Nghiên Cứu Chiết Tách Thành Phần Terpenoid – Steroid Trong Hoa Cúc La Mã

Đồ án nghiên cứu tốt nghiệp nghiên cứu chiết tách thành phần terpenoid steroid trong hoa cúc la mã, áp dụng công nghệ tiên tiến, tối ưu giải pháp kỹ thuật cho bài toán .

• Tác giả: Trần Thị Thu Thủy
• Người hướng dẫn: Ts. Đặng Thu Thủy
• Trường học: Trường Đại Học Bà Rịa - Vũng Tàu
• Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Tách Terpenoid và Steroid Từ Hoa Cúc La Mã
• Loại tài liệu: Đồ Án Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Bà Rịa - Vũng Tàu

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu chung về hoa cúc la mã
• 1.2. Đặc điểm hình thái, điều kiện sinh trưởng và phát triển
• 1.3. Thành phần dược liệu có trong hoa cúc La Mã
• 1.4. Đặc điểm các hợp chất Terpenoid – Steroid
• 1.5. Quá trình sinh tổng hợp terpenoid
• 1.6. Tính chất tạo hương và hoạt tính sinh học
• 1.7. Tính chất tạo hương của terpenoid
• 1.8. Hoạt tính sinh học của terpenoid – Steroid
• 1.9. Các phương pháp chiết tách Terpenoid-steroid
• 1.9.1. Phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi (chưng ninh)
• 1.9.2. Phương pháp chưng lôi cuốn hơi nước
• 1.9.3. Phương pháp ngâm kiệt
• 1.9.4. Phương pháp chiết bằng soxhlet
• 1.9.5. Các phương pháp chiết hiện đại
• 1.9.5.1. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
• 1.9.5.2. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
• 1.9.5.3. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn
• 1.9.5.4. Chiết dưới áp suất cao
• 1.9.6. Các phương pháp định tính thành phần terpenoid
• 1.9.6.1. Phản ứng Liebermann-Burchard để phát hiện steroid-triterpenoid
• 1.9.6.2. Phản ứng Rosenheim để phát hiện steroid-triterpenoid
• 1.9.6.3. Phản ứng Rosenthaler để phát hiện steroid-triterpenoid
• 1.9.6.4. Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid
• 1.9.6.5. Phản ứng Noller để phát hiện Steroid-triterpenoid
• 1.9.6.6. Phản ứng Carr-Price để phát hiện Steroid-triterpenoid
• 1.9.6.7. Thuốc thử pentaclorur antimony SbCl5 để phát hiện terpenoid
• 1.9.6.8. Thuốc thử anisaldehyd-acid sulfuric để phát hiện dẫn xuất của terpenoid
• 1.9.6.9. Thuốc thử komarowsky để phát hiện terpenoid
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hoá chất và dụng cụ
• 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất
• 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2. Phương Pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu các phương pháp chiết tách thành phần terpenoid-steroid
• 2.2.2. Phương pháp phân tích sản phẩm
• 2.2.2.1. Phương pháp định tính thành phần terpenoid – steroid
• 2.2.2.2. Xác định các chỉ tiêu hoá học của terpenoid- steroid
• 2.2.2.3. Phương Pháp sắc ký khí ghép khối phổ
• 2.2.2.4. Thử hoạt tính sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. So sánh hiệu suất chiết terpenoid-steroid
• 3.2. Định tính terpenoid-steroid
• 3.3. Các chỉ tiêu hoá – lý của terpenoid- steroid
• 3.4. Thành phần hoá học của phân đoạn terpenoid-steroid
• 3.5. Hoạt tính sinh học của phân đoạn terpenoid-steroid có trong tinh dầu hoa cúc La Mã
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chiết Tách Terpenoid và Steroid

Nghiên cứu chiết tách thành phần terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Hoa cúc La Mã không chỉ nổi tiếng với hương thơm mà còn chứa nhiều hợp chất có giá trị dược lý. Việc chiết tách các hợp chất này có thể mang lại nhiều lợi ích cho y học và công nghiệp thực phẩm.

1.1. Giới Thiệu Về Hoa Cúc La Mã và Thành Phần Dược Liệu

Hoa cúc La Mã (Chamaemelum nobile) chứa khoảng 120 hoạt chất, trong đó có 28 terpenoid và steroid. Các hợp chất này có tác dụng sinh học mạnh mẽ, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học và mỹ phẩm.

1.2. Đặc Điểm Hình Thái và Điều Kiện Sinh Trưởng

Hoa cúc La Mã là cây thảo dược lâu năm, dễ trồng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ôn đới. Cây có thể chịu được nhiều loại đất và có khả năng phát triển mạnh mẽ trong điều kiện khắc nghiệt.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Chiết Tách

Mặc dù hoa cúc La Mã có nhiều lợi ích, nhưng việc chiết tách các hợp chất terpenoid và steroid vẫn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp chiết tách hiện tại chưa đạt hiệu suất tối ưu và cần được cải tiến.

2.1. Những Khó Khăn Trong Việc Chiết Tách Hợp Chất

Việc chiết tách terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã thường gặp khó khăn do sự phân bố không đồng đều của các hợp chất trong cây. Điều này đòi hỏi các phương pháp chiết tách phải được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao.

2.2. Tác Động Của Môi Trường Đến Chất Lượng Chiết Xuất

Điều kiện môi trường như độ pH, nhiệt độ và độ ẩm có thể ảnh hưởng lớn đến chất lượng và hiệu suất chiết xuất. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định các yếu tố này.

III. Phương Pháp Chiết Tách Terpenoid và Steroid Hiệu Quả

Để chiết tách terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất.

3.1. Phương Pháp Chiết Bằng Dung Môi Dễ Bay Hơi

Phương pháp chiết bằng dung môi dễ bay hơi (chưng ninh) là một trong những phương pháp truyền thống. Phương pháp này giúp tách chiết hiệu quả các hợp chất terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã.

3.2. Phương Pháp Chưng Lôi Cuốn Hơi Nước

Chưng lôi cuốn hơi nước là phương pháp hiệu quả để chiết xuất tinh dầu từ hoa cúc La Mã. Phương pháp này giúp bảo toàn các hợp chất nhạy cảm với nhiệt độ.

3.3. Phương Pháp Chiết Soxhlet

Phương pháp chiết Soxhlet cho phép chiết xuất liên tục và hiệu quả các hợp chất terpenoid và steroid. Phương pháp này thường được sử dụng trong các nghiên cứu khoa học.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Terpenoid và Steroid

Các hợp chất terpenoid và steroid chiết xuất từ hoa cúc La Mã có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học, thực phẩm và mỹ phẩm. Việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ những hợp chất này đang ngày càng được chú trọng.

4.1. Tác Dụng Sinh Học Của Terpenoid

Terpenoid có nhiều tác dụng sinh học như kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa. Những tác dụng này làm cho chúng trở thành thành phần quan trọng trong các sản phẩm y tế.

4.2. Ứng Dụng Trong Ngành Thực Phẩm

Các hợp chất terpenoid và steroid được sử dụng trong ngành thực phẩm như hương liệu tự nhiên. Chúng không chỉ cải thiện hương vị mà còn tăng cường giá trị dinh dưỡng.

4.3. Vai Trò Trong Ngành Mỹ Phẩm

Terpenoid và steroid có khả năng cải thiện sức khỏe làn da, được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc sắc đẹp. Chúng giúp làm dịu và bảo vệ da khỏi các tác nhân gây hại.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu chiết tách terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã mở ra nhiều triển vọng cho các ứng dụng trong y học và công nghiệp. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các phương pháp chiết xuất và khám phá thêm nhiều ứng dụng mới.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Chiết Tách

Nghiên cứu chiết tách terpenoid và steroid từ hoa cúc La Mã sẽ tiếp tục được mở rộng. Các phương pháp mới và công nghệ hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu suất chiết xuất.

5.2. Định Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ terpenoid và steroid, đồng thời đánh giá tác dụng sinh học của chúng trong các lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tinh dầu có nguồn gốc từ tự nhiên ngày càng được ứng dụng sâu rộng trong các lĩnh vực y sinh, dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm nhờ ưu điểm an toàn, không gây hại cho môi trường và có khả năng phân hủy sinh học cao so với các hóa chất hữu cơ tổng hợp. Trong đó, hoa cúc La Mã (Chamaemelum nobile hay Roman Chamomile) là nguồn dược liệu chứa hàm lượng cao các hợp chất tự nhiên có giá trị, đặc biệt là nhóm terpenoid và steroid với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa.

Tuy nhiên, việc khai thác và tinh sạch nhóm hợp chất này đòi hỏi quy trình chiết tách phù hợp nhằm hạn chế sự lẫn tạp của sáp, nhựa và acid béo, đồng thời đảm bảo hiệu suất thu hồi tối ưu. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, đồ án tốt nghiệp "Nghiên cứu chiết tách thành phần terpenoid – steroid trong hoa cúc La Mã" được thực hiện tại Khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu nhằm khảo sát các quy trình chiết tách và đánh giá tính chất của sản phẩm thu nhận.

Mục tiêu nghiên cứu của đồ án bao gồm ba nhiệm vụ cụ thể được đánh số theo văn bản:

1. So sánh hiệu suất chiết tách terpenoid – steroid của các phương pháp chiết tách khác nhau.
2. Xác định các thành phần hợp chất terpenoid – steroid có trong hoa cúc La Mã.
3. Thử các hoạt tính sinh học của thành phần terpenoid – steroid.

• Đối tượng nghiên cứu: Hoa của cây cúc La Mã (Chamaemelum nobile) nhập khẩu từ Mỹ, được xử lý rửa sạch, phơi khô và xay mịn trước khi đưa vào thực nghiệm.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Không gian: Các thí nghiệm chiết tách, xử lý hóa học, định tính, xác định chỉ số hóa lý và thử hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. Phân tích thành phần hóa học bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) được thực hiện tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh.
  • Thời gian: Đồ án hoàn thành vào tháng 07 năm 2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại hợp chất

Đồ án xây dựng trên nền tảng hóa thực vật và hóa học các hợp chất thiên nhiên. Terpenoid (hay isoprenoid) là những hợp chất hữu cơ có công thức chung $(C_5H_8)_n$ ($n \ge 2$), được tạo thành từ các đơn vị isoprene liên kết với nhau theo nguyên tắc "đầu – đuôi" của Ingold (đối với monoterpen, sesquiterpen, diterpen, sesterpen) hoặc liên kết "đuôi – đuôi" ở giữa mạch carbon (đối với triterpen và tetraterpen). Quá trình sinh tổng hợp terpenoid bắt nguồn từ phân tử acetyl-CoA hoạt hóa qua chất trung gian acid mevalonic để tạo thành isopentenyl pyrophosphate và dimethylallyl pyrophosphate.

Số đơn vị $n$	Loại terpenoid	Số nguyên tử Carbon	Nguồn gốc / Trạng thái phổ biến
1	Hemiterpen	5	Tinh dầu, hormon thực vật
2	Monoterpen	10	Tinh dầu thực vật
3	Sesquiterpen	15	Tinh dầu thực vật
4	Sesterpen	20	Nhựa dầu
5	Diterpen	25	Nhựa cây, sáp
6	Triterpen	30	Sterol, saponin
8	Tetraterpen	40	Carotenoid
> 8	Polyterpen	> 40	Cao su thiên nhiên

Bên cạnh đó, tác giả tổng hợp cơ sở lý thuyết về tính chất tạo hương (phụ thuộc vào các nhóm chức alcohol, aldehyde, ketone, ester, acid, oxide) và cơ chế tác dụng sinh học của các hợp chất vòng lactone sesquiterpen trong việc ức chế vi sinh vật nhờ phản ứng với các nhóm $-SH$, $-OH$, $-NH$ của protein và amino acid.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm hóa học kết hợp phân tích dụng cụ và vi sinh học:

• Phương pháp chiết xuất: Thực hiện đối chứng 4 quy trình chiết tách trên cùng quy mô nguyên liệu (100g bột hoa cúc La Mã): phương pháp chưng ninh (trích ly có gia nhiệt), phương pháp ngấm kiệt (percolation), phương pháp chiết Soxhlet bằng ethanol 70% và phương pháp chiết Soxhlet bằng ether dầu hỏa. Tất cả các quy trình đều kết hợp giai đoạn xà phòng hóa bằng dung dịch KOH ($pH = 10 - 13$) ở 60°C trong 3 giờ để chuyển hóa triacylglycerol và acid béo tự do thành muối xà phòng tan trong nước, sau đó tận chiết lỏng – lỏng phân đoạn không xà phòng hóa (terpenoid – steroid) bằng ether dầu hỏa.
• Phương pháp định tính hóa học: Thực hiện phản ứng đổi màu đặc trưng trong ống nghiệm gồm phản ứng Liebermann – Burchard (thuốc thử anhydrid acetic, chloroform, $H_2SO_4$ đậm đặc), phản ứng Rosenheim (acid trichloroacetic) và phản ứng Noller ($SnCl_4$).
• Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý: Định lượng chỉ số acid ($I_A$) và chỉ số xà phòng hóa ($I_S$) của sản phẩm bằng phương pháp chuẩn độ thể tích acid – bazơ sử dụng dung dịch chuẩn KOH 0.1 N, HCl 0.1 N và chỉ thị phenolphthalein.
• Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS): Phân tích định danh và định lượng thành phần hóa học trên hệ thống GC/MS với cột mao quản dài 30m tráng polymer đặc biệt, khí mang Helium, chương trình nhiệt độ lò từ 40°C đến 320°C, nhiệt độ cửa tiêm mẫu hóa hơi và đối chiếu phổ với thư viện phổ chuẩn.
• Phương pháp thử hoạt tính sinh học: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch Mueller Hinton Agar (MHA), sử dụng dung môi Dimethyl sulfoxide (DMSO) và độ đục chuẩn McFarland 0.5 để đo đường kính vòng vô khuẩn.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về dược liệu hoa cúc La Mã và hợp chất terpenoid – steroid:

• Tổng quan về cúc La Mã: Cây Chamaemelum nobile có nguồn gốc Nam và Đông Âu, sinh trưởng thích hợp ở đất cát thoát nước tốt ($pH = 4.8 - 8.3$, có thể chịu được $pH = 9$), nhiệt độ 2 – 20°C, lượng mưa 400 – 1400 mm/mùa. Dược liệu chứa khoảng 120 hoạt chất đã xác định (28 terpenoid – steroid, 36 flavonoid, 52 hợp chất khác). Thành phần chính gồm $\alpha$-bisabolol, chamazulene, nobilin, 3-epinobilin và các dẫn xuất flavonoid (apigenin, quercetin, patuletin).
• Hóa học và sinh tổng hợp Terpenoid – Steroid: Trình bày chi tiết cấu trúc hóa học, phân loại từ hemiterpen đến polyterpen, cơ chế sinh tổng hợp từ acetyl-CoA và dược lý của các chất tiêu biểu như limonene, thujone, menthol, borneol, lupeol, linalool, helenalin, vernolepin, artemisinin.
• Tổng quan các kỹ thuật chiết tách: Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp truyền thống (chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp/gián tiếp, ngấm kiệt, Soxhlet, chưng ninh) và các phương pháp hiện đại (chiết có hỗ trợ siêu âm 20 kHz, vi sóng 2450 MHz, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn $CO_2$, chiết dưới áp suất cao PLE).
• Các phản ứng định tính: Hệ thống 9 quy trình thử nghiệm ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng để phát hiện steroid và triterpenoid (Liebermann – Burchard, Rosenheim, Rosenthaler, Salkowski, Noller, Carr – Price, $SbCl_5$, anisaldehyd – $H_2SO_4$, Komarowsky).

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục nguyên vật liệu, hóa chất phân tích (Merck, Trung Quốc), thiết bị thí nghiệm (bộ chiết Soxhlet, máy cô quay chân không, cân phân tích, tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp khử trùng) và quy trình thực hiện:

• Quy trình chiết chưng ninh (Hình 2.1): 100g bột hoa cúc chiết với ethanol 70% (tỷ lệ 4:1) ở 60°C trong 2 giờ $\rightarrow$ làm lạnh kết tinh sáp $\rightarrow$ lọc chân không $\rightarrow$ cô quay thu cao cồn $\rightarrow$ hòa tan trong 100 ml dung dịch KOH ($pH = 10 - 13$), chưng ninh 3 giờ ở 60°C $\rightarrow$ chiết lỏng – lỏng nhiều lần bằng ether dầu hỏa $\rightarrow$ cô quay thu phân đoạn terpenoid – steroid.
• Quy trình chiết ngấm kiệt (Hình 2.2): 100g bột hoa cúc ngâm trong ethanol 70% trong 24 giờ, rút dịch chiết với tốc độ 1 ml/phút $\rightarrow$ cô quay thu cao cồn $\rightarrow$ xử lý kiềm KOH ($pH = 10 - 13$, 60°C, 3 giờ) $\rightarrow$ lắc chiết với ether dầu hỏa $\rightarrow$ cô quay thu sản phẩm.
• Quy trình chiết Soxhlet bằng ethanol 70% (Hình 2.3): Tận chiết bột hoa trong túi vải bằng máy Soxhlet với ethanol 70% $\rightarrow$ cô quay cao cồn $\rightarrow$ đun hoàn lưu cách thủy với KOH/alcol 3 giờ $\rightarrow$ chiết lỏng – lỏng với ether dầu hỏa $\rightarrow$ làm khan bằng $Na_2SO_4$, lọc $\rightarrow$ cô quay đuổi dung môi.
• Quy trình chiết Soxhlet bằng ether dầu hỏa (Hình 2.4): Tận chiết bột hoa trực tiếp bằng ether dầu hỏa trong máy Soxhlet $\rightarrow$ cô quay thu cao $\rightarrow$ xà phòng hóa hoàn lưu cách thủy 3 giờ với KOH/alcol $\rightarrow$ chiết lại bằng ether dầu hỏa $\rightarrow$ làm khan, lọc $\rightarrow$ cô quay thu terpenoid.
• Phương pháp phân tích: Trình bày chi tiết công thức tính chỉ số acid ($I_A$), chỉ số xà phòng hóa ($I_S$), cơ chế hoạt động của hệ thống GC/MS và quy trình nuôi cấy, tạo đĩa thạch thử hoạt tính kháng khuẩn.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm chiết xuất:

• So sánh hiệu suất chiết (Bảng 3.1): Tổng hợp và so sánh hiệu suất thu hồi phân đoạn terpenoid – steroid từ 100g nguyên liệu giữa 4 phương pháp thí nghiệm nhằm xác định quy trình cho hiệu suất tối ưu.
• Kết quả định tính (Bảng 3.2): Xác nhận sự có mặt của khung cấu trúc terpenoid – steroid trong cả 4 mẫu thực nghiệm thông qua các phản ứng màu dương tính với thuốc thử Liebermann – Burchard, Rosenheim và Noller.
• Đánh giá chỉ tiêu hóa – lý: Phân tích giá trị chỉ số acid ($I_A$) và chỉ số xà phòng hóa ($I_S$) của các mẫu chiết để đánh giá hàm lượng acid béo tự do còn sót lại và phân tử lượng trung bình của các cấu tử trong phân đoạn.
• Thành phần hóa học qua GC/MS (Bảng 3.4): Liệt kê các cấu tử terpenoid – steroid được định danh từ dữ liệu phổ khối GC/MS thực hiện tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM.
• Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 3.5): Ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn của phân đoạn chiết xuất đối với các chủng vi khuẩn khảo sát trên đĩa thạch MHA, chứng minh khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của sản phẩm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Xây dựng và hoàn thiện 4 quy trình thực nghiệm chiết tách phân đoạn terpenoid – steroid từ hoa cúc La Mã (Chamaemelum nobile), kết hợp công đoạn xà phòng hóa bằng KOH ($pH = 10 - 13$) để loại bỏ triệt để tạp chất sáp, nhựa và chất béo.
• So sánh định lượng hiệu suất thu hồi sản phẩm giữa các phương pháp: chưng ninh, ngấm kiệt, chiết Soxhlet bằng dung môi ethanol 70% và chiết Soxhlet bằng dung môi ether dầu hỏa.
• Xác định đầy đủ các thông số hóa lý quan trọng bao gồm chỉ số acid ($I_A$) và chỉ số xà phòng hóa ($I_S$) của các mẫu cao chiết thu được.
• Định tính thành công sự hiện diện của khung steroid – triterpenoid bằng hệ thống phản ứng hóa học màu đặc trưng (Liebermann – Burchard, Rosenheim, Noller).
• Định danh các hợp chất hữu cơ thành phần trong phân đoạn bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) và xác định độ nhạy kháng khuẩn thông qua đường kính vòng vô khuẩn trên môi trường thạch MHA.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tác giả đề xuất mở rộng quy mô chiết tách từ phòng thí nghiệm lên quy mô pilot hoặc bán công nghiệp để đánh giá tính khả thi kinh tế kỹ thuật.
• Kiến nghị ứng dụng các kỹ thuật chiết tách hiện đại như chiết có hỗ trợ sóng siêu âm hoặc trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn ($CO_2$ siêu tới hạn) nhằm rút ngắn thời gian chiết, giảm tiêu hao dung môi và bảo toàn các hoạt chất nhạy nhiệt.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tinh chế phân lập các hợp chất đơn lẻ (như $\alpha$-bisabolol, chamazulene) và thử nghiệm mở rộng hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư hoặc các chủng vi nấm gây bệnh.

Đóng góp của đề tài

Công trình đóng góp quy trình chiết tách thực nghiệm có tính hệ thống đối với nhóm hợp chất terpenoid – steroid từ nguồn hoa cúc La Mã nhập khẩu. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm đối chứng về hiệu suất, chỉ số hóa lý, thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn, tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và ứng dụng tinh dầu cúc La Mã trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với lượng mẫu 100g bột dược liệu khô cho mỗi mẻ chiết; chưa triển khai thực nghiệm so sánh với các kỹ thuật chiết hiện đại (vi sóng, chất lỏng siêu tới hạn) do giới hạn về trang thiết bị tại cơ sở đào tạo; sản phẩm dừng lại ở mức phân đoạn hợp chất sau xà phòng hóa mà chưa tinh chế đến từng đơn chất tinh khiết.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Nghiên cứu tối ưu hóa các thông số công nghệ (tỷ lệ dung môi, nhiệt độ, thời gian) bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm; triển khai phân tách các cấu tử chính bằng sắc ký cột cổ điển hoặc HPLC điều chế; đánh giá chuyên sâu cơ chế kháng khuẩn và thử nghiệm độc tính tế bào in vitro.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Kỹ thuật Hóa dầu, Hóa dược, Hóa hợp chất thiên nhiên và Công nghệ Thực phẩm.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao gồm:

• Quy trình chiết Soxhlet và ngấm kiệt kết hợp phản ứng xà phòng hóa tách phân đoạn không xà phòng hóa (terpenoid – steroid).
• Phương pháp luận và quy trình thực hiện các phản ứng định tính màu phát hiện steroid và triterpenoid.
• Quy trình thực nghiệm chuẩn độ thể tích xác định chỉ số acid và chỉ số xà phòng hóa cho tinh dầu và cao chiết thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Đồ án đã so sánh những phương pháp chiết tách nào từ hoa cúc La Mã?
Tác giả đã thực hiện và so sánh 4 quy trình thực nghiệm trên 100g bột hoa cúc La Mã: (1) Trích ly bằng dung môi dễ bay hơi (phương pháp chưng ninh có gia nhiệt và khuấy trộn); (2) Phương pháp ngấm kiệt bằng ethanol 70% (ngâm 24 giờ, tốc độ rút 1 ml/phút); (3) Phương pháp chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethanol 70%; (4) Phương pháp chiết Soxhlet sử dụng dung môi ether dầu hỏa.

2. Mục đích của giai đoạn xử lý bằng dung dịch KOH ở $pH = 10 - 13$ trong quy trình chiết là gì?
Giai đoạn xử lý cao cồn bằng dung dịch kiềm KOH ($pH = 10 - 13$) ở nhiệt độ 60°C trong 3 giờ nhằm xà phòng hóa hoàn toàn các chất béo (triacylglycerol) và các acid béo tự do chuyển thành dạng muối tan trong nước. Sau đó, việc lắc chiết với dung môi kém phân cực ether dầu hỏa sẽ giúp thu riêng phân đoạn terpenoid – steroid không bị xà phòng hóa, loại bỏ hoàn toàn tạp chất béo.

3. Những phản ứng hóa học nào được sử dụng để định tính terpenoid – steroid trong đồ án?
Trong thực nghiệm tại Chương 2 và Chương 3, tác giả sử dụng 3 phản ứng định tính chính:

• Phản ứng Liebermann – Burchard (anhydrid acetic + chloroform + $H_2SO_4$ đậm đặc): steroid cho màu xanh dương – lục, triterpenoid cho màu đỏ.
• Phản ứng Rosenheim (mẫu thử + acid trichloroacetic): dương tính chuyển màu xanh dương.
• Phản ứng Noller (mẫu thử trong chloroform + dung dịch $SnCl_4$): xuất hiện màu đặc trưng bền so với ống đối chứng.

4. Phân đoạn terpenoid – steroid được xác định các chỉ số hóa lý nào và theo nguyên tắc gì?
Tác giả xác định hai chỉ tiêu hóa học:

• Chỉ số acid ($I_A$): Xác định lượng acid béo tự do bằng cách hòa tan mẫu trong ethanol và chuẩn độ trung hòa bằng dung dịch KOH 0.1 N với chỉ thị phenolphthalein.
• Chỉ số xà phòng hóa ($I_S$): Đánh giá phân tử lượng trung bình của acid béo bằng cách đun hoàn lưu mẫu với lượng dư KOH 0.1 N trong 1 giờ 30 phút, sau đó chuẩn độ lượng KOH dư bằng dung dịch chuẩn HCl 0.1 N (có làm mẫu trắng đối chứng).

5. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp nào?
Thành phần hóa học được phân tích định danh và định lượng bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM (sử dụng cột 30m, khí mang Helium, nhiệt độ lò 40 – 320°C). Hoạt tính sinh học được khảo sát thông qua phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn kháng khuẩn trên môi trường thạch MHA sử dụng dung môi hòa tan DMSO và chuẩn độ đục vi sinh McFarland 0.5.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Thu Thuỷ đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về mặt thực nghiệm và phân tích đối với nhóm hợp chất terpenoid – steroid trong hoa cúc La Mã (Chamaemelum nobile). Bằng việc xây dựng và đối chứng 4 quy trình chiết tách kết hợp xà phòng hóa loại tạp, tác giả đã thu nhận và đánh giá toàn diện phân đoạn hoạt chất thông qua các chỉ số hóa lý, phản ứng định tính, phân tích GC/MS và thử nghiệm kháng khuẩn. Công trình cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm tin cậy, đóng góp tài liệu kỹ thuật có giá trị cho lĩnh vực chiết tách và chế biến các hợp chất thiên nhiên từ nguồn dược liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về hoa cúc la mã Cúc La Mã là một loại thảo dược lâu đời nổi tiếng ở Ai Cập cổ đại, Hy Lạp và La Mã. Suốt thời trung cổ mọi người xem nó như một phương thuốc trị các bệnh phổ biến như hen suyễn, đau bụng, sốt, viêm, buồn nôn, các bệnh thần kinh, bệnh ngoài da và ung thư [ 11].1 Nguồn gốc Hoa Cúc La Mã có nguồn gốc từ Nam và Đông Âu [5]. Trước đây, hoa cúc La Mã là một cây cỏ mọc hoang. Nhưng từ khi các nhà khoa học tìm ra được các thành phần dược liệu quý từ loài hoa này thì đã có nhiều nước trên thế giới quan tâm phát triển việc trồng loại cây này.

Ban đầu, hoa cúc La Mã được trồng ở Đức, Hungary, Pháp, Nga, Nam Tư và Brazil sau đó được du nhập rộng rãi đến Ấn Độ trong thời kỳ Mughal. Loài này cũng có thể được tìm thấy ở Bắc Phi, các vùng ôn đới của Châu Á,Bắc và Nam Mỹ, Australia [6]. Cúc La Mã đã được di thực vào Việt Nam từ những năm 60 và đến năm 1978 Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bước đầu nghiên cứu được kỹ thuật trồng hoa cúc La Mã nhưng chưa nhân rộng được cây này vì chưa có những công trình nghiên cứu và ứng dụng [1].2 Đặc điểm hình thái, điều kiện sinh trưởng và phát triển Hoa cúc La Mã (Chamaemelum Nobille hay còn gọi là Roman Chamomile) là cây thảo dược lâu năm với rể trục mỏng, thân mọc đứng gần mặt đất và phân nhánh, lá kép dài và hẹp với các đoạn hình dải nhọn như gai, cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 10-30mm, với một vòng đơn các cánh hoa hình lưỡi trắng và ở giữa rất nhiều hoa con hình ống màu vàng xếp trên mặt đế hoa phồng lên tạo dạng nón sau Đồ  án  tốt  nghiệp    2   Khoá:  2011  -­‐  2015   Khoa  hoá  học  &  CNTP                                                                                                                                                                                                                                                                                                    Trường  ĐHBRVT   khi hoa nở [5] [6]. Đặc điểm hình thái của hoa cúc La Mã được thể hiện ở hình sau: − Hoa cúc La Mã là loài hoa dễ trồng nên chúng sống được trên nhiều loại đất, đặc biệt chúng thích hợp với loại đất cát, thoát nước tốt với độ pH trong khoảng 4,8 đến 8,3 [21] và chịu nắng.

Tại Banthra trang trại của Viện Ngiên cứu Bách Thảo Quốc gia ở Ấn Độ đã nghiên cứu và trồng thành công loài cúc này trên đất có độ pH=9 [6]. − Nó có thể chịu được thời tiết lạnh với nhiệt độ từ 2oC-20oC và có thể trồng bằng hai phương pháp là gieo hạt trực tiếp từ các hạt giống hoặc cấy. − Loài cúc này không cần một lượng phân lớn nhưng cần phải kiểm tra chất đất và cần bón một ít phân NPK vào đất trước khi trồng. Bổ sung các chất hữu cơ làm tăng hàm lượng mùn của đất và do đó cải thiện hiệu suất cây trồng.

− Mặc dù hoa cúc là loài chịu hạn, nhưng nó cũng cần đủ nước để nảy mầm và cho sự phát triển của cây con. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 400 đến 1 400 mm mỗi mùa là đủ để có một vụ mùa tốt. − Khi cây trồng phát triển, nó phát triển thành nhiều cụm, cao khoảng 30cm. Cúc La Mã ra hoa vào khoảng tháng 6-9, hoa có mùi thơm đậm và có vị chát khi được sử dụng như trà [5] 6].

Hoa được thu hoạch vào mùa hè khi đang nở rộ, thu hoạch tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 22-25oC. Tại Nam Phi, năng suất hoa khô có thể thu hoạch được mỗi năm là từ 2-6 tấn/ha và đến năm 1995 ở thế giới là khoảng 500 tấn [21].3 Thành phần dược liệu có trong hoa cúc La Mã Theo nghiên cứu của George Nemeca, trong hoa cúc La Mã có khoảng 120 hoạt chất đã được xác định, trong đó có 28 terpenoid – steroid, 36 flavonoids và 52 hợp chất bổ sung khác đã được xác định[14],[15]. Theo Lemberkovics E và các cộng sự của công, các thành phần chính Đồ  án  tốt  nghiệp    3   Khoá:  2011  -­‐  2015   Khoa  hoá  học  &  CNTP                                                                                                                                                                                                                                                                                                    Trường  ĐHBRVT   của tinh dầu chiết xuất từ hoa cúc La Mã là terpenoids như α-Bisabolol và azulenes ôxít của nó bao gồm chamazulene và các dẫn xuất axetylen. Chamazulene và Bisabolol không ổn định và được bảo quản tốt nhất trong cồn rượu.

Tinh dầu hoa cúc La Mã có chứa ít chamazulene và chủ yếu được cấu thành từ các este của axit thiên nhiên và axit tiglic. Nó cũng chứa farnesene và α-pinen. Hoa cúc La Mã có chứa tới 0,6% sesquiterpene lactones loại germacranolide, chủ yếu là nobilin và 3-epinobilin. Cả hai α-Bisabolol, Bisabolol oxit A và B và chamazulene hoặc azulenesse, farnesene và spiro- ether lactones quiterpene, glycosides, hydroxycoumarins, flavanoids (apigenin, luteolin, patuletin, và quercetin), coumarin (herniarin và umbelliferone), terpenoid, và chất nhầy được coi là thành phần sinh học hoạt động cao [16] [17].

Thành phần chính khác của hoa bao gồm một số hợp chất phenolic, chủ yếu là các flavonoid apigenin, quercetin, patuletin như glucosides và các dẫn xuất acetyl hóa khác nhau. Trong số các chất flavonoid, apigenin là hợp chất có triển vọng nhất. Nó hiện diện với số lượng rất nhỏ như apigenin tự do, nhưng chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside [18][ 19].2 Đặc điểm các hợp chất Terpenoid – Steroid Terpenoid là một loại hợp chất thiên nhiên quan trọng có khả năng tạo mùi thơm và có hoạt tính sinh học mạnh. Terpenoid phân bố rộng rãi trong thiên nhiên và có nhiều ở cây có tinh dầu.

Ngoài ra terpenoid cũng có mặt trong thực vật bậc thấp như tảo, nấm đến thực vật bậc cao, trong động vật và vi khuẩn. Vào năm 1818 người ta đã tìm được một số hợp chất và xác định được rằng tỉ lệ nguyên tử C:H ở tinh dầu là 5:8. Tiếp thep đó là một số hợp chất hidrocacbon không no, không vòng hoặc có vòng đã được tách ra. Chúng có công chung là (C5H8)n ,(n≥2) và được đặt tên là terpenoid.

Terpenoid được Dumas đặt tên cho tinh dầu có trong dầu turpentine vào Đồ  án  tốt  nghiệp    4   Khoá:  2011  -­‐  2015   Khoa  hoá  học  &  CNTP                                                                                                                                                                                                                                                                                                    Trường  ĐHBRVT   năm 1866. Terpenoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là thành phần dễ bay hơi trong các loại dầu thực vật. Cấu trúc của terpenoid bao gồm các monomer được gọi là isoprene. Isoprenoid là tên gọi khác của terpenoid [1][2][3].

CH3 CH2 H2C Isoprene Myrcene Cấu trúc camphor được xác định bởi Bredt vào năm 1893, Pinene bời Wagner 1894, Citral bởi Tiemann năm 1895, 𝛽-carotene được tách từ carrots năm 1837 bời Wackenrodder và đến năm 1907 cấu trúc chính xác đã được xác định bởi Willstaetter. Tuỳ theo số đơn vị isoprene (n) mà người ta chia terpenoid ra thành nhiều loại khác nhau: Bảng 1.1: Phân loại terpenoid Số n Loại terpenoid Số carbon Nguồn gốc 1 Hemiterpen 5 Tinh dầu 2 Monoterpen 10 Tinh dầu 3 Sesquiterpen 15 Tinh dầu 4 Sesterpen 20 Nhựa dầu 5 Diterpen 25 (hiếm) 6 Triterpen 30 sterol, saponin 8 Tetraterpen 40 caroten >8 Politerpen >40 caosu Theo Ingold, trong các hợp chất terpenoid nói trên, các đơn vị isoprene nối với nhau theo nguyên tắc “đầu – đuôi”. Đồ  án  tốt  nghiệp    5   Khoá:  2011  -­‐  2015   Khoa  hoá  học  &  CNTP                                                                                                                                                                                                                                                                                                    Trường  ĐHBRVT   C C C C C 1 2 3 4 Đầu của đơn vị isoprene này nối với đuôi của đơn vị isoprene khác. Quy tắc “đầu – đuôi” này chỉ áp dụng đúng với monoterpen, sesquiterpen, diterpen, sesterpen, còn triterpen và tetraterpen nối C-C ở giữa dây carbon là nối “đuôi – đuôi” [1].

Trong tinh dầu chủ yếu chỉ chứa hai loại terpenoid là monoterpen và sesquiterpen.