kháng sinh tiết ra có tính chọn lọc cao, ức chế mạnh vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis nhưng không tác động lên vi khuẩn Gram âm Escherichia coli.
• Quy trình lên men tối ưu được thiết lập trên môi trường A-4 tại pH 7,0, tốc độ lắc 150 vòng mỗi phút và thu nhận hoạt tính kháng sinh cao nhất tại thời điểm 96 giờ.
• Dịch kháng sinh thể hiện hoạt tính ức chế hoàn toàn 3 loài nấm bệnh nguy hiểm gồm Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum và sở hữu độ bền nhiệt ấn tượng ở 100°C trong 60 phút.
• Nghiên cứu đóng góp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển các dòng thuốc bảo vệ thực vật sinh học thế hệ mới, hướng tới nền nông nghiệp sạch và bền vững.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung tinh sạch hoạt chất, giải mã cấu trúc phân tử và triển khai khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng trong giai đoạn 1 đến 2 năm tới.
• Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất nông dược sinh học được khuyến khích hợp tác chuyển giao công nghệ để thương mại hóa chế phẩm từ chủng xạ khuẩn THsp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Hàng năm các loại dịch hại cây tréng đã gây những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp, trước tình trạng đó con người sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ dịch hại nhằm hạn chế tác hại đo chúng gây ra. Việc sử dụng các loại hóa chất trong sản xuất nông nghiệp đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ con người, vật nuôi, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Để xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững cần hạn chế đến mức thấp nhất việc sử dụng các chất hóa học tổng hợp. Vì vậy, hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra các chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên ( kháng sinh, các chất kích thích sinh trưởng.

) để ứng dụng cho sản xuất nông nghiệp. Trong đó, các CKS có nguồn gốc vi sinh vật ( đặc biệt từ xạ khuẩn ) đang rất được chú ý. Để góp phan tìm hiểu khả năng ứng dụng của CKS từ xạ khuẩn trong sản xuất nông nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực phòng trừ bệnh hại cây trồng chúng tôi thực hiện để tài “ Nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ khuẩn THs, sinh kháng sinh chống bệnh hại cây trồng ”. SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang| LUẬN VAN TỐT NGHIỆP KHOA 1997-2001 GVHD: TS.

Trần Thị Thanh Phan I TONG QUAN TAI LIEU 0 lực nh sự nghiên cứu chat khang sini AS): Nhà vi sinh vật hoc người Anh Alexander Fleming là người đầu tiên đặt nén móng cho khoa học nghiên cứu CKS. Ông đã phát hiện ra penixilin trong khi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus trên đĩa thạch, tình cờ một bào tử nấm xanh trong không khí rơi vào. Ông quan sát thấy hiện tượng kỳ lạ: xung quanh khuẩn lạc của nấm xanh xuất hiện một vòng tròn trong suốt không có vi khuẩn này phát triển. Điều đó chứng tỏ loại nấm xanh đã sinh ra một chất ức chế và tiêu diệt S.Ong đã phân lập và định loại vi nấm này là Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn là penixilin.

Fleming đã cấy chủng nấm này vào môi trường dịch thể và phát hiện dịch nuôi cấy cũng có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Tháng 2-1929 Fleming công bố kết quả phát hiện vé khả năng ức chế vi khuẩn của nấm Penicillium notatum tại câu lạc bộ y học Luân Đôn. Thời đó do còn nhiều hạn chế của khoa học kỹ thuật penixilin chưa được tinh chế nên công trình của Fleming đã bị lãng quên. Khi chiến tranh thế giới thứ hai diễn ra ngày càng ác liệt, nhu cầu cấp bách phải chữa trị vết thương nhiễm trùng cho các binh lính thì pinixilin của Fleming mới được quan tâm trở lại.

Nhờ sự giúp đỡ của một nhóm các nhà khoa học bao gồm Abraham, Chain, Florey thì penixilin đã được tỉnh chế thành công và khẳng định giá trị to lớn của nó trong công tác điều trị bệnh nhiễm trùng. Kể từ đó penixilin chính thức được dùng để chữa bệnh và cũng từ đó trong lịch sử y học xuất hiện một kỷ nguyên mới, kỷ nguyên CKS chính thức ra đời. Tốc độ tìm kiếm CKS ngày càng được đẩy mạnh. Có thể nói thời kỳ hoàng kim của CKS là những năm 1939-1959.

Hàng loạt các CKS đã được tách chiết và xác định như: streptomixin, neomixin, gramixidin, clotetraxiclin, erytromixin. Và ngày nay nhiều CKS mới vẫn đang được SVTH:L2ThjThankNga—itst—‘“‘séSCSTM*;*;*;*;*‘* CMD: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS. Trần Thị Thanh tiến hành tìm kiếm và phát hiện. Nếu năm 1940 chỉ có một CKS đầu tiên là penixilin được phát hiện thì đến năm 1980 đã có tới 5.000 chất từ xạ khuẩn).

Tuy nhiên chỉ có 2- 4% CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học. CKS không những dùng để chữa bệnh nhiễm trùng mà còn sử dụng chống bệnh ung thư. Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng phòng chống bệnh và kích thích tăng trưởng cho động vật nuôi. CKS còn được nghiên cứu để sử dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản lương thực thực phẩm [5,trang 3].

Ở Việt Nam từ năm 1951-1952 giáo sư Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu sản xuất dịch lọc penixilin để rửa vết thương cho thương binh trong chiến dịch Thu - Đông. Năm 1955 dưới sự lãnh đạo của giáo sư Đặng Văn Ngữ những tinh thể penixilin đầu tiên được ra đời {6, trang 6]. Tuy nhiên do còn nhién nguyên nhân mà việc nghiên cứu sản xuất CKS của nước ta còn nhiều hạn chế. Công việc nghiên cứu CKS đã, đang và sẽ là để tài thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.

Có thể nói công nghệ sản xuất CKS đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Xa khuẩn và CKS có nguồn gốc xe khuẩn: 1. Đặc điểm của xa khuẩn: Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Về mặt cấu tạo, xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm mốc nhưng lại giống với vi khuẩn: kích thước xạ khuẩn tương tự kích thước vi khuẩn, xạ khuẩn chưa có nhân phân hoá, thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenluloza hay kitin, tế bào phân chia theo kiểu phân bào vô ty, xạ khuẩn không có giới tính.

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ khuẩn ty phát triển như hệ khuẩn ty của nấm mốc, phân nhánh và không có vách ngăn. Hệ khuẩn ty bao gồm rất nhiều khuẩn ty kết lại với nhau tạo thành từng búi. Kích thước và khối lượng của hệ khuẩn ty thường không ổn định, tuỳ thuộc vào từng loài và điều kiện nuôi cấy. SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 3 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS.

Trần Thị Thanh Trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn không làm đục môi trường như vi khuẩn mà mọc thành một lớp màng trên bể mặt hoặc lắng ở đáy bình thành từng đám như những sợi bông. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, dựa vào hướng phát triển trong và ngoài của hệ khuẩn ty đối với môi trường mà người ta chia thành hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC). KTCC cắm sâu vào môi trường để hấp thu nước và thức ăn. KTKS phát triển trên bể mặt môi trường.

Phần cuối của KTKS tạo thành cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử dài, ngắn khác nhau tuỳ từng loài xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử có thể thẳng, lượn sóng, uốn cong, xoắn lò xo, xoắn ốc, xoắn hình mốc câu. Chúng có thể phân bố theo kiểu mọc đơn, hay mọc vòng, mọc thành chùm.

Hình thái cuống sinh bào tử là đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình câu, hình ovan, hình trụ. Bé mặt bào tử có các dang: nhấn, dang gai, dang xù xi. KTKS phát triển tạo thành các khuẩn lạc thường chắc, xù xì, có dang vôi, dạng lông tơ, dạng nhung hay bột mịn.

chúng thường có các mau: đỏ, lục, xám, đen,. Một số xạ khuẩn tiết các sắc tố tan trong môi trường nuôi cấy. Kích thước của khuẩn lạc xạ khuẩn có thể thay đổi tùy từng loài và từng diéu kiện nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc thường có đường kính từ 0,5-2mm, có loài khuẩn lạc có đường kính 10mm. Khuẩn lạc xạ khuẩn có ba lớp: lớp vỏ ngoài, lớp trong, lớp giữa.

Lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, còn lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Về cấu tạo tế bào, tế bào xạ khuẩn có cấu tạo tương tự tế bào vi khuẩn. Gồm có: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, chất nhân, các hạt dự trữ, không bào. Thành tế bào: gồm 3 lớp: lớp ngoài dày khoảng 60 -120A°, khi khuẩn ty già lớp này có thể dày đến 150 - 200 A° được cấu tạo từ lipit.

Lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 A°, lớp trong dày khoảng 50 A°. Thành tế bào còn chứa nhiều enzim và tham gia vào quá trình trao đổi chất. SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang 4 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS. Trần Thị Thanh Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 50 nm, được cấu tạo bởi 2 thành phần photpholipit và protein.

Chức năng chủ yếu của mang là diéu hoà sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào. Tế bào chất của xạ khuẩn tương tự tế bào chất của vi khuẩn, bên trong chứa nucleotit, không bào, các hạt dự trữ. nhưng không có ty thể. Xa khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng sử dụng được là tỉnh bột, đường, axit hữu cơ, polysacarit, protein,.

Nguồn nitơ vô cơ thường dùng là muối amon, muối nitrat,. Nguồn nitơ hữu cơ thường là pepton, protein ,cao ngô ,cao nấm men. Đa số xạ khuẩn là sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường phát triển tốt trong môi trường pH trung tính, hơi kiểm.

ˆ + »* + Xa khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên : trong đất, nước ao hổ, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác. Quan trọng và đáng chú ý hơn cả là xạ khuẩn trong đất. Ở nhiều vùng trên thế giới số lượng xạ khuẩn trong đất chiếm 20-40% tổng số các vi sinh vật trong đất (6, Trang 7]. Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật.

Xạ khuẩn có mặt trong tất cả các loại đất và vào các mùa trong năm, đất giàu dinh dưỡng và lớp đất trên bể mặt (khoảng 40 cm) thường gặp số lượng rất lớn xạ khuẩn, tuy nhiên số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Xạ khuẩn là một trong những loại vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên, chúng tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá các hợp chất trong đất, trong nước. Trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn còn có thể sinh ra các loại chất hữu cơ: Vitamin nhóm B, một số axít hữu cơ như axít lactit, axetic.các loại enzim như: proteaza, amilaza .và các chất kích thích sinh trưởng thực vật. Một số loài thuộc chi Frankia có khả năng tạo nốt sin ở những cây không thuộc bộ đậu và có khả năng cố định nito.

SVTH: Lê Thị Thanh Nga Trang5 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHÓA 1997-2001 GVHD: TS. Trần Thị Thanh Đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, khoảng 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng này. Cho tới nay, hơn 6000 CKS được biết thì có khoảng 60% CKS có nguồn gốc xạ khuẩn [5, trang 4].