CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Axit uric và ure 1.1 Giới thiệu chung UA là một hợp chất hữu cơ dị vòng ngưng tụ chứa các dị tố nitơ, ôxi với công thức C5H4N4O3.1: Công thức cấu tạo của UA Tên gọi hóa học: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion Tên gọi khác: 2,6,8 Trioxypurin. UA là một axit yếu với hệ số phân li (pKa) =5,75-10,3. Trong huyết tương với pH= 7,4 thì 98% lượng UA tồn tại dưới dạng muối kiềm : monosodium Urat [26] UA được tạo thành trong cơ thể do quá trình dị hoá các base purin (adenin và guanidin), sau đó chúng được hòa tan trong máu, đưa đến thận và thải ra ngoài qua nước tiểu.
UA trong cơ thể được tạo ra từ hai nguồn sau [27]: Ngoại sinh: từ thức ăn đưa vào cơ thể có chứa chất purin với hàm lượng từ 100 - 200 mg/ngày; Nội sinh: do các tế bào chết của cơ thể sinh ra, khoảng 600 mg/ngày. pH nước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan UA, bình thường lượng UA thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày. pH càng lớn càng thuận lợi cho việc thải UA và ngươc lại càng khó khăn cho việc đào thải UA. - pH 5,0: UA bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L 5 - pH 7,0: UA bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L 1.
Vai trò của UA trong cơ thể UA được hấp thụ từ chế độ ăn qua ruột. Phần lớn chúng sau đó sẽ được đào thải qua thận. Ngoài ra, một lượng đáng kể UA cũng được tái hấp thu bởi cơ quan này (Hình 1. UA được tìm thấy trong các tế bào, mô và cơ quan với các hàm lượng khác nhau.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28] Khi nồng độ UA tăng cao quá mức bão hòa trong huyết tương, trong một số điều kiện vật lý, sẽ xảy ra sự lắng đọng của natri urat ở các khớp trong cơ thể.
Sự lắng đọng này gây tổn thương đến nhiều cơ quan như mạch máu, tim, mắt, màng não, cơ quan sinh dục. Trong đó điển hình là sự lắng đọng ở khớp gây nên các cơn gút cấp do quá trình viêm khớp tái phát nhiều lần. Không chỉ có vậy, tăng UA còn là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý khác. Các tác giả Frederick Mahomed, Alexandre Haig và Nathan Smith Davis là những người đầu tiên đưa ra giả thuyết tăng UA gây tăng huyết áp và bệnh thận.
Đã có một số công trình nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa hàm lượng UA với các bệnh liên quan đến tim mạch bao gồm tăng huyết áp, hội chứng chuyển hóa, bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, 6 tiền sản giật và cả bệnh thận [29-34]. Nghiên cứu chỉ ra rằng nếu UA kết tủa và lắng đọng ở tim mạch thì gây viêm mạch máu, viêm màng ngoài tim; ở vùng đầu gây ra viêm kết mạc, viêm mống mắt, viêm tuyến mang tai, viêm màng não. Nếu kết tủa ở vùng sinh dục, các tinh thể uric gây viêm tinh hoàn, viêm tuyến tiền liệt. Ở chiều ngược lại, nồng độ UA quá thấp có thể dẫn đến các bệnh đa xơ cứng, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và viêm thần kinh thị giác.
Nồng độ UA huyết thanh tăng có thể xuất phát từ một số yếu tố, bao gồm cả nguyên nhân cấp tính và mãn tính. Các nguyên nhân cấp tính của tăng UA máu như uống nhiều rượu, hội chứng ly giải khối u (một biến chứng của hóa trị ung thư) và chế độ ăn uống có nhiều purin hoặc protein. Ngoài ra, tăng UA máu mạn tính có thể xuất phát từ các điều kiện làm giảm mức lọc cầu thận, giảm bài tiết…[34]. Các phương pháp phân tích UA Phương pháp phổ biến để xác định nồng độ UA bao gồm: phương pháp phân tích sử dụng quá trình oxy hóa enzym của UA để tạo ra hydro peroxit, allantoin và cacbon dioxit [35], các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên các cột pha đảo cùng; phương pháp phát hiện bằng phương pháp UV kết hợp khối phổ (MS) [36].
Các phương pháp này bao gồm nhiều bước như chuẩn bị huyết thanh và các yêu cầu của phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm hoặc kỹ thuật ghép enzym xác định gián tiếp nồng độ của chất trung gian H2O2 [37]. Các phương pháp trên đòi hỏi các quy trình vận hành phức tạp, các công cụ đắt tiền và thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu. Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp. * Phương pháp xác định UA sử dụng enzym Uox Tác giả San V [38] dựa trên phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và thuốc thử TOOS, trong hệ thống liên quan đến ba enzym: Uox, peroxidaza và ascorbat oxyaza.
UA uricase allantoin + H2O2 Nồng độ của phức được hình thành bởi sự liên kết oxy hóa của thuốc thử NCP và TOOS tỷ lệ thuận với nồng độ UA. 7 Sử dụng phương pháp này UA có thể được xác định ở nồng độ tối đa lên tới 1,428 mmol/L. Nghiên cứu cho thấy sử dụng thuốc thử NCP có độ nhạy hơn khi xác định UA so với 4-AA. Độ nhạy của phương pháp này khi xác định UA là 0,71 đơn vị độ hấp thụ trên mỗi mmol/L của UA; giới hạn phát hiện là LOD = 0,0035 mmol/L và giới hạn định lượng là LOQ = 0,015 mmol/L UA.
Một số phương pháp cố định enzym UOx dựa trên cảm biến sinh học và phương pháp quang phổ để xác định UA đã được công bố [37-40]. Ngoài ra, đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp quang phổ đơn giản để phát hiện UA trong nước tiểu bình thường và mẫu nước tiểu của bệnh nhân gút dựa trên phản ứng của hydro peroxide (H2O2) với màu vàng của muối 4-Aminodiphenylamin Diazonium Sulfat (variamin blue)(RT) để thu được dung dịch màu vàng lục nhạt. Độ hấp thụ của các sản phẩm là đầu ra của phản ứng enzym và muối RT màu xanh lam được phát hiện bằng máy quang phổ UV với độ hấp thụ tối đa ở 269 nm. Thời gian đáp ứng của phương pháp là 20 phút.
Hoạt tính pH tối ưu trên các phản ứng muối RT của enzym và variamin màu xanh da trời là pH 9. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp này rất tốt ở mức 0,7%. Biểu đồ hiệu chuẩn nồng độ UA khác nhau được tìm thấy trong khoảng 0,5-13 mM với giới hạn phát hiện là 0,58 mM [41]. Galban và cộng sự đã đưa ra một phương pháp xác định UA trong huyết thanh bằng phản ứng với UOx.
Quy trình này dựa trên những thay đổi trong huỳnh 8 quang diễn ra trong phản ứng enzym của UOx với UA khi dung dịch được kích thích ở bước sóng 287 nm và phát xạ được đo ở bước sóng 330 nm. Kết quả cho thấy dải nồng độ làm việc là 3.10−4 M và độ tái lập 4% ứng với n = 7 [42]. * Xác định axit uric bằng phương pháp HPLC Kovarik và đồng nghiệp đã sử dụng các phép đo HPLC trên 300 mẫu huyết thanh được so sánh với phương pháp enzym. Các mẫu huyết thanh được khử protein bằng axit perchloric và được phân tích bằng HPLC với cột pha đảo MAG 1; 4.6 x 150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5µm, pha động bao gồm 5% metanol trong 25 mmol/L natri dihydrogenphosphat pH 4,75.
Kết quả cho thấy sai khác giữa các xét nghiệm và phân tích dưới 5%. Độ thu hồi từ 90,0-103,4%, giới hạn định lượng đạt được 10,0 μmol/L (3,3 pmol/lần tiêm). Kết quả thu được bằng phương pháp sắc ký có sự phù hợp tương đối tốt so với phương pháp enzym, nhưng cho giá trị trung bình cao hơn [43]. Hai Fang Li và đồng nghiệp sử dụng phương pháp HPLC pha đảo (RP-HPLC) detector cực tím (UV) để xác định đồng thời các chất: Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu.
Các mẫu được xử lý bằng cách pha loãng, ly tâm và lọc, thành phần trong các mẫu nước tiểu được phân tách bằng cột ODS-BP, sau đó rửa giải bằng dung dịch đệm metanol/50 mM NaH2PO4 ở pH 5,26 (5:95). Độ tuyến tính của các diện tích peak cực đại và nồng độ các dung dịch tiêu chuẩn thu được cho Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu với các hệ số tương quan trong khoảng 0,9957 – 0,9993. Phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt (giá trị đối với UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 93,49; 97,90% và 95,38%). Giới hạn phát hiện (LOD, S / N≥3) đối với creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 0,010; 0,025; 0,050 và 0,025 mg / L [44].
* Xác định axit uric bằng phương pháp điện hóa Các kỹ thuật điện hóa đã được sử dụng để xác định nhiều chất, phổ biến nhất là các máy đo đường huyết được sử dụng bởi bệnh nhân tiểu đường. Ưu điểm của phương pháp phân tích điện hoá là thời gian tương đối nhanh khi so sánh với các phương pháp quang phổ [45]. Cảm biến điện hóa đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do lợi thế của thời gian phân tích ngắn, 9 quy trình thí nghiệm đơn giản, có thể áp dụng cho nhiều mẫu sinh học và yêu cầu dụng cụ rẻ hơn cùng với độ chọn lọc và độ nhạy cao [46]. Vì UA có thể dễ dàng bị oxy hóa ở các điện cực thông thường trong các dung dịch nước tạo ra allantoin là sản phẩm chính, nên phương pháp điện hóa được ưu tiên lựa chọn [47- 52].
Tuy nhiên, UA và AA thường có mặt đồng thời trong các chất lỏng sinh học như máu và nước tiểu. Pic oxy hóa của UA và AA quá gần nhau, khó tách ra ở các điện cực thông thường, dẫn đến độ chọn lọc kém [53]. Để xác định chính xác UA khi có mặt AA, cần phải phát triển một phương pháp chọn lọc để xác định UA một cách thuận tiện trong xét nghiệm, hạn chế ảnh hưởng sai sót do AA gây ra. Do đó xác định chọn lọc UA và AA đã nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà nghiên cứu điện hóa [54 - 57].
Nồng độ cơ bản của UA và AA trong các mẫu sinh học thay đổi tùy theo tình trạng sức khoẻ, trên phạm vi rộng từ 10-7 đến 10-3 mol/L. Để khắc phục sự ảnh hưởng của AA, xu hướng sử dụng các điện cực biến đổi polyme (PMEs) [58,59] và các điện cực biến đổi hóa học (CME) [60] để phát hiện chọn lọc UA đang nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Việc áp dụng các điện cực biến tính trong điện phân có nhiều ưu điểm như giảm mức oxi hóa khử quá mức, tăng tốc độ truyền điện tử, tăng cường độ nhạy phát hiện và cải thiện độ chọn lọc.