MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh là vấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ƣu tiên hàng đầu của các nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm trên thế giới. Cho đến nay, các nhàkhoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng nhƣ các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của ngƣời bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra. Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống ung thƣ.
Chẳng hạn, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) làcây bụi thuộc họ Lauraceae, trong quả Màng tang rất giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối đa trong quả làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi. Thành phần chính của tinh dầu làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng, kháng khuẩn, chống ung thƣ. Ngoài giá trị khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dƣợc liệu còn là môi trƣờng cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Theo các nghiên cứu, ƣớc tí nh khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay đƣợc sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn.
Gần đây, một số công bố cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên cây dƣợc liệu không chỉ có số lƣợng phong phú màcòn có sự đa dạng về chức năng nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học. Tuy nhiên, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang nói riêng và cây dƣợc liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề 2 tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh PhúThọ”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung chính: - Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ.
- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS). - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu 1.
Khái niệm xạ khuẩn nội sinh nh nghiên cứu trên thế giới công bố về tƣơng Hiện nay, nhiều công trì tác giữa thực vật vàvi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò nhƣ tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật, phân giải phospho khóhoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất. Phần lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn đƣợc phân lập từ đất, vùng rễ, bề mặt hoặc trong các môthực vật. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh đƣợc đƣa ra khi Smith và cộng sự (1957) phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong môcây càchua không nhiễm bệnh [58].
Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội sinh nhƣng định nghĩa của Bacon vàWhite (2000): „„VSV nội sinh lànhững VSV sinh trƣởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ‟‟ đã đƣợc các nhàVSV học thừa nhận [11]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hƣởng màcòn tăng cƣờng khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trƣởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất. Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn đƣợc chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39]. Song song với tác dụng dƣợc lý thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập kỷ qua [61], [62].
Xạ khuẩn đã đƣợc chứng minh khả năng tăng cƣờng, thúc đẩy tăng trƣởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cƣờng khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4]. Những hiểu biết về sinh lý vàmối tƣơng tác phân tử giữa xạ khuẩn vàthực vật lànhững đặc tí nh quan trọng để khai thác những đặc tí nh cólợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trƣởng thực vật và lĩnh vực khác. 4 Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai tròquan trọng của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất cóhoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống.
Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh đƣợc chứng minh làrất đa dạng về mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng. Vìvậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất cóhoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí nh kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu tự nhiên đang là hƣớng nghiên cứu triển vọng của các nhàkhoa học trên thế giới. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cƣ trú trong mô thực vật bị ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố môi trƣờng nhƣ: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lƣợng mƣa, cƣờng độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ. Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật [50].
Theo các công trình công bố, quátrình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử lýbề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trƣớc khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột trong những tác nhân oxy hóa phổ biến đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật đƣợc ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nƣớc vô trùng nhằm loại bỏ lƣợng NaOCl còn dƣ.
Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng [62]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với qua trì nh phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bƣớc khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp 5 ethanol vàmột số chất khử trùng khác thìkhông phân lập đƣợc xạ khuẩn nội sinh.
Hiệu quả khử trùng bề mặt đƣợc tăng cƣờng bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [13]. Phần mẫu đã khử trùng đƣợc đặt vào trên môi trƣờng thạch thí ch hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quátrì nh phân lập, các nhà nghiên cứu thƣờng gặp phải làVSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trƣởng của vi khuẩn vànấm không mong muốn cũng nhƣ tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trƣờng chọn lọc đã đƣợc sử dụng nhƣ: môi trƣờng thạch humic acid-vitamin, môi trƣờng thạch casein tinh bột, cao nấm men, môi trƣờng S… [14], [35], [39].
Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh vànâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn vànấm [30], [51]. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật Phần lớn xạ khuẩn nội sinh cóthể sống trong các môthực vật vàkhông gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quátrình phát triển bình thƣờng của cây. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn đƣợc nhiều nhàkhoa học nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thƣ, enzyme, chất kí ch thích sinh trƣởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật. Kháng ung thư, kháng viêm Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tí nh kháng, ức chế tế bào ung thƣ từ xạ khuẩn nội sinh đang là hƣớng nghiên cứu mới của các nhàkhoa học trên thế giới.
Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định nh sinh học đƣợc tiếp rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất cóhoạt tí nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học cónguồn gốc từ thực vật 6 nh nuôi cấy VSV, vídụ nhƣ chất kháng tế bào ung thƣ paclitaxel nhờ quátrì phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp. vàmột số nấm cộng sinh khác [39].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới cótên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) đƣợc phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc cótác dụng điều trị ung thƣ, hoạt huyết. Kết quả kiểm tra hoạt tí nh sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 ở nồng độ ức chế lần lƣợt là0,07 và 3,17 µM, nhƣng không có hoạt tí nh kháng Staphylococcus aureus và vi khuẩn lao [40], [72].