Tổng quan luận án

Axit uric (UA) và ure là các sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của các hợp chất chứa nitơ (purin và axit amin) trong cơ thể người, đóng vai trò là những chỉ số sinh hóa quan trọng giúp theo dõi và đánh giá chức năng hoạt động của gan và thận. Nồng độ UA trong huyết thanh và nước tiểu tăng cao (vượt mức khoảng 420 $\mu\text{M}$ trong huyết thanh và 4,43 mM trong nước tiểu) liên quan trực tiếp đến bệnh gút, bệnh tim mạch và tăng huyết áp; ngược lại, khi nồng độ UA thấp hơn 120 $\mu\text{M}$ và 1,48 mM lại là dấu hiệu của các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson, Alzheimer, đa xơ cứng. Tương tự, ure là sản phẩm thoái hóa của protein, với lượng bài tiết hàng ngày qua nước tiểu khoảng 15–35 g và nồng độ bình thường trong máu dao động từ 16–54 mg/mL ở nam giới và 12–47 mg/mL ở nữ giới; nồng độ ure tăng cao phản ánh tình trạng suy giảm khả năng lọc của thận hoặc các rối loạn bệnh lý nghiêm trọng.

Mặc dù các kỹ thuật phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), điện di mao quản vùng (CZE) và sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (MEKC) có độ nhạy và độ chính xác cao, nhưng các phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, quy trình xử lý mẫu phức tạp và thời gian phân tích kéo dài. Kỹ thuật phân tích điện hóa nổi lên như một giải pháp thay thế nhờ ưu điểm đo nhanh, chi phí thấp, thiết bị nhỏ gọn và khả năng phân tích trực tiếp. Tuy nhiên, khoảng trống nghiên cứu lớn nhất của phương pháp điện hóa nằm ở việc UA, axit ascorbic (AA) và dopamin (DA) cùng đồng tồn tại trong các dịch sinh học và có thế oxy hóa rất gần nhau trên các điện cực thông thường (như điện cực cacbon thủy tinh - GCE, điện cực đĩa Pt hoặc Au), dẫn đến các pic oxy hóa bị chồng lấn và điện cực nhanh chóng bị mất hoạt tính do sự hấp phụ của các sản phẩm phản ứng.

Để giải quyết vấn đề trên, luận án của nghiên cứu sinh Bùi Thị Phương Thảo (bảo vệ năm 2021 tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của PGS. Đỗ Phúc Quân và GS. Trần Đại Lâm) đã xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Nghiên cứu chế tạo điện cực cảm biến xác định hàm lượng ure, UA với độ nhạy và độ chọn lọc đáp ứng yêu cầu đối với mẫu sinh học.
  2. Đánh giá khả năng áp dụng thực tế của cảm biến chế tạo được trên cơ sở xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu sinh học.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

  • Nghiên cứu vật liệu dùng biến tính điện cực để xác định UA bằng phương pháp điện hóa.
  • Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định ure theo nguyên tắc đo điện thế và đo vôn-ampe.
  • Khảo sát các điều kiện tối ưu nhất cho các cấu trúc điện cực đã chế tạo.
  • Sử dụng điện cực mới chế tạo và quy trình xây dựng được để xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu nước tiểu; đánh giá độ tin cậy qua độ đúng, độ lặp lại, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vật liệu nền graphen (Gr), graphen oxit khử (rGO); polyme dẫn polydopamin (PDA), polyanilin (PANi); hạt nano kim loại đồng (CuNPs); enzym ureaza; các chất phân tích mục tiêu gồm axit uric và ure trong môi trường đệm tiêu chuẩn và nền mẫu sinh học.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát các tính chất điện hóa, hình thái cấu trúc bề mặt vật liệu trong phòng thí nghiệm; đánh giá ảnh hưởng của các chất cản trở (AA, DA, glucose, paracetamol, ion nitrit, axit citric) và thử nghiệm phân tích thực tế trên các mẫu nước tiểu người.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế về các phương pháp phân tích UA và ure, đồng thời phân tích cơ chế và hiệu quả của các cấu trúc điện cực biến tính:

Các hướng nghiên cứu phân tích axit uric

  • Phương pháp enzym quang học: San V đã nghiên cứu phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử N-methyl-N-(4-aminophenyl)-3-methoxyanilin (NCP) và N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylanilin (TOOS) với enzym uricaza (Uox), peroxidaza và ascorbat oxyaza, cho khoảng xác định đến 1,428 mmol/L, LOD đạt 0,0035 mmol/L và LOQ đạt 0,015 mmol/L. Galban và cộng sự phát triển phương pháp đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 287 nm và phát xạ 330 nm với dải nồng độ làm việc $3\cdot 10^{-4}\text{ M}$, độ lặp lại 4%. Một số tác giả khác sử dụng phản ứng giữa $\text{H}_2\text{O}_2$ sinh ra từ phản ứng enzym với muối 4-aminodiphenylamin diazonium sulfat (variamin blue RT) đo quang ở 269 nm (LOD 0,58 mM, dải đo 0,5–13 mM).
  • Phương pháp sắc ký HPLC: Kovarik và cộng sự phân tích UA trong 300 mẫu huyết thanh bằng HPLC pha đảo (cột C18, dung môi đệm phosphat pH 4,75 chứa 5% metanol) đạt độ thu hồi 90,0–103,4% và LOD 10,0 $\mu\text{mol/L}$. Hai Fang Li và cộng sự xác định đồng thời creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu bằng RP-HPLC với đầu dò UV tại 205 nm, đạt hệ số tương quan 0,9957–0,9993 và LOD của UA là 0,025 mg/L.
  • Phương pháp điện cực biến tính: Các nghiên cứu sử dụng điện cực hạt nano bis-hydroquinon/$\text{TiO}2$ (BQTMCPE) cho phép tách pic oxy hóa của DA, UA và axit folic (FA) ở pH 8 với khoảng tuyến tính của UA từ 200,0–1500,0 $\mu\text{M}$ (LOD 12,0 $\mu\text{M}$). Tác giả biến tính nano Au trên GCE ghi nhận phương trình hồi quy $I{pa}\text{ (A)} = 0,0121,c_{\text{UA}}\text{ (M)} + 0,323$ ($R^2 = 0,9987$) trong khoảng 2,8–57,5 $\mu\text{M}$. Zheng sử dụng màng $\beta$-cyclodextrin/poly(N-acetylanilin) trên GCE phân tích chọn lọc UA ở pH 5. Kannan và John sử dụng 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazol gắn AuNPs lên điện cực vàng giúp tách pic UA và AA 200 mV (LOD $5\cdot 10^{-8}\text{ mol/L}$). Mathiarasu và cộng sự nghiên cứu màng PEDOT/AuNPs ghi nhận pic oxy hóa phân tách tại 115 mV (DA) và 246 mV (UA).
STT Cấu trúc vật liệu biến tính Khoảng tuyến tính ($\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$) Giới hạn phát hiện ($\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$) Tài liệu trích dẫn
1 $\text{Poly(N-acetylamin)}/\beta\text{-cyclodextrin}$ $10\cdot 10^{-6} - 200\cdot 10^{-6}$ — [64]
2 Poly(3-acetyl thiophen) $12,5\cdot 10^{-9} - 175\cdot 10^{-9}$ — [66]
3 Poly(N,N-dimethyl anilin) $1,25\cdot 10^{-6} - 68,8\cdot 10^{-6}$ — [67]
4 PEDOT $1,0\cdot 10^{-8} - 20\cdot 10^{-8}$ — [69]
5 Polyanilin nano-network $50\cdot 10^{-7} - 250\cdot 10^{-7}$ — [70]
6 Caffeic axit polyme $5\cdot 10^{-7} - 300\cdot 10^{-7}$ — [71]
7 Nafion/ruthenium oxide pyrochlore $0,5\cdot 10^{-7} - 75\cdot 10^{-7}$ — [72]
8 Poly(glycin) $0,05\cdot 10^{-9} - 4\cdot 10^{-9}$ — [74]
9 Poly(fluorescein) $0,5\cdot 10^{-7} - 50\cdot 10^{-7}$ — [75]
10 MIP polyme $28\cdot 10^{-5} - 640\cdot 10^{-5}$ — [76]
11 Thionin-SWNTs nanostructure $0,002\cdot 10^{-6} - 2\cdot 10^{-6}$ — [77]
12 Au / rGO $8,8\cdot 10^{-6} - 53\cdot 10^{-6}$ — [89]
13 AuNPs-GO $20\cdot 10^{-6} - 260\cdot 10^{-6}$ — [90]
14 TCPP-rGO $20\cdot 10^{-6} - 5000\cdot 10^{-6}$ — [91]
15 rGO-ZnO $3\cdot 10^{-6} - 330\cdot 10^{-6}$ — [92]

Các hướng nghiên cứu phân tích ure

  • Phương pháp so màu: Phản ứng với Diacetyl-monoxim (DAM) và thiosemicarbazid (TSC) trong môi trường axit đun nóng có mặt ion $\text{Fe}^{3+}$ tạo phức màu hồng đo tại bước sóng 540 nm (LOD 0,14 $\mu\text{g}$ hay 1,2 nmol, RSD 0,29–1,09%).
  • Phương pháp enzym và sắc ký: Thủy phân bằng ureaza tạo $\text{NH}_3$ rồi chuẩn độ bằng $\text{H}2\text{SO}4$; phương pháp HPLC ghép dẫn xuất xanthydrol đo huỳnh quang ($\lambda{ex} = 213\text{ nm}$, $\lambda{em} = 308\text{ nm}$); phương pháp HPLC pha đảo cột C18 của Zuo phát hiện đồng thời creatinin và UA ở bước sóng 205 nm (LOD lần lượt là 0,045 và 0,062 $\text{mg}\cdot\text{mL}^{-1}$); phương pháp sắc ký trao đổi cation của Tsutomu đo UV tại 200 nm.
  • Phương pháp điện hóa: Sử dụng màng compozit polypyrrol-graphen oxit (PPY-GO) xác định ure trong khoảng 0,5–3,0 $\mu\text{M}$ (LOD 0,27 $\mu\text{M}$); màng hai lớp oxit 170 perchlorat - ethyl cellulose gắn ureaza ($\text{O17-EC/ureaza}$) đo ure trong khoảng 0,01–0,1 M (LOD 0,027 mM) và 0,1–1,0 M (LOD 0,224 mM) với độ thu hồi trên mẫu nước tiểu từ 85–118%.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Kết hợp các đặc tính vượt trội của vật liệu graphen/rGO (độ dẫn điện cao, diện tích bề mặt riêng lớn) với màng polyme dẫn có nhóm chức (polydopamin tạo phức ion đồng $\text{Cu}^{2+}$, polyanilin) và hạt nano kim loại đồng (CuNPs) nhằm tăng cường độ dẫn, hạ thấp thế oxy hóa, tăng tốc độ truyền điện tử và tạo ra rào cản chọn lọc ngăn chặn các chất cản trở sinh học như AA, DA, glucose, paracetamol. Đồng thời, luận án kết hợp cố định enzym ureaza trên đế vi điện cực tích hợp Dropsens phủ màng Gr/PANi để định lượng ure.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các phản ứng hóa sinh

  1. Axit uric: Công thức phân tử $\text{C}_5\text{H}_4\text{N}_4\text{O}_3$ (tên hệ thống: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion; tên khác: 2,6,8-trioxypurin), hằng số phân ly $\text{p}K_a = 5,75 - 10,3$. Ở pH sinh lý 7,4, 98% UA tồn tại dưới dạng muối monosodium urat. Quá trình oxy hóa điện hóa của UA trên bề mặt điện cực tạo sản phẩm chính là allantoin.
  2. Ure: Công thức $\text{CON}_2\text{H}_4$ hoặc $(\text{NH}_2)_2\text{CO}$, phân tử lượng 60,1; khối lượng riêng $1,34\text{ g/cm}^3$; nhiệt độ nóng chảy $132 - 134^\circ\text{C}$; pH dung dịch 10% là 7,2. Cơ chế nhận biết ure qua xúc tác enzym ureaza diễn ra theo chuỗi phản ứng: $$\begin{aligned} (\text{NH}_2)_2\text{CO} + \text{H}_2\text{O} &\xrightarrow{\text{ureaza}} \text{H}_2\text{NCOO}^- + \text{NH}_4^+ \ \text{H}_2\text{NCOO}^- + \text{H}^+ &\rightarrow \text{NH}_3 + \text{CO}_2 \ \text{CO}_2 + \text{H}_2\text{O} &\rightarrow \text{H}_2\text{CO}_3 \ \text{NH}_3 + \text{H}_2\text{O} &\rightarrow \text{NH}_4^+ + \text{OH}^- \ \text{H}_2\text{CO}_3 &\rightarrow \text{H}^+ + \text{HCO}_3^- \ \text{HCO}_3^- &\rightarrow \text{H}^+ + \text{CO}_3^{2-} \end{aligned}$$ Sự gia tăng nồng độ các ion làm thay đổi độ dẫn điện và tín hiệu thế/dòng tại lớp ranh giới tiếp xúc điện cực.
  3. Cảm biến sinh học và chuyển đổi tín hiệu: Luận án tổng quan các cơ chế cố định đầu thu sinh học (vật lý, hóa học) và các bộ chuyển đổi tín hiệu (điện hóa, quang học, nhiệt lượng, vi cân tinh thể thạch anh QCM theo phương trình Sauerbrey: $\Delta f = -2,3 \cdot \Delta m / A$, và hệ vi cơ MEMS).

Thiết bị, hóa chất và dụng cụ

  • Thiết bị điện hóa: Hệ đo điện hóa đa năng Autolab (AUT30.v, Eco Chemie B.V., Hà Lan). Hệ đo 3 điện cực gồm: điện cực làm việc GCE đường kính 2 mm (Metrohm, Thụy Sỹ) hoặc vi điện cực tích hợp Dropsens đường kính 1,6 mm (Hà Lan); điện cực so sánh $\text{Ag/AgCl (KCl 3M)}$; điện cực đối diện Pt.
  • Thiết bị phân tích cấu trúc bề mặt: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (JEOL JSM-6700, Nhật Bản); phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS/EDX); máy quang phổ Raman Jasco NRS-3000 (bước sóng kích thích laser 532 nm, công suất 2 mW).
  • Hóa chất: Graphen, graphit, UA, ure, DA, AA, enzym ureaza (hãng Sigma-Aldrich); $\text{Na}_2\text{HPO}_4\cdot 2\text{H}_2\text{O}$ (Prolabo), $\text{NaH}_2\text{PO}_4\cdot\text{H}_2\text{O}$ (Merck) pha đệm photphat PBS 0,1 M (pH 7,0); $\text{CuCl}_2$, $\text{H}_2\text{SO}_4$, $\text{HCl}$, $\text{NH}_4\text{OH}$, $\text{C}_2\text{H}_5\text{OH}$, $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{NaNO}_2$ (Merck); monome pyrol và anilin (Fluka). Tất cả dung dịch được chuẩn bị bằng nước khử ion (deionized water).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và xử lý thống kê

  • Kỹ thuật điện hóa: Phương pháp Von-ampe vòng (CV) khảo sát cơ chế phản ứng và động học bề mặt; phương pháp Von-ampe xung vi phân (DPV) để đo dòng faraday nồng độ thấp nhằm triệt tiêu dòng điện dung; phương pháp đo dòng - thời gian (Chronoamperometry - CA) và quét thế đa vòng để tổng hợp màng polyme và lắng đọng hạt nano kim loại.
  • Hệ thống công thức thống kê và đặc trưng phân tích:
    • Giá trị trung bình số học: $\bar{x} = \frac{1}{N}\sum_{i=1}^N x_i$
    • Khoảng biến thiên: $R = x_{\max} - x_{\min}$
    • Phương sai và độ lệch chuẩn mẫu: $$S^2 = \frac{1}{N-1}\sum_{i=1}^N (x_i - \bar{x})^2, \quad S = \sqrt{S^2}$$
    • Độ lệch chuẩn tương đối: $\text{RSD} = \frac{S}{\bar{x}} \times 100%$
    • Giới hạn phát hiện và định lượng: $$y_{\text{LOD}} = a + 3S_y \implies \text{LOD} = \frac{3S_y}{m}$$ $$y_{\text{LOQ}} = a + 10S_y \implies \text{LOQ} = \frac{10S_y}{m}$$ (trong đó $a$ là tung độ gốc, $S_y$ là độ lệch chuẩn dư của đường hồi quy, $m = \frac{dy}{dx}$ là độ nhạy đường chuẩn).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 trình bày tổng quan lý thuyết về cấu trúc hóa học, nguồn gốc nội sinh (khoảng 600 mg/ngày) và ngoại sinh (100–200 mg/ngày) của axit uric; mối liên hệ giữa độ hòa tan của UA với pH nước tiểu (ở pH 5,0 độ bão hòa đạt 390–900 $\mu\text{mol/L}$, ở pH 7,0 đạt 9480–12000 $\mu\text{mol/L}$). Tác giả làm rõ cơ chế chuyển hóa sinh hóa và các bệnh lý liên quan khi nồng độ UA và ure thay đổi. Tiếp đó, chương này phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích quang phổ, HPLC và điện hóa; phân loại cấu tạo cảm biến sinh học (đầu thu sinh học từ enzym, kháng thể, protein, axit nucleic, tế bào; các loại chuyển đổi điện hóa, quang, nhiệt, áp điện, vi cơ). Chương 1 cũng tổng kết việc ứng dụng graphen (cấu trúc mạng tổ ong lai hóa $sp^2$, chiều dài liên kết C–C là 0,142 nm), polyme dẫn điện (PDA, PANi, PPy, PEDOT), hạt nano kim loại (AuNPs, CuNPs) và enzym (ureaza, uricaza) trong biến tính điện cực nhằm nâng cao độ dẫn, độ bền và độ chọn lọc cho cảm biến.

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm chế tạo ba hệ điện cực biến tính và các phương pháp phân tích bổ trợ:

  1. Cấu trúc điện cực xác định UA: GCE biến tính bằng màng graphen kết hợp polydopamin tạo phức đồng và hạt nano đồng ($\text{GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs}$) và màng graphen oxit khử kết hợp polydopamin-đồng ($\text{GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs}$). Khảo sát điều kiện phủ màng Gr/rGO, tối ưu hóa quá trình đồng trùng hợp PDA với ion $\text{Cu}^{2+}$, và quá trình khử điện hóa tạo hạt CuNPs.
  2. Cấu trúc điện cực xác định ure: Chế tạo vi điện cực màng enzym trên đế Dropsens ($\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$). Graphen được tổng hợp bằng phương pháp lắng đọng pha hơi hóa học (CVD nhiệt) trên đế đồng; màng polyanilin (PANi) được trùng hợp điện hóa bằng quét thế vòng CV; enzym ureaza được cố định lên lớp màng dẫn.
  3. Quy trình phân tích và đánh giá: Trình bày chi tiết các thông số đo CV, DPV, CA trên hệ thiết bị Autolab; quy trình xử lý mẫu nước tiểu thực tế; quy trình đánh giá sai số, độ lặp lại, độ đúng qua độ thu hồi và so sánh kết quả phân tích với phương pháp tiêu chuẩn tại bệnh viện.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

(Căn cứ theo cấu trúc danh mục bảng và danh mục hình của luận án)

  1. Nghiên cứu điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs xác định axit uric:

    • Tối ưu hóa chế tạo: Khảo sát hàm lượng Gr trên GCE (Bảng 3.1); so sánh phương pháp tổng hợp màng PDA–Cu(II) bằng kỹ thuật dòng - thời gian (CA) và quét thế vòng (CV) (Hình 3.2); khảo sát ảnh hưởng của thời gian điện phân PDA–Cu (Bảng 3.3, Bảng 3.4).
    • Đặc trưng hình thái và tính chất điện hóa: Ảnh SEM và phổ EDS khẳng định sự phân tán đồng đều của màng PDA–Cu(II) và các hạt nano CuNPs trên nền Gr (Hình 3.3). Phép đo CV trong cặp chỉ thị redox $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ 5 mM + KCl 0,1 M cho thấy dòng đỉnh tăng mạnh theo thứ tự: $\text{GCE/Gr/PDA–Cu(II)} < \text{GCE/Gr} < \text{GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs}$ (Hình 3.4). Đồ thị dòng đỉnh anot phụ thuộc tuyến tính vào căn bậc hai của tốc độ quét ($v^{1/2}$ từ 10 đến 120 mV/s), chứng minh quá trình điện cực bị kiểm soát bởi sự khuếch tán (Hình 3.5).
    • Tối ưu hóa điều kiện đo và độ chọn lọc: Tín hiệu DPV của UA trong đệm PBS đạt tối ưu ở pH 7,0 trong khoảng khảo sát pH 2,5–9,0 (Hình 3.8); khảo sát dòng anot trên các điện cực so sánh khác nhau (Hình 3.7). Điện cực thể hiện tính chọn lọc cao, không bị cản trở bởi axit citric, DA và glucose (Hình 3.9, Hình 3.12).
    • Đặc trưng phân tích: Xây dựng đường chuẩn DPV của UA trong đệm PBS 0,1 M pH 7 (Bảng 3.6, Bảng 3.7, Hình 3.10); kiểm tra độ lặp lại và độ ổn định tín hiệu sau nhiều lần đo ở các nồng độ UA khác nhau (Bảng 3.8, Hình 3.11).

  2. Nghiên cứu điện cực GCE/rGO/PDA–Cu(II)/CuNPs xác định axit uric:

    • Tối ưu hóa quy trình tổng hợp: So sánh đáp ứng giữa phương pháp polyme hóa điện hóa ($\text{ePDA}$) và polyme hóa hóa học ($\text{cPDA}$) (Bảng 3.9, Hình 3.13); đánh giá vai trò của ion $\text{Cu}^{2+}$ trong mạng PDA (Bảng 3.10); tối ưu số vòng điện phân PDA–Cu đạt 3 vòng (Bảng 3.12, Hình 3.15) và số vòng điện phân lắng đọng CuNPs đạt 10 vòng trong dung dịch $\text{CuCl}_2\text{ 30 mM} + \text{DA 10 mM}$ quét thế từ -0,3 V đến +0,5 V với tốc độ quét 10 mV/s (Bảng 3.15, Hình 3.17, Hình 3.18).
    • Đặc trưng điện hóa: Khảo sát CV trong $[\text{Fe(CN)}_6]^{3-/4-}$ 1 mM (Hình 3.19) và khảo sát đáp ứng của UA theo tốc độ quét thế từ 20 mV/s đến 125 mV/s (Hình 3.21).
    • Đánh giá cản trở và độ lặp lại: Điện cực duy trì tín hiệu chọn lọc đối với UA ($1,07\cdot 10^{-4}\text{ M}$ hoặc $9,60\cdot 10^{-5}\text{ M}$) khi có mặt các chất cản trở nồng độ cao: DA ($1,07\cdot 10^{-3}\text{ M}$ - Hình 3.23), paracetamol ($6,40\cdot 10^{-4}\text{ M}$ - Hình 3.24), $\text{NO}_2^-$ ($1,06\cdot 10^{-2}\text{ M}$ - Hình 3.25) và glucose ($1,07\cdot 10^{-4}\text{ M}$ - Hình 3.26). Đánh giá khoảng tuyến tính, phương trình đường chuẩn và độ lặp lại phép đo (Bảng 3.11, Bảng 3.13, Bảng 3.14, Bảng 3.16, Bảng 3.17, Bảng 3.18, Bảng 3.19, Bảng 3.20, Hình 3.22, Hình 3.27).

  3. Nghiên cứu điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza xác định ure:

    • Đặc tính vật liệu: Màng graphen tổng hợp bằng CVD nhiệt trên lá đồng được đặc trưng bởi ảnh FE-SEM (Hình 3.28), phổ Raman và ảnh hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao HRTEM (Hình 3.29).
    • Chế tạo và tối ưu hóa: Quá trình trùng hợp điện hóa PANi trên điện cực Pt và Pt/Gr bằng quét thế vòng CV (Hình 3.30); khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đo đến dòng đáp ứng (Hình 3.31); đánh giá ảnh hưởng của chất cản trở axit ascorbic (Hình 3.32).
    • Đặc trưng phân tích ure: Đo tín hiệu dòng đáp ứng với dung dịch ure 2 mM (Bảng 3.21); xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ ure và cường độ dòng (Bảng 3.22, Hình 3.33).

  4. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực tế:

    • Ứng dụng các cảm biến đã chế tạo để định lượng trực tiếp hàm lượng UA và ure trong các mẫu nước tiểu thực tế (Bảng 3.23).
    • Đánh giá độ đúng thông qua phương pháp thêm chuẩn và so sánh đối chiếu với kết quả xét nghiệm chuẩn tại bệnh viện/đơn vị thử nghiệm chuyên nghiệp, ghi nhận độ thu hồi và độ lặp lại tin cậy.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Đóng góp mới về mặt khoa học và phương pháp:

    • Phát triển thành công quy trình công nghệ chế tạo hệ nanocompozit đa lớp mới trên cơ sở graphen/rGO kết hợp với màng polydopamin tạo phức ion đồng $\text{Cu(II)}$ và hạt nano đồng ($\text{CuNPs}$) trên điện cực GCE. Sự kết hợp này mang lại hiệu ứng cộng hưởng xúc tác điện hóa, tăng cường diện tích bề mặt hoạt động và tạo khả năng phân tách tín hiệu điện thế vượt trội.
    • Giải quyết triệt để sự chồng chập pic điện hóa giữa axit uric và các chất chuyển hóa nội sinh có hoạt tính điện hóa tương tự (đặc biệt là axit ascorbic, dopamin, glucose, paracetamol và ion nitrit), cho phép định lượng chọn lọc UA ở nồng độ vi mô mà không cần qua các bước tách chiết phức tạp.
    • Chế tạo thành công cảm biến sinh học định lượng ure dựa trên việc gắn kết màng enzym ureaza lên vi điện cực tích hợp Dropsens được biến tính bằng màng graphen tổng hợp CVD nhiệt và polyme dẫn polyanilin (PANi), nâng cao độ nhạy và tính ổn định tín hiệu.

  2. Đóng góp thực tiễn và kiến nghị ứng dụng:

    • Xây dựng được quy trình phân tích điện hóa tin cậy, thao tác nhanh để xác định hàm lượng axit uric và ure trong mẫu nước tiểu thực tế, cho kết quả tương đương với các phương pháp phân tích tiêu chuẩn trong y học lâm sàng.
    • Đề xuất giải pháp thu nhỏ hệ cảm biến ứng dụng vi điện cực tích hợp, mở ra tiềm năng phát triển các thiết bị phân tích cầm tay (point-of-care testing) phục vụ chẩn đoán sớm và theo dõi tại chỗ bệnh gút, bệnh lý suy thận và rối loạn chuyển hóa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu thực nghiệm phân tích mẫu thực tế chủ yếu tập trung trên đối tượng mẫu nước tiểu; các khảo sát trên nền mẫu huyết thanh và dịch sinh học phức tạp chưa được triển khai sâu do các rào cản về độ bền của màng biến tính và ảnh hưởng hấp phụ của nền protein phức tạp. Hoạt tính của màng enzym ureaza trên điện cực $\text{Pt/Gr/PANi/Ureaza}$ có xu hướng suy giảm theo thời gian bảo quản tương tự đặc tính chung của các cảm biến sinh học gốc enzym.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Hoàn thiện công nghệ cố định enzym nhằm nâng cao độ bền hoạt tính sinh học và kéo dài tuổi thọ sử dụng của cảm biến đo ure.
    • Mở rộng phạm vi phân tích trên nền mẫu huyết thanh, máu toàn phần và các dịch sinh học khác; nghiên cứu các giải pháp biến tính màng chống bám bẩn sinh học (antifouling).
    • Nghiên cứu tích hợp các vi điện cực biến tính vào các chip vi lưu (microfluidic chips) và module đo cầm tay không dây để ứng dụng trực tiếp tại các cơ sở y tế.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa lý thuyết và Hóa lý, Khoa học vật liệu nano, Kỹ thuật y sinh và Công nghệ hóa học.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Đặc biệt có giá trị tham khảo tại Chương 2 và Chương 3 về các quy trình tổng hợp điện hóa màng polyme dẫn (polydopamin, polyanilin), kỹ thuật lắng đọng điện hóa hạt nano kim loại đồng (CuNPs), kỹ thuật CVD nhiệt tổng hợp graphen, cũng như phương pháp luận xử lý thống kê phân tích (xác định LOD, LOQ, đánh giá độ chụm, độ đúng, RSD).
  • Các nhà phát triển thiết bị phân tích y sinh: Cung cấp thông số thực nghiệm hữu ích về việc thiết kế vi điện cực tích hợp Dropsens và các giải pháp triệt tiêu chất cản trở trong phân tích mẫu sinh học lâm sàng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao việc định lượng axit uric bằng các điện cực không biến tính trong mẫu sinh học thường không đạt độ chọn lọc?

Trong các dịch sinh học như máu và nước tiểu, axit uric (UA) luôn đồng tồn tại với axit ascorbic (AA) và dopamin (DA). Cả ba chất này đều có hoạt tính điện hóa và có thế oxy hóa rất gần nhau trên các điện cực thông thường (GCE, Pt, Au). Khi đo von-ampe, các pic oxy hóa bị chồng lấn hoàn toàn thành một pic rộng không phân tách được. Ngoài ra, các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hóa dễ bị hấp phụ hoặc polyme hóa lên bề mặt điện cực, làm suy giảm nhanh chóng hoạt tính điện hóa của cảm biến.

2. Cấu trúc điện cực GCE/rGO/PDA–Cu(II)/CuNPs được chế tạo bằng những điều kiện điện hóa tối ưu nào?

Quá trình chế tạo được tối ưu hóa qua các bước:

  • Tạo màng rGO trên điện cực GCE.
  • Trùng hợp điện hóa màng PDA–Cu(II) với số vòng điện phân tối ưu là 3 vòng trong môi trường chứa dopamin và ion $\text{Cu}^{2+}$.
  • Lắng đọng điện hóa hạt CuNPs với 10 vòng quét thế trong dung dịch chứa $\text{CuCl}_2\text{ 30 mM} + \text{DA 10 mM}$ ở dải thế từ -0,3 V đến +0,5 V với tốc độ quét 10 mV/s.

3. Cảm biến sinh học Pt/Gr/PANi/Ureaza phát hiện ure dựa trên cơ chế nào?

Khi ure tiếp xúc với bề mặt cảm biến, enzym ureaza cố định trên màng xúc tác phản ứng thủy phân ure thành ion amoni cacbamat ($\text{H}_2\text{NCOO}^-$ và $\text{NH}_4^+$), sau đó tiếp tục chuyển hóa thành $\text{NH}_3$, $\text{CO}_2$, $\text{NH}_4^+$, $\text{OH}^-$, $\text{HCO}_3^-$, $\text{CO}_3^{2-}$. Sự xuất hiện và tích tụ của các ion này tại lớp ranh giới tiếp xúc làm thay đổi độ dẫn điện và tín hiệu điện hóa của hệ, được vi điện cực tích hợp ghi nhận và chuyển đổi thành tín hiệu dòng/thế tỷ lệ thuận với nồng độ ure.

4. Những kỹ thuật phân tích nào được sử dụng để kiểm tra hình thái và thành phần của màng biến tính?

Luận án sử dụng các phương pháp phân tích bề mặt hiện đại gồm:

  • Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) để quan sát hình thái vi cấu trúc và độ phân tán của hạt nano.
  • Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS/EDX) để xác định thành phần và tỷ lệ các nguyên tố hóa học trên bề mặt màng.
  • Kính hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM) và máy quang phổ Raman (laser 532 nm) để xác định cấu trúc mạng tinh thể và chất lượng của màng graphen tổng hợp bằng CVD nhiệt.

5. Điện cực biến tính trong luận án đã được thử nghiệm tính chọn lọc với những chất cản trở cụ thể nào?

Khả năng chọn lọc của điện cực đối với UA đã được kiểm chứng thực nghiệm bằng phương pháp DPV khi có mặt các chất cản trở phổ biến ở nồng độ cao:

  • Dopamin (DA) ở nồng độ $1,07\cdot 10^{-3}\text{ M}$ (so với UA $1,07\cdot 10^{-4}\text{ M}$).
  • Paracetamol (PAR) ở nồng độ $6,40\cdot 10^{-4}\text{ M}$ (so với UA $9,60\cdot 10^{-5}\text{ M}$).
  • Ion nitrit ($\text{NO}_2^-$) ở nồng độ $1,06\cdot 10^{-2}\text{ M}$ (so với UA $1,07\cdot 10^{-4}\text{ M}$).
  • Đường glucose ở nồng độ $1,07\cdot 10^{-4}\text{ M}$ và axit citric. Các kết quả đo ghi nhận tín hiệu của UA không bị biến dạng hay dịch chuyển pic trong các môi trường này.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Bùi Thị Phương Thảo đã nghiên cứu toàn diện việc chế tạo và đặc trưng các cấu trúc điện cực biến tính trên cơ sở graphen/rGO kết hợp polyme dẫn (PDA, PANi), hạt nano đồng (CuNPs) và enzym ureaza ứng dụng trong phân tích axit uric và ure. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế nâng cao độ nhạy, tính chọn lọc và loại trừ thành công các ảnh hưởng cản trở của các hợp chất đồng tồn tại trong dịch sinh học. Các quy trình phân tích xây dựng được đã chứng minh độ tin cậy, độ đúng và độ lặp lại cao khi thử nghiệm định lượng trực tiếp trên mẫu nước tiểu thực tế, đóng góp thiết thực cho sự phát triển của chuyên ngành Hóa phân tích và lĩnh vực cảm biến điện hóa y sinh tại Việt Nam.