MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Phong lan là thực vật có hoa đẹp, màu sắc đa dạng, phong phú, thu hút sự quan tâm yêu thích của nhiều đối tượng, đặc biệt là các nhà khoa học. Với khí hậu nhiệt đới và địa hình đa dạng khác nhau, ngày càng nhiều loài lan mới được phát hiện và bổ sung vào danh sách các loài lan phân bố ở Việt Nam. Tại Việt Nam, phong lan là một họ phong phú và đặc sắc của hệ thực vật, có giá trị tài nguyên về nhiều mặt đối với nền kinh tế, đời sống con người.
Nhiều loài lan rừng Việt Nam, trong đó có các loài thuộc chi lan Dendrobium cho hoa đẹp, kết hợp nhiều màu sắc phong phú, hài hòa; một số loài có hương thơm, lâu tàn, nở kéo dài từ 1 – 2 tháng [1;12;14]. Lan Dendrobium còn là chi lớn thứ hai trong họ Phong lan, chỉ sau chi Bulbophyllum và là chi có số lượng loài lớn nhất thuộc họ này trong hệ thực vật Việt Nam [1;75]. Lan Dendrobium không chỉ là một trong những nhóm hoa lan được yêu thích, tiêu thụ nhiều, phục vụ nhu cầu thị trường chơi lan chậu, lan cắt cành mà còn có lịch sử được sử dụng làm thảo dược trong khoảng 2000 năm nay ở các nước Đông – Nam châu Á [30]. Môi trường sống tự nhiên của các loài Dendrobium bản địa ở Việt Nam ngày càng bị suy giảm do biến đổi khí hậu và sự khai thác quá mức của con người, điều này có thể dẫn đến nguy cơ làm mất nguồn gen lan rừng nói chung cũng như lan Dendrobium nói riêng.
Bên cạnh đó, việc du nhập và lai tạo ngày càng nhiều giống lan Dendrobium mới cũng làm cho nhiều giống bản địa dần bị lãng quên. Vì vậy, việc định danh và đánh giá đa dạng di truyền cho các loài Dendrobium ở Việt Nam hiện rất quan trọng để kịp thời bảo tồn nhóm lan quí này. Từ thực tế đó, rất nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng các loài lan, trong đó có Bộ sưu tập hoa lan của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Tính đến cuối năm 2019, Bộ sưu tập này đã có gần 400 mẫu giống lan các loại, trong đó có 190 mẫu giống thuộc chi lan Dendrobium, các mẫu này đã được định danh, phân loại trên cơ sở dựa vào hình thái của từng mẫu giống.
2 Thực vật nói chung muốn định danh hình thái cần phải có mẫu vật với đầy đủ các yếu tố thành phần như thân, rễ, lá, hoa… Hiện nay, quá trình nhận diện các giống lan vẫn dựa trên hình thái bên ngoài, đặc biệt cần các mẫu có hoa để cho kết quả định danh tối ưu nhất. Họ Lan là một họ thực vật được đánh giá là rất khó để nhận diện, định danh, đặc biệt là thời kỳ chúng chưa ra hoa [27]. Nhiều loài chỉ khác với loài lân cận ở một điểm hình thái rất nhỏ và tinh tế. Nhiều loài thuộc chi Dendrobium có hình thái ngoài khá giống nhau khi chưa có hoa, do vậy rất khó để nhận diện chúng bằng phương pháp hình thái thông thường.
Trước đây, quá trình chủ động lai tạo ra các giống lan mới vẫn mang tính kinh nghiệm và cảm tính mà chưa dựa trên nền tảng di truyền nên có thể tạo ra các đặc tính giống không mong muốn hoặc các biến dị, điều đó dẫn đến việc phân loại chúng ở mức chi và loài cực kỳ khó khăn. Mặt khác, lan chỉ có giá trị khi có hoa nên trong một số trường hợp, người ta có thể bắt gặp loài quí nhưng lại bỏ qua do hình thái của nó khó phân biệt so với các loài thông dụng khác. Một số loài đặc hữu đang có nguy cơ bị tuyệt chủng bị cấm khai thác, xuất khẩu như D. hancockii…[1;19] nhưng do việc kiểm tra, thẩm định tại các cửa khẩu không phải do các chuyên gia thực hiện nên chuyện cây con, cây trưởng thành chưa có hoa bị khai thác trái phép là điều khó tránh khỏi.
Trong quá trình sưu tập, định danh, lai tạo và nhân các giống lan của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM cũng gặp các vấn đề như mẫu thu được chưa có hoa, nhiều mẫu giống này không ra hoa trong điều kiện sống ở Tp. HCM, có thể bỏ sót các mẫu giống quý trong quá trình thu thập, việc nhân nuôi số lượng lớn các giống quý có thể bị nhầm lẫn, việc lai tạo ngẫu nhiên và khó kiểm chứng nền tảng di truyền của các tổ hợp lai. Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện nay được ứng dụng nhiều trong việc đánh giá đa dạng di truyền, phân định các giống, loài, thậm chí cả mức dưới loài của thực vật.
Mỗi kỹ thuật đều có những ưu, nhược điểm riêng và được áp dụng cho từng trường hợp, đối tượng cụ thể khác nhau. Trong đó, mã vạch DNA được cho là một 3 công cụ hữu dụng trong việc định danh các loài thực vật, trong đó có các loài lan. Việc nghiên cứu ứng dụng hệ thống mã vạch DNA cho các loài hoa lan giúp cho công tác sưu tập, bảo tồn, định danh cũng như đánh giá đa dạng di truyền để tiến hành công tác lai tạo, nhân nhanh các giống hoa lan phục vụ cho sản xuất, đồng thời có thể quản lý khai thác tốt hơn nguồn gen hoa lan hiện có. Nhiều công trình đã chứng minh rằng vùng ITS (Internal transcribed spacer) thể hiện sự đa dạng cao giữa các loài nên được sử dụng để phân loại và nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các loài [27;48], đặc biệt là các loài thuộc chi Dendrobium [35;37;64;80;89;91;110].
Vùng ITS2 đã được đánh giá là có thể phân biệt rõ ràng giữa các loài Dendrobium [44;67;99]. Ba vùng trình tự trong lục lạp trnH-psbA (vùng nằm giữa 2 gen trnH và psbA), matK (maturaseK) và rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) cũng đã được xác định là có giá trị trong việc phân định các loài thuộc chi Dendrobium [27;50;63;82;91;113;120]. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự gen để nhận diện nhanh và xác định mức độ đa dạng của nhóm lan Dendrobium khu vực phía Nam” nhằm hướng đến việc xác lập hệ thống mã vạch DNA để định danh và phân loại ở đối tượng lan Dendrobium sẽ giúp các nhà khoa học, cụ thể là Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM có thông tin đầy đủ và hệ thống hơn trong công tác sưu tập, bảo tồn, đánh giá đa dạng di truyền, từ đó đề ra các hướng lai tạo, chọn giống và nhân giống in vitro phục vụ Chương trình phát triển hoa, cây kiểng Tp.
HCM cũng như phát triển nông nghiệp đô thị. Đề tài đã sử dụng 40 mẫu giống Dendrobium để tiến hành mô tả hình thái; giải trình tự các vùng ITS (trong nhân), rbcL, matK, trnH-psbA (trong lục lạp) cho 84 mẫu giống Dendrobium; sử dụng công cụ tin sinh học để phân tích mức độ đa dạng, mối quan hệ phát sinh loài của nhóm lan này; ứng dụng hệ thống trình tự để phân tích khả năng truy nguyên nguồn gốc bố mẹ của một số mẫu lan lai. Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA – hệ thống mã vạch DNA để kiểm chứng và đánh giá đa dạng di truyền của một số loài lan Dendrobium được thu thập ở miền Nam Việt Nam.2 Mục tiêu cụ thể 1. Xây dựng bộ dữ liệu trình tự DNA cho một số loài lan Dendrobium ở khu vực phía Nam dựa trên trình tự DNA của 4 marker.
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền dựa trên một số trình tự DNA của nhóm lan Dendrobium thuộc khu vực phía Nam Việt Nam đã thu được. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài đã xác định được sự đa dạng di truyền của nhóm lan Dendrobium khu vực phía Nam Việt Nam dựa vào đặc điểm hình thái và DNA barcode. Những thông tin trình tự đều được đăng ký trên GenBank, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu của lan Dendrobium từ đó làm tiền đề cho những nghiên cứu sau này. Đề xuất được các marker tiềm năng giúp xác định nhanh các loài lan Dendrobium nhằm bảo tồn nguồn gen quý của Việt Nam.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đề xuất sử dụng hệ thống trình tự mã vạch DNA nhằm phục vụ công tác nhận diện, định danh, phân loại các loài lan Dendrobium nhanh và chính xác hơn trong công tác bảo tồn quỹ gen.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu Lan Dendrobium – thu thập từ Bộ sưu tập hoa lan của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, và 1 số vườn lan. 5 Các trình tự DNA có tiềm năng trong việc phân định loài.2 Phạm vi nghiên cứu Nguồn vật liệu mẫu lan được sử dụng từ Bộ sưu tập hoa lan của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, đây là sản phẩm, kết quả thuộc đề tài “Sưu tập, nhập nội, chọn tạo và nhân nhanh các giống hoa lan phục vụ nội tiêu và xuất khẩu” của TS.
Dương Hoa Xô và cộng sự đã được nghiệm thu năm 2011 [26]. Đề tài đã tiến hành: - Phân tích và xây dựng cây phân nhóm dựa trên 72 đặc tính hình thái của 40 mẫu giống lan Dendrobium. - Phân tích 4 vùng trình tự rbcL, matK, trnH-psbA, ITS của 84 mẫu giống (gồm 71 mẫu giống lan thuộc 25 loài Dendrobium đại diện của khu vực miền Nam Việt Nam và 13 mẫu giống lan lai). Những đóng góp mới của đề tài Đề tài cung cấp thông tin trình tự các marker (ITS, matK, rbcL, trnH-psbA) của các loài lan Dendrobium bản địa Việt Nam trong nghiên cứu vào cơ sở dữ liệu GenBank.
Trong đó, có những trình tự vùng rbcL, trnH-psbA thuộc nhiều mẫu giống hiện chưa có hoặc được công bố rất hạn chế trên GenBank. Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền về trình tự DNA marker của các nhóm lan Dendrobium khu vực miền Nam Việt Nam. Đề xuất được các marker tiềm năng cho việc phân định các loài lan Dendrobium. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Giới thiệu về họ Phong lan Theo Takhtajan năm 1987, họ Phong lan (Orchidaceae) là họ thực vật lớn nhất trong lớp Một lá mầm (Monocotyledoneae) và là họ lớn thứ hai (chỉ sau họ Cúc - Asteraceae) trong ngành Thực vật hạt kín (Angiospermae).
Orchidaceae có tới 750 chi và hơn 25.000 loài, chính vì thế hình thái cấu tạo cũng như hệ thống phân loại họ này hết sức đa dạng và phức tạp. Không chỉ vậy, số lượng loài và chi thuộc họ này hiện không ngừng tăng lên theo thời gian. Các chi với số lượng loài lớn thuộc họ Phong lan có thể kể đến như lan Lọng (Bulbophyllum), lan Hoàng thảo (Dendrobium), lan Hài (Paphiopedilum), Cát lan (Cattlaya)… [12].
