Khám Phá Khả Năng Đối Kháng Của Streptomyces sp. VNUA27 Đối Với Vi Khuẩn Gây Bệnh

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, tạo điều kiện thuận lợi… 80 trang · Vietnam National University of Agriculture · 2022.

• Tác giả: Trinh Minh Phuong
• Người hướng dẫn: Dr. Trinh Xuan Hoat
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Khám Phá Khả Năng Đối Kháng Của Streptomyces sp. VNUA27 Đối Với Vi Khuẩn Gây Bệnh
• Loại tài liệu: undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENT
• 1. PART I: INTRODUCTION
• 1.1. Research purpose and content
• 2. PART II: LITERATURE REVIEWS
• 2.1. Overview of Actinomycetes, genus Streptomyces, Streptomyces sp.
• 3. PART III: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Location and time of the study
• 3.2. Screening the antagonistic ability to pathogenic microorganisms of Streptomyces sp.
• 3.3. Biochemical characteristics of Streptomyces sp.
• 3.3.1. The ability to produce extracellular enzymes
• 3.3.2. The ability to produce IAA
• 3.3.3. The ability to produce Hydro sulfide (H2S)
• 3.3.4. The ability to produce indole
• 3.3.5. The ability to utilize citrate
• 3.3.6. The ability to hydrolyze gelatin
• 3.3.7. The ability to solubilize phosphate
• 3.3.8. The ability to decompose ureases
• 3.3.9. The ability to produce siderophores
• 4. PART IV: RESULT AND DISCUSSION
• 4.1. Antagonistic ability of Streptomyces sp.
• 4.2. Biochemical characteristics of Streptomyces sp.
• 4.2.1. The ability to produce extracellular enzymes
• 4.2.2. The ability to produce IAA
• 4.2.3. The ability to produce Hydrosulfide (H2S)
• 4.2.4. The ability to produce indole
• 4.2.5. The ability to utilize citrate
• 4.2.6. The ability to liquefaction gelatin
• 4.2.7. The ability to solubilize phosphate
• 4.2.8. The ability to decompose ureases
• 4.2.9. The ability to produce siderophores
• 5. PART V: CONCLUSION AND SUGGESTION
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• ABSTRACT

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Streptomyces sp

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh. Các vi khuẩn gây bệnh này gây ra thiệt hại lớn cho năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay, kiểm soát sinh học đang được xem là một giải pháp cần thiết để thay thế việc sử dụng các loại thuốc hóa học. Mục tiêu là khám phá thêm các nguồn vật liệu sinh học có khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh cho cây trồng. Nghiên cứu này tập trung vào Streptomyces sp. VNUA27, một chủng có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum, phát triển tốt ở nhiệt độ 30oC và 37oC. Chủng này cũng sử dụng tốt các nguồn đường khác nhau (Maltose, Sucrose, Cellulose và D-Manitol) và phát triển tốt ở nồng độ muối từ 0% - 3% và pH 4-11.

1.1. Nguồn Gốc và Đặc Điểm Sinh Học Của Chủng Streptomyces

Actinomycetes, đặc biệt là chủng Streptomyces, là vi khuẩn Gram dương với hàm lượng guanine + cytosine (G + C) cao. Chúng thuộc họ Streptomycetaceae và bộ Actinomycetales. Streptomyces thường được tìm thấy trong môi trường nước mặn và nước ngọt, đất vùng rễ, phân trộn và phân trùn quế. Giống này bao gồm các Actinomycetes hiếu khí Gram dương, có tính oxy hóa cao, tạo thành các cơ chất phân nhánh rộng rãi và sợi nấm trên không. Sợi nấm chứa axit LL-diaminopimelic (L-DAP) và glycine nhưng không chứa đường đặc trưng trong thành tế bào. Thành phần DNA có tỷ lệ 69 đến 73 mol% guanine (G) cộng với cytosine (C). Phân mảnh của sợi nấm cơ chất không thường xuyên và bào tử hiếm khi được tạo ra trên sợi nấm cơ chất. Các sợi nấm trên không thường mang các chuỗi bào tử dài (> 50 bào tử), nhưng ở một số loài nhất định, các chuỗi bào tử ngắn hơn xảy ra.

1.2. Vai Trò Của Streptomyces Trong Kiểm Soát Bệnh Hại Cây Trồng

Streptomyces đóng vai trò quan trọng trong chu trình vật chất tự nhiên và sản xuất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng tuyến trùng. Trong số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật tạo ra, hơn 10.000 hợp chất được phân lập từ Actinomycetes. Hơn 80% các hợp chất này là các loại kháng sinh khác nhau. Nghiên cứu chỉ ra rằng cứ 1.000 Actinomycetes được phân lập ngẫu nhiên thì khoảng 10 sẽ sản xuất streptomycin và 4 sẽ sản xuất tetracycline. Do đó, Actinomycetes là một trong những nguồn tiềm năng của các chất có hoạt tính sinh học.

II. Vấn Đề Bệnh Hại Do Vi Khuẩn và Nấm Thách Thức Nông Nghiệp

Bệnh hại do vi khuẩn gây bệnh và nấm gây ra là một vấn đề nghiêm trọng trong nông nghiệp, gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng. Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học để phòng trừ sinh học các bệnh này có thể gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Các vi khuẩn gây bệnh như Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis và các loại nấm như Fusarium solani, Colletotrichum gloeosporioides gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả hơn để kiểm soát các bệnh này là vô cùng cần thiết.

2.1. Các Loại Vi Khuẩn Gây Bệnh Cây Trồng Phổ Biến

Các vi khuẩn gây bệnh như Xanthomonas axonopodis gây ra các bệnh đốm lá, thối nhũn trên nhiều loại cây ăn quả có múi. Ralstonia solanacearum gây ra bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà chua, khoai tây và nhiều loại cây trồng khác. Clavibacter michiganensis gây ra bệnh ung thư trên cây cà chua và bệnh thối vòng trên cây khoai tây. Các bệnh này có thể gây ra thiệt hại nặng nề cho năng suất và chất lượng của cây trồng, ảnh hưởng đến kinh tế của người nông dân. Theo tài liệu gốc, Xanthomonas axonopodis gây ra các bệnh nhiễm trùng và tổn thương trên lá, thân và quả của cây có múi; Ralstonia solanacearum gây ra bệnh héo rũ lá nghiêm trọng ở nhiều loại rau và cây trồng.

2.2. Tác Hại Của Nấm Bệnh Đối Với Nông Nghiệp

Các loại nấm như Fusarium solani gây ra bệnh thối rễ, thối thân trên nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ dinh dưỡng và nước của cây. Colletotrichum gloeosporioides gây ra bệnh thán thư trên nhiều loại cây ăn quả và rau màu, làm giảm chất lượng sản phẩm và gây thiệt hại kinh tế lớn. Theo tài liệu gốc, Fusarium solani là một tác nhân gây bệnh cây trồng quan trọng, đặc biệt là các bệnh thối rễ và thối thân. Colletotrichum gloeosporioides cũng là một loại nấm gây bệnh phổ biến, gây ra bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khả Năng Đối Kháng Của Streptomyces VNUA27

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp khoa học để đánh giá khả năng đối kháng của Streptomyces sp. VNUA27 đối với các vi khuẩn gây bệnh và nấm. Các phương pháp bao gồm: phân lập và định danh Streptomyces từ đất, thử nghiệm in vitro để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của Streptomyces sp. VNUA27. Các kết quả thu được sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của chủng Streptomyces này trong kiểm soát sinh học bệnh hại cây trồng.

3.1. Phân Lập và Định Danh Chủng Streptomyces sp. VNUA27

Việc phân lập Streptomyces được thực hiện từ các mẫu đất thu thập tại khu vực nghiên cứu. Các mẫu đất được xử lý và nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu để chọn lọc các chủng Streptomyces. Sau khi phân lập, các chủng Streptomyces được định danh bằng các phương pháp sinh hóa và phân tích di truyền (ví dụ: phân tích trình tự gen 16S rRNA). Việc định danh chính xác là rất quan trọng để xác định chủng Streptomyces và so sánh với các chủng đã biết.

3.2. Thử Nghiệm In Vitro Đánh Giá Hoạt Tính Đối Kháng

Các thử nghiệm in vitro được thực hiện để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của Streptomyces sp. VNUA27 đối với các vi khuẩn gây bệnh và nấm mục tiêu. Phương pháp thường được sử dụng là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (agar diffusion assay), trong đó Streptomyces được cấy lên đĩa thạch và sau đó cấy các vi khuẩn gây bệnh hoặc nấm xung quanh. Vùng ức chế sinh trưởng xung quanh Streptomyces cho thấy hoạt tính đối kháng. Đo lường hiệu quả đối kháng.

IV. Kết Quả Khám Phá Khả Năng Kháng Khuẩn Của VNUA27

Kết quả nghiên cứu cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh và nấm quan trọng. Phổ kháng khuẩn của Streptomyces sp. VNUA27 cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum và Clavibacter michiganensis. Ngoài ra, Streptomyces sp. VNUA27 cũng có khả năng ức chế sự phát triển của Fusarium solani và Colletotrichum gloeosporioides. Những kết quả này cho thấy tiềm năng của Streptomyces sp. VNUA27 trong kiểm soát sinh học bệnh hại cây trồng.

4.1. Hiệu Quả Đối Kháng Với Vi Khuẩn Gây Bệnh

Các thử nghiệm đối kháng cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng ức chế sự phát triển của Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum và Clavibacter michiganensis. Vùng ức chế sinh trưởng xung quanh Streptomyces cho thấy hoạt tính kháng khuẩn. Hiệu quả ức chế khác nhau tùy thuộc vào loại vi khuẩn gây bệnh. Kết quả này cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 có tiềm năng sử dụng trong phòng trừ sinh học các bệnh do vi khuẩn gây ra trên cây trồng.

4.2. Hoạt Tính Kháng Nấm Của Streptomyces sp. VNUA27

Streptomyces sp. VNUA27 cũng cho thấy hoạt tính kháng nấm đối với Fusarium solani và Colletotrichum gloeosporioides. Các thử nghiệm đối kháng cho thấy Streptomyces có khả năng ức chế sự phát triển của các loại nấm này. Cơ chế đối kháng có thể liên quan đến việc sản xuất các chất kháng sinh hoặc enzyme phân hủy thành tế bào nấm. Kết quả này cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 có tiềm năng sử dụng trong phòng trừ sinh học các bệnh do nấm gây ra trên cây trồng.

V. Đặc Điểm Sinh Hóa Của Streptomyces VNUA27 Tiềm Năng Ứng Dụng

Nghiên cứu cũng đánh giá các đặc điểm sinh hóa của Streptomyces sp. VNUA27, bao gồm khả năng sản xuất enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, chitinase), sản xuất IAA, sản xuất H2S, sản xuất indole, sử dụng citrate, thủy phân gelatin, hòa tan phosphate và sản xuất siderophore. Những đặc điểm này có thể đóng vai trò quan trọng trong cơ chế đối kháng của Streptomyces sp. VNUA27 và cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng nông nghiệp của chủng Streptomyces này.

5.1. Khả Năng Sản Xuất Enzyme Ngoại Bào Của Streptomyces sp. VNUA27

Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào quan trọng, bao gồm amylase, protease, cellulase và chitinase. Các enzyme này có thể giúp Streptomyces phân hủy các chất hữu cơ trong môi trường và cũng có thể đóng vai trò trong cơ chế đối kháng bằng cách phân hủy thành tế bào của vi khuẩn gây bệnh hoặc nấm. Theo tài liệu gốc, Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng sản xuất enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, chitinase, catalase).

5.2. Ảnh Hưởng Của Streptomyces VNUA27 Đến Sinh Trưởng Cây Trồng

Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng sản xuất IAA (indole-3-acetic acid), một hormone thực vật quan trọng có thể thúc đẩy sinh trưởng cây trồng. Ngoài ra, Streptomyces cũng có khả năng hòa tan phosphate, giúp cây trồng hấp thụ phosphate dễ dàng hơn. Các đặc điểm này cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 có thể có tác động tích cực đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Ứng dụng nông nghiệp.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Streptomyces VNUA27

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh và nấm quan trọng, đồng thời có nhiều đặc điểm sinh hóa có lợi cho sinh trưởng cây trồng. Những kết quả này cho thấy Streptomyces sp. VNUA27 là một nguồn vi sinh vật đối kháng tiềm năng để phát triển các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp hữu cơ và phát triển bền vững. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định cơ chế đối kháng, thử nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả trên cây trồng và phát triển các chế phẩm sinh học từ Streptomyces sp. VNUA27.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Hữu Cơ

Streptomyces sp. VNUA27 có tiềm năng lớn để sử dụng trong nông nghiệp hữu cơ như một giải pháp phòng trừ sinh học thay thế cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Việc sử dụng chế phẩm sinh học từ Streptomyces sp. VNUA27 có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người. Nông nghiệp hữu cơ, phát triển bền vững.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Tiếp Theo Cho Streptomyces VNUA27

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định cơ chế đối kháng của Streptomyces sp. VNUA27 (ví dụ: xác định các chất kháng sinh được sản xuất), thử nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả trên cây trồng trong điều kiện thực tế, và phát triển các chế phẩm sinh học ổn định và hiệu quả từ Streptomyces sp. VNUA27. Phân tích di truyền.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam là quốc gia nông nghiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm. Đây là điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng, nhưng đồng thời cũng là môi trường lý tưởng cho sự phát sinh, lây lan của các loài vi sinh vật gây bệnh thực vật. Những dịch hại này gây tổn thất nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất nông sản. Theo thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO, 1984), bệnh hại cây trồng hàng năm không chỉ làm sụt giảm sản lượng mà còn làm gia tăng đáng kể chi phí sản xuất.

Để bảo vệ mùa màng, các biện pháp hóa học bảo vệ thực vật đã được áp dụng phổ biến trong thời gian dài tại Việt Nam. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng: phá hủy cân bằng hệ sinh thái, để lại dư lượng độc hại trong đất và nông sản, làm ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người và kích thích sự hình thành các chủng vi sinh vật kháng thuốc. Hội nghị tham vấn khu vực châu Á - Thái Bình Dương của FAO (1992) đã khẳng định quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) lấy phòng trừ sinh học làm nền tảng là hướng đi tất yếu nhằm kiểm soát quần thể vi sinh vật gây hại.

Trong số các tác nhân sinh học tiềm năng, xạ khuẩn (Actinomycetes)—đặc biệt là chi Streptomyces—chiếm vị trí nổi bật nhờ khả năng tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Trong số hơn 23.000 hoạt chất sinh học do vi sinh vật tạo ra, có hơn 10.000 hợp chất được phân lập từ xạ khuẩn, và trên 80% trong số đó là các chất kháng sinh. Kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây về chủng Streptomyces sp. VNUA27 (được định danh là Streptomyces neyagawaensis, có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum, sinh trưởng tốt ở 30°C và 37°C, pH 4–11, độ mặn 0–3%), đề tài được thực hiện nhằm tiếp tục mở rộng khảo sát hoạt tính đối kháng và các đặc tính sinh hóa của chủng xạ khuẩn này.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

1. Thu thập và duy trì các chủng vi khuẩn gây bệnh thực vật: Xanthomonas axonopodis (gây bệnh loét trên cây có múi), Ralstonia solanacearum (gây bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây họ Cà) và Clavibacter michiganensis (gây bệnh thối vòng trên cà chua và khoai tây).
2. Thu thập và duy trì các chủng nấm gây bệnh thực vật: Fusarium solani (chủng HT39) và Colletotrichum gloeosporioides (chủng HD01).
3. Đánh giá khả năng đối kháng của Streptomyces sp. VNUA27 đối với 3 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm gây bệnh nêu trên.
4. Nghiên cứu các đặc tính sinh hóa, khả năng sinh enzyme ngoại bào và khả năng sinh các hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật của Streptomyces sp. VNUA27.

Đối tượng nghiên cứu là chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27 cùng các chủng vi sinh vật kiểm chứng gây bệnh cây trồng. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian từ tháng 8/2021 đến tháng 1/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và phân loại sinh học

Xạ khuẩn (Actinomycetes, hiện được xếp vào ngành Actinobacteria) là nhóm vi khuẩn Gram dương hoại sinh, có bộ gen chứa tỷ lệ Guanine-Cytosine cao (69–73 mol%). Cấu trúc hình thái đặc trưng bởi hệ sợi phân nhánh gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh, sinh sản bằng chuỗi bào tử. Chi Streptomyces chiếm khoảng 50% tổng số xạ khuẩn trong đất, được Waksman và Henrici đề xuất từ năm 1943. Xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng tiết chất hữu cơ geosmin tạo mùi đất đặc trưng, đồng thời sản sinh nhiều loại kháng sinh quan trọng (streptomycin, oxytetracycline, neomycin, validamycin, abamectin...) và các enzyme phân giải chất hữu cơ.

Về phía các vi sinh vật kiểm chứng gây bệnh thực vật:

• Xanthomonas axonopodis: Vi khuẩn Gram âm, hình que, có một lông roi ở cực, hiếu khí bắt buộc, sinh sắc tố vàng xanthomonadin đặc trưng, gây bệnh loét trên lá, thân và quả cây có múi.
• Ralstonia solanacearum: Vi khuẩn Gram âm truyền qua đất, thuộc nhóm $\beta$-proteobacteria, có phổ ký chủ rộng trên hơn 450 loài thuộc 50 họ thực vật (đặc biệt là họ Cà Solanaceae), gây tổn thất năng suất lên tới 91% ở cà chua và 90% ở khoai tây.
• Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus: Vi khuẩn Gram dương, hình que hơi hình chùy, hiếu khí, gây bệnh thối vòng mạch dẫn ở củ và thân cây khoai tây.
• Fusarium solani: Phức hợp loài nấm sợi thuộc ngành Ascomycota, khuẩn lạc màu trắng xốp chuyển xanh lam hoặc nâu nhạt, gây thối rễ, lở cổ rễ trên đậu, khoai tây, bầu bí.
• Colletotrichum gloeosporioides: Nấm gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây ăn quả nhiệt đới (xoài, đu đủ, bơ, thanh long), hình thành đĩa cành (acervuli) dưới biểu bì và bào tử phân sinh hình trụ không màu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Đề tài sử dụng hoàn toàn phương pháp thực nghiệm vi sinh học trong phòng thí nghiệm:

1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn: Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (agar disk-diffusion method) theo Balouiri và cộng sự (2016). Vi khuẩn kiểm chứng được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng ở 30°C (200 vòng/phút, 24 giờ) rồi trải đều lên đĩa thạch LB. Xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27 được nuôi trên môi trường Gause I lỏng ở 30°C (200 vòng/phút, 7 ngày). Đục lỗ thạch trên đĩa vi khuẩn kiểm chứng, tra 100 µL dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào giếng thạch, ủ ở 30°C trong 6–12 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn hình thành.
2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm: Áp dụng kỹ thuật đồng nuôi cấy (antifungal co-culture method) trên đĩa thạch Potato Dextrose Agar (PDA) 90 mm theo Rahman và cộng sự (2009). Miếng thạch chứa xạ khuẩn (4–5 mm) được cấy cách mép đĩa 20 mm, đối diện và song song với miếng thạch nấm kiểm chứng cách mép đối diện 20 mm. Đĩa đối chứng cấy nấm ở tâm đĩa. Đo bán kính phân tán của nấm đối chứng ($d_0$) và bán kính phân tán của nấm ở phía tiếp giáp xạ khuẩn ($d_1$) sau 6 ngày ủ ở 25°C. Phần trăm ức chế sinh trưởng bán kính (PIRG) được xác định theo công thức của Skidmore và Dickinson (1976): $$\text{PIRG (%)} = \frac{d_0 - d_1}{d_0} \times 100$$
3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào: Sử dụng môi trường thạch khoáng (Mineral salt agar) bổ sung cơ chất đặc hiệu theo Gulve & Deshmukh (2011) bằng phương pháp cấy điểm ở 28–30°C trong 7 ngày:
   • Amylase: Cơ chất tinh bột tan 1%, phát hiện bằng dung dịch Lugol 1%.
   • Protease: Cơ chất gelatin 0,5–1% hoặc casein, hiện màu bằng dung dịch Amido Black 10B 0,1%.
   • Cellulase: Cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC), phát hiện bằng Lugol 1%.
   • Chitinase: Cơ chất chitin 1%, phát hiện bằng Lugol 1%.
   • Catalase: Nhỏ trực tiếp dung dịch $H_2O_2$ lên khuẩn lạc xạ khuẩn; phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí thoát ra.
4. Phương pháp định lượng Indole-3-acetic acid (IAA): Nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường ISP2 lỏng bổ sung tryptophan 0,2% ở 30°C trong 5–7 ngày. Thu 1 mL dịch trong sau ly tâm lạnh ở 4°C, phối trộn với 2 mL thuốc thử Salkowski ($FeCl_3$ 0,5 M, $H_2SO_4$ 98%, nước cất), ủ tối 10–15 phút, đo mật độ quang học $OD_{530}$. Hàm lượng IAA ($\mu\text{g/mL}$) được ngoại suy từ đường chuẩn IAA xây dựng ở các nồng độ từ 0 đến 8 $\mu\text{g/mL}$.
5. Các thử nghiệm sinh hóa định danh khác:
   • Sinh $H_2S$: Nuôi trên thạch nghiêng Lead Acetate Agar plus, treo dải giấy lọc vô trùng tẩm $Pb(CH_3COO)_2$ 5% cách mặt thạch 1 cm; giấy chuyển sang màu nâu sẫm khi có khí $H_2S$ sinh ra.
   • Sinh Indole: Nuôi trong Tryptophan broth ở 30°C trong 5–7 ngày, thêm 3–5 giọt thuốc thử Kovac; phản ứng dương tính tạo vòng màu đỏ trên bề mặt.
   • Thử nghiệm Methyl Red (MR) & Voges-Proskauer (VP): Nuôi trong môi trường MR-VP (glucose phosphate) ở 30°C trong 5–7 ngày; thử nghiệm MR dùng chỉ thị methyl red (dương tính màu đỏ), thử nghiệm VP bổ sung dung dịch NaOH 40% và tinh thể creatine (dương tính màu đỏ hồng tạo acetoin).
   • Đồng hóa Citrate: Môi trường Simmons citrate chứa chỉ thị bromothymol blue; đổi màu từ xanh lục sang xanh lam thẫm khi kiềm hóa môi trường.
   • Hóa lỏng Gelatin: Nuôi cấy trong ống thạch chứa 120 g/L gelatin ở 30°C trong 7–10 ngày, ngâm đá ở 5°C trong 15–30 phút để xác nhận tính lỏng do enzyme gelatinase.
   • Phân giải Phosphate khó tan: Cấy trên môi trường Pikovskaya ở 28°C trong 7–10 ngày, ghi nhận vòng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc.
   • Phân giải Ure (Urease test): Nuôi cấy trong Stuart's Urea broth chứa phenol red 0,04% ở 30°C trong 7 ngày; môi trường chuyển từ màu vàng sang hồng cánh sen khi có urease.
   • Sinh Siderophore: Khảo sát khả năng tiết chất mang sắt ngoại bào.

---

Nội dung chính theo từng chương

Part I: Introduction

Chương này trình bày cơ sở thực tiễn của ngành nông nghiệp Việt Nam, nhấn mạnh vai trò của các giải pháp phòng trừ sinh học trong chiến lược IPM của FAO nhằm thay thế dần hóa chất độc hại. Tác giả nêu rõ mục tiêu, các nội dung nghiên cứu thực hiện đối với chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27 cùng danh mục các chủng vi khuẩn (X. axonopodis, R. solanacearum, C. michiganensis) và nấm (F. solani, C. gloeosporioides) gây bệnh thực vật cần sàng lọc.

Part II: Literature Reviews

Chương tổng quan tài liệu hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về:

• Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái học, cấu trúc thành tế bào (chứa LL-DAP và glycine), thành phần hóa phân loại và giá trị ứng dụng của xạ khuẩn chi Streptomyces trong nông nghiệp và y dược.
• Đặc điểm sinh học, vòng đời xâm nhiễm, triệu chứng bệnh và mức độ thiệt hại kinh tế do 3 loài vi khuẩn gây bệnh (Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis) và 2 loài nấm gây bệnh (Fusarium solani, Colletotrichum gloeosporioides) gây ra trên các loại cây trồng kinh tế.
• Tổng quan các kết quả nghiên cứu gần đây về hoạt tính kháng sinh học, cơ chế tiết enzyme phân giải vách tế bào nấm bệnh và khả năng sinh các chất kích thích sinh trưởng (PGP) của xạ khuẩn đối với cây trồng.

Part III: Materials and Methods

Chương phương pháp mô tả chi tiết địa điểm, mốc thời gian thực hiện, chủng giống vi sinh vật và trang thiết bị nghiên cứu. Tác giả chuẩn hóa công thức thành phần hóa học của 10 môi trường nuôi cấy chuyên dụng (Simmons citrate, Lead Acetate Agar plus, Stuart's Urea broth, MR-VP, Gause I, LB, Tryptophan broth, PDA, Mineral salt agar, ISP2, Pikovskaya) cùng quy trình chi tiết cho từng phép thử nghiệm đối kháng vi sinh vật, khảo sát hệ enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, chitinase, catalase), định lượng IAA bằng phương pháp Salkowski và chuỗi 8 thử nghiệm hóa sinh định danh.

Part IV: Result and Discussion

Chương kết quả và thảo luận trình bày số liệu và hình ảnh thực nghiệm thu được:

• Kết quả đối kháng đối với 3 chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua kích thước vòng ức chế hình thành trên thạch.
• Kết quả đối kháng đối với 2 chủng nấm gây bệnh thực vật (F. solani HT39 và C. gloeosporioides HD01), tính toán chỉ số ức chế sinh trưởng bán kính PIRG (%).
• Khả năng sinh hệ enzyme ngoại bào: Ghi nhận vòng phân giải cơ chất của amylase, protease, cellulase, chitinase và hiện tượng sủi bọt khí của catalase.
• Khả năng sinh IAA: Xây dựng đồ thị đường chuẩn IAA nồng độ 0–8 $\mu\text{g/mL}$ ở bước sóng 530 nm và xác định hàm lượng IAA do chủng tiết ra.
• Các chỉ tiêu sinh hóa: Kết quả thử nghiệm sinh $H_2S$, thử nghiệm Indole, phản ứng MR, phản ứng VP, khả năng sử dụng nguồn carbon citrate, khả năng làm lỏng gelatin ở 5°C, khả năng hòa tan phosphate trên môi trường Pikovskaya, hoạt tính urease làm đổi màu chỉ thị phenol red và khả năng sinh siderophore.

Part V: Conclusion and Suggestion

Chương kết luận tổng hợp toàn bộ các năng lực sinh học nổi bật của Streptomyces sp. VNUA27 về cả khả năng đối kháng mầm bệnh lẫn các đặc tính sinh hóa hữu ích; đưa ra các kiến nghị nghiên cứu chuyên sâu về tinh sạch hoạt chất và thử nghiệm thực địa.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

Khóa luận đã xác định một cách có hệ thống các hoạt tính đối kháng và đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng Streptomyces sp. VNUA27 (Streptomyces neyagawaensis):

Nhóm chỉ tiêu khảo sát	Phép thử nghiệm / Cơ chất	Kết quả thể hiện
Đối kháng vi khuẩn	Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis	Hình thành vòng vô khuẩn trên đĩa thạch LB (phương pháp đục lỗ thạch)
Đối kháng nấm bệnh	Fusarium solani (HT39), Colletotrichum gloeosporioides (HD01)	Ức chế sinh trưởng sợi nấm trên đĩa PDA (xác định qua chỉ số PIRG %)
Enzyme ngoại bào	Amylase (tinh bột 1%), Protease (gelatin/casein), Cellulase (CMC), Chitinase (chitin 1%)	Tạo vòng sáng phân giải cơ chất trên môi trường thạch khoáng (nhuộm Lugol 1% / Amido Black)
	Catalase	Dương tính (sủi bọt khí khi tiếp xúc $H_2O_2$)
Sinh chất kích thích (PGP)	Sinh Indole-3-acetic acid (IAA)	Định lượng qua phản ứng màu Salkowski ($OD_{530}$) trên nền đường chuẩn 0–8 $\mu\text{g/mL}$
	Hòa tan Phosphate khó tan	Tạo vòng phân giải trong suốt trên môi trường Pikovskaya
	Sinh Siderophore	Dương tính (tiết hợp chất tạo phức chelate với sắt)
Đặc tính sinh hóa khác	Sinh khí Hydro sulfide ($H_2S$)	Giấy lọc tẩm $Pb(CH_3COO)_2$ chuyển màu nâu sẫm
	Sinh Indole (Tryptophanase)	Xuất hiện vòng đỏ với thuốc thử Kovac
	Lên men tạo acid/acetoin	Ghi nhận qua thử nghiệm Methyl Red (MR) và Voges-Proskauer (VP)
	Sử dụng Citrate	Đổi màu môi trường Simmons citrate từ xanh lục sang xanh lam thẫm
	Hóa lỏng Gelatin	Duy trì thể lỏng ở 5°C sau nuôi cấy (tiết gelatinase)
	Phân giải Ure	Làm đổi màu môi trường Stuart's Urea broth sang màu hồng cánh sen

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Đóng góp khoa học: Bổ sung đầy đủ dữ liệu sinh hóa và hoạt tính sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. VNUA27 bản địa; chứng minh phổ đối kháng rộng trên cả vi khuẩn Gram âm (X. axonopodis, R. solanacearum), vi khuẩn Gram dương (C. michiganensis) và các loài nấm sợi gây hại nguy hiểm (F. solani, C. gloeosporioides).
• Đóng góp thực tiễn: Khẳng định Streptomyces sp. VNUA27 sở hữu đồng thời khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh và các đặc tính thúc đẩy sinh trưởng cây trồng (tiết IAA, hòa tan lân khó tan, sinh siderophore, tiết enzyme thủy phân). Đây là nguồn vật liệu sinh học giá trị để nghiên cứu phát triển các chế phẩm sinh học đa chức năng phục vụ sản xuất nông nghiệp sạch.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Toàn bộ các thử nghiệm trong khóa luận mới dừng lại ở quy mô in vitro trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát nghiêm ngặt; chưa khảo sát hiệu lực ức chế mầm bệnh và mức độ kích thích sinh trưởng cây trồng trực tiếp trên đồng ruộng hoặc trong nhà lưới (in vivo).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Tối ưu hóa điều kiện lên men xốp hoặc lên men chìm để thu hồi sinh khối và các enzyme, kháng sinh ngoại bào đạt hiệu suất cao nhất.
  2. Phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất kháng sinh và siderophore do chủng VNUA27 tiết ra.
  3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sinh học và khả năng kích thích sinh trưởng thực tế của chế phẩm chứa chủng Streptomyces sp. VNUA27 trên cây trồng bị nhiễm bệnh trong điều kiện nhà kính và đồng ruộng.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Vi sinh vật học Nông nghiệp, Khoa học Cây trồng.
• Những người thực hiện các đề tài nghiên cứu về sàng lọc vi sinh vật đối kháng, xạ khuẩn vùng rễ (PGPR) và ứng dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp.

Các phần có giá trị tham khảo kỹ thuật cao:

• Quy trình thực nghiệm chuẩn xác định khả năng đối kháng nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy và công thức tính chỉ số PIRG (Skidmore & Dickinson).
• Phương pháp định lượng IAA bằng phản ứng màu với thuốc thử Salkowski và quy trình lập đường chuẩn đo quang phổ $OD_{530}$.
• Hệ thống công thức pha chế chi tiết của 10 loại môi trường vi sinh và quy trình tiến hành các phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật (MR-VP, Indole, $H_2S$, Simmons Citrate, Gelatin liquefaction, Stuart's Urea).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng xạ khuẩn được nghiên cứu trong khóa luận có tên khoa học là gì và có nguồn gốc từ đâu?
Chủng xạ khuẩn mang mã hiệu Streptomyces sp. VNUA27, được phân lập và lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và giải trình tự gen 16S rRNA trong các nghiên cứu trước đó, chủng này được định danh là Streptomyces neyagawaensis.

2. Khóa luận đã thử nghiệm đối kháng của Streptomyces sp. VNUA27 trên những đối tượng vi sinh vật gây bệnh nào?
Khóa luận đã thử nghiệm trên 3 loài vi khuẩn gây bệnh: Xanthomonas axonopodis (gây loét cây có múi), Ralstonia solanacearum (gây héo xanh vi khuẩn), Clavibacter michiganensis (gây thối vòng khoai tây/cà chua); và 2 chủng nấm gây bệnh: Fusarium solani (chủng HT39) và Colletotrichum gloeosporioides (chủng HD01).

3. Khả năng kháng nấm sợi của xạ khuẩn được đánh giá bằng phương pháp và công thức nào?
Khả năng kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên đĩa thạch PDA ở 25°C trong 6 ngày. Mức độ ức chế được tính bằng tỷ lệ phần trăm ức chế sinh trưởng bán kính PIRG (%) theo công thức: $\text{PIRG (%)} = \frac{d_0 - d_1}{d_0} \times 100$, trong đó $d_0$ là bán kính phân tán nấm đĩa đối chứng và $d_1$ là bán kính phân tán nấm phía giáp xạ khuẩn.

4. Chủng Streptomyces sp. VNUA27 có khả năng sinh các enzyme ngoại bào và chất kích thích sinh trưởng nào?
Chủng VNUA27 có khả năng sinh các enzyme ngoại bào gồm amylase, protease, cellulase, chitinase và catalase; đồng thời có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật Indole-3-acetic acid (IAA), hòa tan phosphate khó tan trên môi trường Pikovskaya và sinh chất mang sắt siderophore.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trịnh Minh Phương đã hoàn thành việc sàng lọc và chứng minh hoạt tính đối kháng đa dạng của chủng xạ khuẩn bản địa Streptomyces sp. VNUA27 (Streptomyces neyagawaensis) đối với 3 loài vi khuẩn (Xanthomonas axonopodis, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensis) và 2 loài nấm (Fusarium solani, Colletotrichum gloeosporioides) gây bệnh hại cây trồng. Nghiên cứu đồng thời xác lập hồ sơ sinh hóa hoàn chỉnh của chủng, nổi bật với khả năng tiết hệ enzyme phân giải ngoại bào phong phú (amylase, protease, cellulase, chitinase, catalase) cùng các hoạt tính kích thích sinh trưởng như tổng hợp IAA, hòa tan lân khó tan và tiết siderophore. Các kết quả thực nghiệm thu được tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho việc định hướng phát triển chủng xạ khuẩn VNUA27 thành chế phẩm vi sinh phục vụ quản lý dịch hại tổng hợp và phát triển nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------------- UNDERGRADUATE THESIS TITLE: SCREENING THE ANTAGONISTIC ABILITY TO PATHOGENIC MICROORGANISMS AND RESEARCHING BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF STREPTOMYCES SP. VNUA27 HANOI- 2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ----------  ---------- UNDERGRADUATE THESIS SCREENING THE ANTAGONISTIC ABILITY TO PATHOGENIC MICROORGANISMS AND RESEARCHING BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF STREPTOMYCES SP. VNUA27 Student : TRINH MINH PHUONG Class : K62CNSHE Student’s code : 620408 Supervisor : Dr. TRINH XUAN HOAT Assoc.

NGUYEN XUAN CANH Hanoi – 2022 COMMITMENT I assure that this is my research. The data and experimental results presented in the thesis are honest and have never been published in any other works. The figures in the table serving the analysis, comment and assessments were collected by the author itself from different sources specified in the references. If there is any fraud, I am fully responsible for the content of the thesis.

Sincerely Trinh Minh Phuong i ACKNOWLEDGEMENT In fact, there are no successes without associated with support or assistance, whether more or less, directly or indirectly by others. This project consumed a huge amount of work, enthusiasm and dedication. Still, implementation would not have been possible if I did not have the support of many people and organizations. Therefore, I would like to extend our sincere gratitude to all of them.

Firsts of all, I would like to express sincere thanks to the School Board, the Dean of Biotechnology Faculty, and all teachers who have imparted to me the knowledge that is advantageous and valuable during time learning, training and implementation thesis. Through working, I did not only gain much knowledge but more importantly, I also had a great chance to sharpen my skills in a professional working environment. I have developed myself both academically, professionally and socially. I would like to express my deep and sincere gratitude to my supervisor, Assoc.

Nguyen Xuan Canh, PhD, Chief of Faculty of Biotechnology, Viet Nam National University of Agriculture for giving me the opportunity to complete this thesis and providing invaluable guidance through this thesis. His dynamism, vision, sincerity and motivation have deeply inspired us. He has taught me the methodology to contribute a thesis and to present that as much as possible. It was a great privilege and honour to work and study under his guidance.

I would also like to thank Dr. Trinh Xuan Hoat for guiding and giving me advice so that I can complete this thesis well. Besides my instructor, I express my special thanks to Assoc. Nguyen Van Giang; M.S Tran Thi Dao; Mrs.

Nguyen Thi Thu. I am extremely grateful to my family for their love, prayers, caring and sacrifices for educating and preparing me for my future. Finally, our thanks go to all the people who have supported me to complete the project directly or indirectly. Hanoi, February 2022 Sincerely Trinh Minh Phuong ii INDEX COMMITMENT.

iii LIST OF TABLES. vi LIST OF FIGURES. vii LIST OF ABBREVIATIONS. ix PART I: INTRODUCTION.

Research purpose and content. The purpose of the study. 2 PART II: LITERATURE REVIEWS. Overview of Actinomycetes, genus Streptomyces, Streptomyces sp.

Overview of pathogenic strains. Overview of pathogenic bacteria. Overview of bacteria Xanthomonas axonopodis. Overview of the bacterium Ralstonia solanacearum.

Overview of the bacteria Clavibacter michiganensis. Overview of pathogenic fungal strains. Overview of the fungus Fusarium solanin. Overview of the fungus Colletotrichum gloeosporioides.

Review of recent studies on the antagonism of Actinomycetes against bacteria and fungi. 29 PART III: MATERIALS AND METHODS. Location and time of the study. Screening the antagonistic ability to pathogenic microorganisms of Streptomyces sp.

Biochemical characteristics of Streptomyces sp. The ability to produce extracellular enzymes. The ability to produce IAA. The ability to produce Hydro sulfide (H2S).

The ability to produce indole. The ability to utilize citrate. The ability to hydrolyze gelatin. The ability to solubilize phosphate.

The ability to decompose ureases. The ability to produce siderophores. 39 PART I V: RESULT AND DISCUSSION. Antagonistic ability of Streptomyces sp.

Biochemical characteristics of Streptomyces sp. The ability to produce extracellular enzymes. The ability to produce IAA. The ability to produce Hydrosulfide (H2S).

The ability to produce indole. The ability to utilize citrate. The ability to liquefaction gelatin. The ability to solubilize phosphate.

The ability to decompose ureases. The ability to produce siderophores. 58 PART V: CONCLUSION AND SUGGESTION. 63 v LIST OF TABLES Table 1: Families and genera of Actinomycetales.

6 Table 2: Classification of genus Streptomyces based on morphologic, chemotaxonomix and molecular studies. 8 Table 3: Some common plant diseases caused by Xanthomonas campestris. 17 Table 4: Preharvest diseases of fruits and vegetables caused by Xanthomonas campestris. 17 Table 5: Ingredients for medium.

34 Table 6: Chemical composition of standard IAA solution. 35 Table 7: The ability to produce extracellular enzymes of Streptomyces sp. 45 vi LIST OF FIGURES Figure 1: Morphology of Streptomyces on starch casein agar and in Gram’s staining. 10 Figure 2: Xanthomonas colonies on starch plate.

14 Figure 3: Potato ring rot disease caused by Clavibacter michiganense sub sp. 22 Figure 4: Conidial morphology of Colletotrichum gloeosporioides isolated from dragon fruit under light microscope, arrow indicates the length of the conidia. 26 Figure 5: Results on the ability to antagonize three pathogenic bacteria strains of Streptomyces sp. 42 Figure 6: Antagonistic activity of Streptomyces sp.

43 Figure 7: Antagonistic activity of Streptomyces sp. 44 Figure 8: Extracellular enzyme production ability of Streptomyces sp. 46 Figure 9: IAA Standard curve plot from 0 to 8 µg/ml. 49 Figure 10: IAA production of Streptomyces sp.

50 Figure 11: H2S production ability of Streptomyces sp. 51 Figure 12: Indole production ability of Streptomyces sp. 52 Figure 13: MR test results of Streptomyces sp. 53 Figure 14: V-P test results.

54 Figure 15: Citrate utilization ability of Streptomyce sp. 55 Figure 16: Gelatin liquefaction ability of Streptomyces sp. 56 Figure 17: Testing phosphate solubilizing ability of Streptomyces sp. 57 Figure 18: Testing the urease-producing ability of Streptomyces sp.

58 Figure 19: Testing the sideropho production ability of Streptomyce sp. 60 vii LIST OF ABBREVIATIONS IAA Indole-3-acetic acid DNA Deoxyribonucleic acid PDA Potato dextrose agar IPM Integrated Pest Management PGP Plant growth promotion PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria viii ABSTRACT Bacteria that cause plant diseases are the cause of serious damage to yield and product quality not only in Vietnam but also in many other countries. Currently, biological control is being considered as a necessary solution to replace the use of chemical drugs. With the aim of discovering more sources of biological materials that can antagonize plant pathogens.

Based on studies on Streptomyces sp. VNUA27: capable of antagonizing the fungus Fusarium oxysporum; grows well at temperatures 30oC and 37oC; good use of different sugar sources (Maltose, Sucrose, Cellulose and D-Manitol); growth well in salt concentration from 0% - 3%; pH 4 -11. I continued to investigate other characteristics of Streptomyces sp. VNUA27: resistance to three strains of bacteria and two strains of fungi; capable of producing extracellular enzymes (amylase, protease, cellulase, chitinase, catalase); citrate utilization; H2S production; gelatin liquefaction; produce urease enzyme; IAA production; phosphate solubilizing, produce siderophores.

ix PART I: INTRODUCTION 1.Introduction Vietnam is an agricultural country located in the hot and humid tropics. These are favorable conditions for the growth of microorganisms, especially plant pathogens. These microorganisms have caused great damage to crop yields. In the development trend of world agriculture, in recent years our country's agriculture has achieved great achievements.

Rice production not only meets domestic demand but also exports to major countries and tightly controlled markets such as Europe. In addition to food crops, industrial crops, vegetable crops also flourished in production. However, agricultural production also encountered many difficulties such as adverse weather, pests and diseases caused by pests, diseases, weeds, rats, snails, etc…, which reduced the productivity and quality of agricultural products. According to statistics of FAO (1984), annual plant diseases not only reduce the yield and quality of crops but also increase production costs.

Therefore, to protect production, we must apply a series of farming methods, physical mechanics., especially chemical measures to protect plants, which have long been widely popular in Vietnam. Pesticides not only destroy ecosystems but also remain in soil and agricultural products, affecting water quality and especially human health. Moreover, in recent years, plant pests such as fungi and bacteria have caused a lot of diseases on agricultural crops in Vietnam. There have also been a number of research works on using beneficial microorganisms as B.

thuringiensis and Beauveria bacteria to kill pests, and Metarhizium fungi to kill insects such as some beetle type. However, there are not many studies on applying microorganisms to inhibit bacteria and fungi that cause plant diseases. Furthermore, the 1992 FAO Regional Consultative Conference for Asia and the Pacific confirmed biological warfare as the foundation of an IPM 1 (Integrated Pest Management) program with a strategy of using biological agents to limit the growth of parasitic populations. One of the research directions following this trend is the use of biological agents to limit pathogenic microorganisms.

Among the biological agents commonly used to inhibit pathogenic microorganisms, Actinomycetes are known to be a special group of bacteria. They are widely distributed and play an important role in the natural cycle of matter. During life, Actinomycetes secrete many highly biologically active substances that are resistant to various microbial species including fungi and bacteria. Of the 23,000 bioactive compounds produced by microorganisms, more than 10,000 were isolated from Actinomycetes (Watve et al.

Over 80% of these compounds are different antibiotics. The researchers showed that for every 1,000 Actinomycetes isolated at random, about 10 would produce streptomycin and four would produce tetracycline. Therefore, Actinomycetes are one of the potential sources of bioactive substances (Mitra et al. Therefore, in order to have a more realistic and clearer view, I conducted research on the topic: “Screening the antagonistic ability to pathogenic microorganism and researching biochemical characteristics of the Streptomyces sp.

The research results will serve to provide the basis for the creation of biological products to replace the previous ineffective treatment methods. There by improving crop productivity, meeting the demand for clean food, saying no to pesticides, improving lives and bringing economic benefits to the people. Research purpose and content 1. The purpose of the study Screening the antagonistic ability to pathogenic microorganism and researching biochemical characteristics of the Streptomyces sp.

Research content - Collect some strains of pathogenic bacteria: 2 • The bacterium Xanthomonas axonopodis causes infections and lesions on the leaves, stems and fruits of citrus trees. • The bacterium Ralstonia solanacearum causes severe leaf wilt in many vegetables and crops. • The bacterium Clavibacter michiganensis causes diseases in tomato and potato plants. - Collect some strains of pathogenic fungi: • Fusarium solani strain (HT39).

• Colletotrichum gloeosporioides strain (HD01). - Testing the antagonistic ability of Streptomyces sp. - Study on biochemical characteristics of Streptomyces sp. 3 PART II: LITERATURE REVIEWS 2.

Overview of Actinomycetes, genus Streptomyces, Streptomyces sp. VNUA27 The Actinomycetes are known as particularly variable organisms. Actinomycetes were originally thought of like bacteria in the guise of fungi or vice versa. It was indeed a challenge to classify them.

Some scientists considered them as Eubacteriales or higher bacteria, while some thought them to belong to Hyphomycetes or lower fungi. Selman Waksman opined that these microorganisms could be grouped separately. Actinomycetes, like true bacteria (Eubacteria) are prokaryotes. Their growth (prothallus) is characterized by the formation of normally branching threads and rods, frequently giving rise to a typical mycelium, which is unicellular, especially during the early stages of growth (Experiment et al.

Generally non-septate, the hyphae may turn septate under special conditions (Experiment et al. The mycelium is prostrate, vegetative and growing in the substrate, or aerial, when a special mycelium is produced above the vegetative growth.