CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 1. Ung thư vú Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1,1 triệu ca và 410.000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới, trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú.
Ở Mỹ, trong những năm gần đây, ước tính có khoảng 230.480 trường hợp mắc ung thư vú xâm lấn và 57.650 trường hợp mắc ung thư vú tại chỗ. Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm, đứng đầu là Anh. Năm 2009, ở Anh mỗi ngày có 125 ca ung thư vú mới, 35 người tử vong do ung thư vú và 12 bệnh nhân được cứu sống do phát hiện sớm. Ở châu Á và một số nước đang phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng đang có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.
Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100,000 phụ nữ ở Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là 20/100,000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010). Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì (Human epithelial growth factor receptor - HER2).
HER2 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984 bởi Schechter AL và các cộng sự. HER2 là protein xuyên màng thuộc họ thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì gồm -3- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com HER1, HER2, HER3 và HER4. Các thụ thể này đều có cấu trúc gồm ba vùng: vùng ngoại bào là vị trí gắn với phối tử, vùng xuyên màng và vùng nội bào có hoạt tính enzyme tyrosine kinase tham gia tương tác với các protein truyền tín hiệu nội bào. Trong đó, thụ thể HER2 không có vị trí gắn với phối tử, vùng nội bào của HER3 không có hoạt tính tyrosine kinase.
Các thụ thể HER chỉ có hoạt tính khi gắn với phối tử, chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào và điều hòa sự phát triển, biệt hóa và tăng sinh của tế bào. HER2 luôn tồn tại ở dạng cấu hình mở nên nó có khả năng tạo dimer với các thụ thể HER khác hoặc với chính nó để tạo phân tử dị dimer hoặc đồng dimer. Khi đó các phân tử dimer liên kết được với phối tử nên thụ thể HER2 có hoạt tính. Tế bào vú bình thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến HER2 biểu hiện trên bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987).
Siêu biểu hiện HER2 làm tăng số lượng phức hợp thụ thể đồng dimer hoặc dị dimer chứa HER2. Những phức hợp thụ thể này phosphoryl hóa protein nội bào gắn với nó làm hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào như MAPK (mitogen- activated protein kinase) và PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) dẫn tới kích thích sự tăng sinh và phân chia của tế bào. Điều này khiến tế bào phát triển và phân chia mất kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u. Ngoài ra, các con đường truyền tín hiệu này còn ức chế quá trình apoptosis đồng thời hình thành mạch máu mang chất dinh dưỡng tới nuôi khối u, duy trì sự sống sót của các khối u giúp chúng phát triển và xâm lấn các tế bào xung quanh, di căn đến những vị trí khác (Witton, 2003).
Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được vài năm sau khi mắc bệnh. Các kỹ thuật sinh học phân tử giữ vai trò quan trọng trong việc phát hiện, dự đoán và tiên lượng ung thư vú để tìm ra liệu pháp điều trị phù hợp. Hiện nay có một số -4- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phương pháp được áp dụng phổ biến để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở bệnh nhân ung thư vú ở mức độ protein (IHC), mức độ ARN (q-RT-PCR), mức độ ADN (FISH) (Moelans, 2011). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN Phương pháp sử dụng để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở mức ADN thường là kỹ thuật lai tại chỗ nhiễm sắc thể như FISH, CISH, SISH.
Trong đó, FISH là phương pháp thường quy đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER2/neu trên NST 17 của tế bào mô vú. Mảnh mô vú của bệnh nhân ung thư vú chứa ADN mã hóa thụ thể HER2 (ADN đích) được cố định trên bề mặt tiêu bản và làm biến tính. Mẫu dò ADN được đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và/hoặc một hapten không nhuộm huỳnh quang (nonfluorescent hapten), biến tính và lai trước với ADN lặp lại không đánh dấu. Sau đó, mẫu dò ADN được lai với ADN đích.
Sau khi rửa để loại bỏ chuỗi đơn ADN không gắn và những đoạn ADN gắn không đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ hapten không gắn huỳnh quang và bổ sung dung dịch chống phai màu DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindol.2 HCl l), quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1. -5- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào mô vú bằng phương pháp FISH.
Tín hiệu màu xanh là tín hiệu của HER2/neu, tín hiệu màu xanh lục là tín hiệu của tâm động của nhiễm sắc thể số 17. Nhiều tín hiệu màu đỏ: ung thư vú, hai tín hiệu màu đỏ: bình thường. Các mẫu A là mô vú bình thường, mẫu B là mô vú của bệnh nhân ung thư vú nhưng gen HER2 không được khuếch đại, mẫu C là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức thấp, mẫu D là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức cao. Ngoài các phương pháp đã mô tả ở trên, phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu thụ thể HER2 khảo sát sự biểu hiện HER2 ở tế bào ung thư vú dương tính đang được phát triển.
Phương pháp này được coi là phương pháp hiện đại, có nhiều triển vọng cho kết quả nhạy, chính xác và được ứng dụng kết hợp với điều trị ung thư vú để kiểm tra đáp ứng của thuốc (Moelans, 2011). Cách đọc kết quả: Tìm và đếm trên 20 tế bào u các tín hiệu màu đỏ (tín hiệu của HER2) và các tín hiệu màu xanh lục (tín hiệu tâm động của nhiễm sắc thể số 17). Lấy trung bình cộng của các tín hiệu màu đỏ chia cho trung bình cộng của các tín hiệu màu xanh. Nếu kết quả > 2.2 là dương tính HER2, kết quả < 1.8 là âm tính HER2, kết quả nằm trong khoảng 1.2 thì phải đếm lại trên 60 tế bào và tính toán tương tự như trên.
-6- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn và được coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự khuếch đại của gen HER với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mất nhiều thời gian, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và việc đọc kết quả khó khăn hơn do khó ghi nhận được những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác định vùng ung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH. Tiêu bản không thể quan sát lại nếu thời gian lưu giữ lâu vì tín hiệu huỳnh quang bị nhạt màu dần theo thời gian (Dhillon, 2007). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN Phương pháp định lượng real-time PCR (qRT-PCR) được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của HER2 bằng cách định lượng hàm lượng ARN trong khối u.
Để tăng độ nhạy của phương pháp, các nhà khoa học thường sử dụng PCR lồng. Phương pháp qRT-PCR hiếm khi được sử dụng để đánh giá trạng thái biểu hiện HER2 do việc phân lập mARN từ tế bào khối u vú tương đối khó và phân tử ARN không bền như ADN (Moelans, 2011). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein Phương pháp hóa mô miễn dịch IHC (Immunohistochemistry) thường được sử dụng để khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 ở mức độ protein từ sinh thiết của bệnh nhân ung thư vú. Phương pháp IHC bao gồm các bước theo thứ tự: cắt mẫu được cố định trên paraffin, chuyển mẫu lên lam kính, xử lý mẫu khử paraffin, nhuộm lam kính (để bộc lộ kháng nguyên HER2), đọc kết quả.
Kháng thể thứ nhất là c-erB-2, kháng thể thứ hai có gắn Biotin, Streptavidin, chất hiện màu 3,3’-diaminobenzidine chromogen (DAB). Kết quả được đọc bằng kính hiển vi quang học. Sự biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo bảng điểm của DAKO (Moelans, 2011; Dhillon, 2007). Điểm 0: Màng tế bào không bắt màu, điểm 1+: bắt màu yếu, rải rác trên màng tế -7- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bào, điểm 2+: bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào, điểm 3+: bắt màu mạnh trên màng tế bào > 10% tế bào (Hình 1.
Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC. Mức độ biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO. Điểm 0: mẫu âm tính; điểm 1+: mẫu âm tính, điểm 2+: HER2 biểu hiện yếu, là mẫu nghi ngờ; điểm 3+: mẫu dương tính, HER2 biểu hiện mạnh. Ưu điểm của phương pháp IHC là tiện lợi, rẻ tiền, tiêu bản xét nghiệm dễ bảo quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi quang học thông thường để quan sát.
Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kết quả không khách quan do ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể sử dụng (đơn dòng hay đa dòng), và điều quan trọng là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để đưa ra kết luận chính xác. Có một tỉ lệ khá lớn trường hợp kết quả biểu hiện là 2+ khi dùng phương pháp IHC nhưng không thấy có sự khuyếch đại gen tương ứng khi dùng phương pháp FISH (lai huỳnh quang tại chỗ). -8- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.