Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Song Hạnh Nguyên (chuyên ngành Sư phạm Hóa học, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đào Hùng Cường và PGS.TS Lê Tự Hải giai đoạn 2017–2018) tập trung vào quy trình chiết tách thực nghiệm và khảo sát thành phần hóa học của cây tầm gửi ký sinh trên cây khế chua (Taxillus chinensis (DC.) Danser ký sinh trên Averrhoa carambola).
Về lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn, tác giả đặt vấn đề dựa trên thực trạng gia tăng nhanh chóng của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa trong thế kỷ XXI, trọng tâm là bệnh đái tháo đường. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (IDF) được tác giả dẫn chứng, năm 2017 thế giới có khoảng 425 triệu người trưởng thành mắc đái tháo đường và dự báo chạm mốc gần 700 triệu người vào năm 2045; tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh chiếm khoảng 5,4% dân số (khoảng 5 triệu người), đặc biệt ghi nhận mức 12% tại Thành phố Hồ Chí Minh và 13% tại Bình Dương năm 2015. Xu hướng y học hiện đại ưu tiên kết hợp các dưỡng chất tự nhiên nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và hạn chế tác dụng phụ. Cây tầm gửi (Taxillus chinensis (DC.) Danser thuộc họ Loranthaceae) là vị thuốc dân gian đa dạng, tuy nhiên hoạt tính sinh học và thành phần hóa học thay đổi phụ thuộc trực tiếp vào loài cây chủ mà nó ký sinh. Đa số các chế phẩm thảo dược từ tầm gửi vẫn là hỗn hợp phức tạp, chưa phân lập và xác định rõ các hợp chất hiệu lực.
Mục tiêu nghiên cứu được xác định gồm ba nhiệm vụ cụ thể:
- Tìm kiếm và thiết lập điều kiện thực nghiệm thích hợp để chiết tách các nhóm hợp chất từ lá cây tầm gửi ký sinh trên cây khế chua bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
- Phân lập và xác định thành phần hóa học của các dịch chiết và phân đoạn thu được từ lá cây tầm gửi trên cây khế chua.
- Bổ sung tư liệu khoa học thực nghiệm về thành phần hóa thực vật của loài tầm gửi trên cây khế chua, làm nền tảng cho các nghiên cứu dược liệu tiếp theo.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Lá cây tầm gửi ký sinh trên cây khế chua (Taxillus chinensis (DC.) Danser, họ Loranthaceae).
- Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu lá tươi được thu hái tại quận Liên Chiểu, thành phố Đà Nẵng vào tháng 5/2016; các phân tích thực nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng trong thời gian từ tháng 08/2017 đến tháng 03/2018.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết của đề tài dựa trên phân loại học thực vật của họ Tầm gửi (Loranthaceae), các nhóm hợp chất tự nhiên thứ cấp trong thực vật (alkaloid, flavonoid, steroid, glycosid, lipid, phenol, tannin, sesquiterpen lacton) và nguyên lý phân tích hóa học hợp chất thiên nhiên.
Phương pháp nghiên cứu thực tế bao gồm các kỹ thuật thực nghiệm hóa học:
- Xử lý mẫu và chiết ngâm dầm (Maceration): 1.000 g bột lá khô xay mịn được ngâm chiết ngập trong dung môi ethanol 96° ở nhiệt độ phòng qua 3 lần chiết (lần 1 dùng 8.000 ml trong 24 giờ, lắc đều định kỳ 15 phút mỗi 8 giờ; lần 2 và 3 mỗi lần dùng 7.000 ml). Dịch chiết được lọc qua phễu Büchner và cô quay chân không loại dung môi để thu cao tổng ethanol.
- Chiết phân bố lỏng – lỏng: 75 g cao tổng ethanol được hòa tan trong lượng cồn tối thiểu và nước cất, sau đó tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng phân đoạn liên tiếp 3 lần bằng 400 ml n-hexane và 3 lần bằng 400 ml dichloromethane (diclometane) theo chiều tăng dần của độ phân cực.
- Định tính thành phần nhóm chức hóa thực vật: Sử dụng các phản ứng hóa học màu và tạo kết tủa đặc trưng trên dịch chiết dichloromethane với các hệ thuốc thử: Mayer, Dragendorff, Wagner (alkaloid); $H_2SO_4$ đậm đặc, NaOH 1%/ethanol, $AlCl_3$ 1%/ethanol (flavonoid); Salkowski, Liberman-Burchard, Rosenthaler (steroid); Keller-Killiani, Tollens, Phenol-$H_2SO_4$ (glycosid); $H_2SO_4$ 50%/methanol, Glucose-Anilin, hơi iod (lipid); Vanilin/HCl đặc, $FeCl_3$ 5%/nước, Bortrager (phenol); Gelatin mặn, Stiasny, $FeCl_3$ 5% (tanin); $H_2SO_4$ đặc, $AgNO_3$ 0,1N + $NH_4OH$ 5N, Baljet (sesquiterpen lacton).
- Phân lập bằng sắc ký cột cổ điển và sắc ký lớp mỏng (TLC): Nạp 12,021 g cao dichloromethane vào cột sắc ký nhồi chất hấp phụ silica gel. Quá trình giải ly được theo dõi bằng hệ dung môi ethyl acetate:dichloromethane (1:9) và hệ đa dung môi (benzene, dichloromethane, ethyl acetate, chloroform), thu 229 lọ giải ly (mỗi lọ 10–15 ml) và gộp phân đoạn dựa trên sắc ký đồ bản mỏng hiện màu bằng dung dịch vanillin 1% trong axit sunfuric hoặc soi dưới đèn UV (254 nm và 365 nm).
- Phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS): Mẫu dịch chiết làm khan bằng $Na_2SO_4$ được phân tích trên hệ thống Agilent Technologies 7890A/5975C (USA) với cột mao quản HP-5 (30 m × 250 µm × 0,25 µm). Thông số vận hành: buồng tiêm mẫu 280°C, tỷ lệ chia dòng 5:1, thể tích tiêm 1 µL, khoảng quét khối phổ 28–600 m/z, nhiệt độ nguồn ion 230°C, nhiệt độ bộ tứ cực 150°C. Chương trình nhiệt độ lò: gia nhiệt từ 50°C lên 120°C (7°C/phút), từ 120°C lên 200°C (4°C/phút, giữ 5 phút), từ 200°C lên 300°C (10°C/phút, giữ 10 phút).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương này trình bày tổng hợp các nghiên cứu thực vật học, dược lý học và thành phần hóa học của chi Taxillus và họ Loranthaceae. Về mặt thực vật, họ Tầm gửi chứa khoảng 68–77 chi và 950–1.000 loài thân gỗ bán ký sinh. Chi Taxillus chinensis có thân gỗ giòn, cành chia đốt, lá đơn mọc đối hoặc chụm ba, hạt phủ chất nhầy sệt giúp bám chặt vào thân cây chủ.
Về giá trị y học, các công trình quốc tế được tác giả điểm lại gồm: nghiên cứu của Wongsatit Chuakul tại Thái Lan về việc dùng nước sắc tầm gửi ký sinh trên cây xoài trị tiểu đường; nghiên cứu năm 2006 của Nina Artani và cộng sự tại Indonesia đã tách được hai hợp chất chống oxy hóa là quercitrin ($C_{21}H_{20}O_{11}$) và quercetin ($C_{15}H_{10}O_7$) từ cao ethanol của tầm gửi Dendrophthoe pentandra ký sinh trên cây khế (Averrhoa carambola). Tại Việt Nam, tác giả ghi nhận công trình năm 2009 của Nguyễn Hoàng Hạt tách $\beta$-sitosterol và $\beta$-sitosteryl arachidate từ lá tầm gửi trên cây mít; nghiên cứu của Phạm Văn Ngọt và cộng sự (2010, 2011) về hoạt tính kháng khuẩn (Staphylococcus aureus, MRSA, Bacillus subtilis) và độc tính gây độc tế bào ung thư HeLa, NCI-H460, MCF-7 của cao chiết tầm gửi; nghiên cứu của Nguyễn Thị Hằng và Trần Thị Thanh Xuân (2015) về hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 100 µg/ml; cùng nghiên cứu năm 2010 của Khuất Thư Nga trên loài Macrosolen cochinchinensis.
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, danh mục 14 loại hóa chất tinh khiết (hexane, ethyl acetate, ethanol 96%, dichloromethane, $H_2SO_4$ 98%, $Bi(NO_3)_3 \cdot H_2O$ 98%, KI, HCl đậm đặc, $HgCl_2$, NaOH, $AgNO_3$ 99,8%, $NH_4OH$, vanillin, methanol) cùng hệ thống thiết bị phân tích (máy GC-MS 7890A/5975C, tủ sấy, cân phân tích, máy cô quay chân không, đèn UV 254/365 nm).
Chương này trình bày phương pháp nạp mẫu cột sắc ký (dạng sệt và dạng bột khô gắn trên silica gel), quy trình xác định hệ dung môi giải ly tối ưu qua bản mỏng TLC, tính toán hệ số lưu giữ $R_f = a/b$, công thức pha thuốc thử vanillin 1% (200 ml $CH_3OH$, 25 ml $CH_3COOH$ đậm đặc, 11 ml $H_2SO_4$ đậm đặc, 1,2 g vanillin) và quy trình vận hành chi tiết của 8 nhóm phản ứng định tính hóa thực vật.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày các kết quả thu được từ quá trình chiết tách, định tính và phân tích sắc ký:
- Hiệu suất ngâm chiết cao tổng ethanol: Tổng lượng dung môi ethanol 96° đưa vào chiết 3 lần là 22.000 ml, thu được 19.450 ml dịch chiết (lần 1: 6.120 ml do mẫu trương nở mạnh; lần 2: 6.620 ml; lần 3: 6.710 ml). Sau khi cất loại dung môi, từ 1.000 g bột lá khô thu được 175,0 g cao tổng ethanol, đạt hiệu suất 17,5%.
| Lần chiết |
Thể tích ethanol ban đầu (ml) |
Thể tích dịch chiết thu được (ml) |
| Lần 1 |
8.000 |
6.120 |
| Lần 2 |
7.000 |
6.620 |
| Lần 3 |
7.000 |
6.710 |
| Tổng cộng |
22.000 |
19.450 |
-
Chiết lỏng – lỏng phân đoạn: Từ cao chiết tổng, tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng thu được 13,450 g cao phân đoạn n-hexane và 12,021 g cao phân đoạn dichloromethane.
-
Kết quả định tính nhóm chức hóa thực vật trong cao dichloromethane: Phân đoạn cao dichloromethane phản ứng dương tính rõ rệt với 5 nhóm chất và âm tính với 3 nhóm chất:
| Nhóm chức |
Thuốc thử 1 |
Thuốc thử 2 |
Thuốc thử 3 |
Kết luận |
| Alkaloid |
Mayer: Hóa vàng do tan tủa (+) |
Dragendorff: Cam, không tủa (+) |
Wagner: Cam đỏ, không tủa (+++) |
Dương tính (+) |
| Flavonoid |
$H_2SO_4$ đặc: Đỏ (+++) |
NaOH 1%: Vàng cam (+) |
$AlCl_3$ 1%: Xanh đen (++) |
Dương tính (+) |
| Steroid |
Salkowski: Không phản ứng (-) |
Liberman-Burchard: Không phản ứng (-) |
Rosenthaler: Không phản ứng (-) |
Âm tính (-) |
| Glycosid |
Keller-Killiani: Xanh lục (+) |
Tollens: Tủa Ag đen (++) |
Phenol-$H_2SO_4$: Nâu đen (+) |
Dương tính (+) |
| Lipid (Chất béo) |
$H_2SO_4$ 50%/MeOH: Không phản ứng (-) |
Glucose-Anilin: Không phản ứng (-) |
TLC hơi Iod: Không xuất hiện vết (-) |
Âm tính (-) |
| Phenol |
Vanilin + HCl đặc: Không phản ứng (-) |
$FeCl_3$ 5%: Xanh đen (+++) |
Bortrager: Nâu đen (+++) |
Dương tính (+) |
| Tannin |
Gelatin mặn: Không phản ứng (-) |
Stiasny: Không phản ứng (-) |
$FeCl_3$ 5%: Không phản ứng (-) |
Âm tính (-) |
| Sesquiterpen lacton |
$H_2SO_4$ đặc: Không phản ứng (-) |
$AgNO_3 + NH_4OH$: Tủa Ag li ti + trầm đỏ (+++) |
Baljet: Vàng cam (++) |
Dương tính (+) |
- Kết quả phân tích GC-MS cao dichloromethane: Sắc ký khí khối phổ ghi nhận các cấu tử chính gồm:
- 1,2,3,4-tetramethylcyclobutane ($C_8H_{16}$): thời gian lưu 4,45 phút, diện tích peak 3,80%.
- butan-1-ol ($C_4H_{10}O$): thời gian lưu 4,98 phút, diện tích peak chiếm 62,20%.
- Nhóm phenol: 4-(2-hydroxyethyl)phenol ($C_8H_{10}O_2$), (E)-4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol, 3-(2-amino-1-hydroxyethyl)phenol.
- Nhóm acid béo: 4,5,7-trihydroxyoct-2-enoic acid ($C_8H_{14}O_5$), 2-hydroxypropanoic acid ($C_3H_6O_3$), n-hexadecanoic acid ($C_{16}H_{32}O_2$ - axit palmitic), 9-octadecenoic acid (Z) (axit oleic).
- Kết quả phân lập sắc ký cột: Quá trình giải ly 12,021 g cao dichloromethane trên cột với hệ ethyl acetate:dichloromethane (1:9) và các hệ phụ trợ (benzene:dichloromethane, benzene:dichloromethane:chloroform) qua 229 bình hứng dung tích 15 ml đã chia tách thành các phân đoạn TDI, TDII, TDIII và phân đoạn nhỏ TDII.2 để tiếp tục khảo sát thành phần.
Kết quả và đóng góp
- Khóa luận xác lập quy trình thực nghiệm chiết dầm bột lá tầm gửi trên cây khế chua với ethanol 96° đạt hiệu suất cao tổng 17,5% (175,0 g từ 1.000 g bột lá).
- Tách thành công hai phân đoạn cao trung gian qua chiết phân bố lỏng – lỏng: 13,450 g cao n-hexane và 12,021 g cao dichloromethane.
- Xác định thực nghiệm sự có mặt của 5 nhóm hoạt chất sinh học quan trọng trong phân đoạn dichloromethane gồm alkaloid, flavonoid, glycosid, phenol và sesquiterpen lacton; đồng thời xác định cao không chứa steroid, lipid và tannin.
- Phân tích GC-MS định danh các hợp chất hữu cơ chính trong phân đoạn dichloromethane, tiêu biểu là butan-1-ol (62,20%), 1,2,3,4-tetramethylcyclobutane (3,80%), cùng các dẫn xuất phenol chống oxy hóa và các acid béo mạch dài có hoạt tính sinh học như axit oleic và axit palmitic.
- Khóa luận đóng góp dữ liệu thực nghiệm cụ thể về thành phần hóa thực vật của mẫu tầm gửi ký sinh trên cây khế chua tại địa bàn Liên Chiểu, Đà Nẵng, bổ sung vào hệ thống cơ sở dữ liệu về họ Loranthaceae tại Việt Nam vốn trước đó chủ yếu tập trung trên các cây chủ như mít, xoài, dâu tằm.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế nghiên cứu: Đề tài mới dừng lại ở việc định tính nhóm chức, khảo sát phổ GC-MS xác định các cấu tử bay hơi và phân lập sơ bộ các phân đoạn qua sắc ký cột; chưa tiến hành tinh chế triệt để để cô lập từng hợp chất đơn lẻ ở trạng thái tinh khiết và chưa thực hiện đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc lập thể chi tiết.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục triển khai sắc ký cột tinh chế trên các phân đoạn thu được (đặc biệt là phân đoạn TDII.2); kết hợp các phương pháp phổ nghiệm hiện đại ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, MS-MS) để xác định cấu trúc hóa học đầy đủ của các hợp chất tinh khiết; tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học thực tế (kháng oxy hóa, kháng khuẩn, hạ đường huyết) trên các cao phân đoạn và hoạt chất tinh chế.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược liệu học. Nội dung đáng tham khảo bao gồm:
- Quy trình chiết ngâm dầm và kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng phân đoạn có đối chứng thể tích dung môi chi tiết.
- Bộ quy trình thực nghiệm 8 phản ứng định tính màu và kết tủa của các nhóm chức hóa thực vật chuẩn mực trong phòng thí nghiệm.
- Kỹ thuật nạp mẫu và giải ly sắc ký cột kết hợp kiểm tra bản mỏng sắc ký lớp mỏng (TLC) cùng chương trình nhiệt độ đo GC-MS trên hệ thiết bị Agilent.
Câu hỏi thường gặp
1. Khối lượng nguyên liệu và hiệu suất thu nhận cao tổng ethanol của đề tài là bao nhiêu?
Tác giả sử dụng 1.000 g bột lá khô cây tầm gửi trên cây khế chua, ngâm chiết qua 3 lần với tổng thể tích 22.000 ml ethanol 96°, thu được 19.450 ml dịch chiết. Sau khi cô quay đuổi dung môi, thu được 175,0 g cao tổng ethanol, đạt hiệu suất 17,5% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu.
2. Phân đoạn cao dichloromethane cho kết quả dương tính và âm tính với những nhóm chất nào?
Kết quả thực nghiệm cho thấy cao dichloromethane phản ứng dương tính với alkaloid, flavonoid, glycosid, phenol và sesquiterpen lacton; phản ứng âm tính (không phát hiện) với steroid, lipid (chất béo) và tannin.
3. Chương trình nhiệt độ lò cột khi phân tích GC-MS được thiết lập như thế nào?
Hệ thống GC-MS sử dụng cột HP-5 với chương trình nhiệt: bắt đầu từ 50°C tăng lên 120°C (tốc độ 7°C/phút); từ 120°C tăng lên 200°C (tốc độ 4°C/phút, giữ đẳng nhiệt 5 phút); từ 200°C tăng lên 300°C (tốc độ 10°C/phút, giữ đẳng nhiệt 10 phút). Nhiệt độ buồng tiêm là 280°C.
4. Những hợp chất hữu cơ nào được định danh nổi bật trong dịch chiết dichloromethane qua phổ GC-MS?
Các hợp chất được định danh bao gồm butan-1-ol (chiếm diện tích peak 62,20%), 1,2,3,4-tetramethylcyclobutane (3,80%), các dẫn xuất nhóm phenol (4-(2-hydroxyethyl)phenol, (E)-4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol, 3-(2-amino-1-hydroxyethyl)phenol) và các acid béo (axit palmitic, axit oleic, 4,5,7-trihydroxyoct-2-enoic acid, 2-hydroxypropanoic acid).
5. Lượng cao dichloromethane đưa vào chạy sắc ký cột là bao nhiêu và sử dụng hệ dung môi giải ly chính nào?
Tác giả sử dụng 12,021 g cao dichloromethane nạp vào cột sắc ký cổ điển nhồi silica gel, tiến hành giải ly bằng hệ dung môi ethyl acetate:dichloromethane theo tỷ lệ 1:9 và các hệ dung môi phối hợp benzene:dichloromethane để thu 229 lọ phân đoạn.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Võ Song Hạnh Nguyên đã xây dựng thành công quy trình thực nghiệm chiết tách, định tính và phân tích thành phần hóa học phân đoạn cao dichloromethane từ lá cây tầm gửi trên cây khế chua (Taxillus chinensis) tại Đà Nẵng. Kết quả nghiên cứu xác định sự hiện diện của các nhóm hoạt chất thứ cấp quan trọng như alkaloid, flavonoid, phenol, glycosid, sesquiterpen lacton cùng các hợp chất phenol và acid béo có giá trị dược lý qua phân tích GC-MS. Công trình cung cấp dữ liệu khoa học thực nghiệm có giá trị, làm tiền đề cho các định hướng phân lập hợp chất tinh khiết và đánh giá hoạt tính sinh học phục vụ y dược học.
