Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tạo biosensor xác định kháng nguyên HER2

Luận văn thạc sĩ phân tích hay nghiên cứu tạo biosensor xác định kháng nguyên her2, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Đào Minh Đức
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Quang Huấn
• Trường học: Viện Sinh Thái Và Tài Nguyên Sinh Vật
• Chuyên ngành: Sinh Học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2
• Loại tài liệu: luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2
• 1.1.1. Ung thư vú
• 1.1.2. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN
• 1.1.3. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN
• 1.1.4. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein
• 1.1.5. Giới thiệu chung về Biosensor
• 1.1.6. Lịch sử phát triển của Biosensor
• 1.1.7. Đặc điểm – Yêu cầu của Biosensor
• 1.1.8. Nguyên lý hoạt động chung của Biosensor
• 1.1.9. Ứng dụng của Biosensor
• 1.1.10. TỔNG QUAN VỀ APTAMER
• 1.1.10.1. Đặc trưng của Aptamer
• 1.1.10.2. Ưu điểm của Aptamer so với kháng thể
• 1.1.10.3. Phương pháp thu nhận Aptamer – Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Trang thiết bị
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX)
• 2.2.2. Chuẩn bị thư viện
• 2.2.3. Phương pháp tách dòng và giải trình tự
• 2.2.4. Nhân bản Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR
• 2.2.5. Phân tích điện di trên gel agarose
• 2.2.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR
• 2.2.7. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
• 2.2.8. Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α
• 2.2.9. Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.
• 2.2.10. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
• 2.2.11. Phương pháp gắn Aptamer lên hạt nano vàng
• 2.2.12. Phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực
• 2.2.13. Xử lý và làm sạch điện cực Au
• 2.2.14. Tạo lớp MPA trên bề mặt điện cực vàng
• 2.2.15. Gắn NHS lên bề mặt điện cực đã xử lý với MPA
• 2.2.16. Gắn NH2-Aptamer lên điện cực Au/MPA-NHS
• 2.2.17. Định lượng HER2 trong mẫu bằng điện cực Au/MPA-NHS
• 2.2.18. Tái sử dụng điện cực Au/MPA-NHS
• 2.2.19. Đánh giá hoạt động của Aptasensor
• 2.2.20. Phương pháp lai Dot blot
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU HER2
• 3.1.1. Kết quả thu nhận và xác định trình tự Aptamer
• 3.1.2. Kết quả xác định cấu trúc không gian của Aptamer
• 3.1.3. Xác định kết quả tạo phức hệ Aptamer-hạt nano vàng
• 3.1.4. Xác định gắn kết của Aptamer trên tế bào BT474 và tế bào MCF7
• 3.1.5. Xác định sự gắn kết của Aptamer với HER2 bằng kỹ thuật Dot blot
• 3.2. CHẾ TẠO BIOSENSOR ĐIỆN HÓA
• 3.2.1. Làm sạch và hoạt hóa điện cực
• 3.2.2. Tạo đơn lớp mỏng trên bề mặt điện cực vàng
• 3.2.3. Gắn Aptamer lên điện cực đã tạo lớp màng mỏng trên bề mặt
• 3.2.4. Phong tỏa các vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt điện cực
• 3.2.5. Định lượng kháng nguyên HER2 trong các mẫu phân tích
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biosensor xác định kháng nguyên HER2

Nghiên cứu về biosensor xác định kháng nguyên HER2 trong ung thư vú đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Kháng nguyên HER2 là một chỉ thị sinh học quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Việc phát triển các phương pháp mới để xác định chính xác hàm lượng HER2 trong cơ thể có thể cải thiện đáng kể khả năng chẩn đoán và theo dõi điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Khái niệm về kháng nguyên HER2 và vai trò trong ung thư vú

Kháng nguyên HER2 là một protein quan trọng trong sự phát triển của tế bào ung thư vú. Sự biểu hiện quá mức của HER2 có thể dẫn đến sự phát triển và di căn của khối u. Việc xác định chính xác mức độ HER2 giúp bác sĩ đưa ra phương pháp điều trị phù hợp.

1.2. Tầm quan trọng của biosensor trong chẩn đoán ung thư

Biosensor là công nghệ tiên tiến cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các kháng nguyên trong mẫu sinh học. Việc sử dụng biosensor trong chẩn đoán ung thư vú giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp xét nghiệm hiện tại.

II. Thách thức trong việc xác định kháng nguyên HER2

Mặc dù có nhiều phương pháp để xác định kháng nguyên HER2, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của các phương pháp này. Các phương pháp truyền thống như IHC và FISH có những hạn chế nhất định, bao gồm thời gian thực hiện lâu và chi phí cao.

2.1. Hạn chế của các phương pháp truyền thống

Các phương pháp như IHC và FISH thường yêu cầu thời gian dài và kỹ thuật phức tạp. Điều này có thể dẫn đến sai sót trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị cho bệnh nhân.

2.2. Nhu cầu về phương pháp mới

Cần thiết phải phát triển các phương pháp mới, như biosensor, để cải thiện độ chính xác và giảm thời gian xét nghiệm. Điều này sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán và điều trị ung thư vú.

III. Phương pháp nghiên cứu biosensor xác định kháng nguyên HER2

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp biosensor điện hóa để xác định kháng nguyên HER2. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác hàm lượng HER2 trong mẫu sinh học, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư vú.

3.1. Nguyên lý hoạt động của biosensor điện hóa

Biosensor điện hóa hoạt động dựa trên nguyên lý đo dòng điện khi có sự tương tác giữa kháng nguyên HER2 và aptamer. Sự thay đổi dòng điện sẽ tương ứng với nồng độ HER2 trong mẫu.

3.2. Quy trình chế tạo biosensor

Quy trình chế tạo biosensor bao gồm các bước như làm sạch điện cực, gắn aptamer lên bề mặt điện cực và định lượng HER2 trong mẫu. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy biosensor có khả năng xác định kháng nguyên HER2 với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc ứng dụng biosensor trong thực tiễn có thể giúp cải thiện quy trình chẩn đoán và theo dõi điều trị cho bệnh nhân ung thư vú.

4.1. Đánh giá hiệu quả của biosensor

Kết quả thử nghiệm cho thấy biosensor có thể phát hiện nồng độ HER2 trong mẫu với độ chính xác cao. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của biosensor trong chẩn đoán ung thư vú.

4.2. Ứng dụng trong lâm sàng

Biosensor có thể được sử dụng trong lâm sàng để theo dõi sự thay đổi nồng độ HER2 trong quá trình điều trị, từ đó giúp bác sĩ điều chỉnh phương pháp điều trị phù hợp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về biosensor xác định kháng nguyên HER2 mở ra nhiều triển vọng trong việc chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Công nghệ này không chỉ giúp cải thiện độ chính xác mà còn giảm thời gian xét nghiệm, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.1. Tương lai của biosensor trong y học

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ, biosensor có thể được cải tiến để phát hiện nhiều loại kháng nguyên khác nhau, mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực y học khác nhau.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các loại biosensor mới với khả năng phát hiện nhanh chóng và chính xác hơn, từ đó đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong chẩn đoán và điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư vú hiện là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu ở nữ giới, chiếm gần 30% tổng số ca ung thư mới ghi nhận mỗi năm trên toàn cầu. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có xấp xỉ 1,1 triệu ca mắc mới và khoảng 410.000 trường hợp tử vong do căn bệnh này. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư vú có xu hướng gia tăng nhanh chóng trong 15 năm qua, vượt qua ung thư cổ tử cung với tỷ lệ ghi nhận tại Hà Nội đạt khoảng 30/100.000 phụ nữ và tại Thành phố Hồ Chí Minh là 20/100.000 phụ nữ.

Vấn đề then chốt trong tiên lượng và điều trị ung thư vú nằm ở thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì 2 (HER2). Ở các tế bào bình thường, gen HER2 chỉ có 2 bản sao, nhưng ở các khối u dương tính, gen này bị khuếch đại khiến mức độ biểu hiện protein HER2 trên bề mặt tế bào tăng vọt từ 50 đến 100 lần. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) hay hóa mô miễn dịch (IHC) bộc lộ nhiều điểm hạn chế về chi phí cao, quy trình phức tạp và độ nhạy biến thiên. Do đó, việc nghiên cứu phát triển một hệ thống cảm biến sinh học (biosensor) điện hóa có khả năng phát hiện nhanh, chính xác kháng nguyên HER2 là một yêu cầu cấp thiết.

Đề tài luận văn thạc sĩ tập trung vào mục tiêu sàng lọc các đoạn oligonucleotide đặc hiệu (Aptamer) kháng nguyên HER2 và ứng dụng chúng để chế tạo biosensor điện hóa trên nền điện cực vàng. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Động vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu mang lại ý nghĩa to lớn khi thiết lập được cảm biến có dải đo từ 5 ng/mL đến 500 ng/mL, rút ngắn thời gian phân tích mẫu xuống dưới 30 phút và giảm thiểu hơn 60% chi phí thử nghiệm so với các xét nghiệm miễn dịch enzym thông thường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết sinh học phân tử và điện hóa học hiện đại:

Thứ nhất, thuyết dẫn truyền tín hiệu qua thụ thể Tyrosine Kinase màng tế bào. Họ thụ thể HER bao gồm bốn thành viên từ HER1 đến HER4, trong đó HER2 luôn tồn tại ở cấu hình mở và dễ dàng tạo phức dimer với chính nó hoặc các thụ thể khác. Quá trình siêu biểu hiện HER2 kích hoạt mạnh mẽ hai con đường truyền tín hiệu nội bào MAPK và PI3K, thúc đẩy sự phân chia tế bào mất kiểm soát, ức chế quá trình chết theo chương trình (apoptosis) và kích thích hình thành mạch máu nuôi khối u.

Thứ hai, nguyên lý chọn lọc tiến hóa phối tử nhân tạo SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Aptamer là các chuỗi ADN hoặc ARN sợi đơn có khả năng tự cuộn gập thành các cấu trúc không gian ba chiều đặc thù (như kẹp tóc, vòng lặp) để liên kết ái lực cao với phân tử đích thông qua tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và tương tác Van der Waals. So với kháng thể truyền thống, Aptamer vượt trội nhờ độ bền nhiệt cao, chi phí sản xuất thấp và khả năng tổng hợp hóa học thuần khiết.

Thứ ba, mô hình truyền điện tích bề mặt điện cực trong cảm biến sinh học điện hóa. Hiện tượng gắn kết sinh học giữa Aptamer cố định trên bề mặt điện cực và kháng nguyên HER2 sẽ tạo nên lớp cản trở không gian, làm thay đổi trở kháng bề mặt và làm suy giảm tốc độ truyền điện tử của cặp chất chỉ thị oxy hóa khử Kali Ferricyanide và Ferrocyanide.

Bốn khái niệm nền tảng xuyên suốt nghiên cứu gồm: Kháng nguyên HER2, Phân tử nhận biết Aptamer, Lớp màng tự lắp ghép đơn phân tử (SAM) và Cảm biến sinh học điện hóa (Aptasensor).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu ban đầu xuất phát từ thư viện ADN sợi đơn nhân tạo chứa khoảng 10 mũ 15 phân tử ngẫu nhiên. Mỗi phân tử dài khoảng 100 nucleotide, bao gồm vùng ngẫu nhiên trung tâm 40 nucleotide (N40) được bao bọc bởi hai vùng mồi cố định có nhiệt độ nóng chảy Tm lần lượt là 65,3 độ C và 67,4 độ C. Thí nghiệm sử dụng mẫu phức hợp protein HER2 cố định trên hạt niken, kết hợp đối chứng trên hai dòng tế bào ung thư vú BT474 (dương tính HER2 mạnh) và MCF7 (âm tính HER2).

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 12 chu kỳ sàng lọc dương tính liên tiếp cùng 1 chu kỳ sàng lọc loại trừ để loại bỏ các phân tử gắn không đặc hiệu. Quá trình đo đạc điện hóa được thực hiện lặp lại 5 lần trên mỗi bước biến đổi điện cực nhằm bảo đảm độ lặp lại và độ tin cậy thống kê cao.

Quy trình phân tích và chế tạo gồm các bước cụ thể:

• Sàng lọc và khuếch đại: Thư viện ssDNA sau khi ủ với protein HER2 được giải hấp bằng dung dịch DMSO, khuếch đại bằng phản ứng PCR 20 chu kỳ nhiệt và xử lý bằng enzym Lambda Exonuclease trong 4 giờ ở 37 độ C để loại bỏ mạch mang gốc phosphoryl, thu hồi sợi đơn tinh khiết.
• Tách dòng và giải trình tự: Sản phẩm sau vòng 12 được gắn vào vector pCR2.1-TOPO, biến nạp vào vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5alpha, nuôi cấy trên đĩa thạch bổ sung 50 microgam/mL Kanamycin trong 20 giờ và giải trình tự theo phương pháp Sanger.
• Chế tạo điện cực biến tính: Điện cực vàng (Au) được làm sạch bằng dung dịch Piranha (tỷ lệ H2O2/H2SO4 đậm đặc là 1:3) trong 30 phút và hoạt hóa bằng 30 chu kỳ quét thế trong 1M HClO4 với tốc độ 100 mV/giây. Tiếp theo, tạo lớp màng tự lắp ráp bằng axit 3-mercaptopropionic (MPA) 20 mM trong 3 giờ, hoạt hóa nhóm carboxyl bằng hỗn hợp 20 mM EDC và 20 mM NHS trong dung dịch đệm MES 100 mM trong 15 phút, sau đó gắn cộng hóa trị với 2 nM NH2-Aptamer trong 1 giờ. Bề mặt sau đó được phong tỏa các vị trí gắn không đặc hiệu bằng dung dịch Albumin huyết thanh bò (BSA) 1X.
• Phép đo điện thế: Sử dụng kỹ thuật quét thế vòng (Cyclic Voltammetry - CV) và sóng vuông (Square Wave Voltammetry - SWV) trong khoảng điện thế từ -0,3 V đến 0,9 V với tốc độ quét 0,1 V/s. Việc lựa chọn phương pháp phân tích điện hóa dựa trên ưu điểm phản ứng tức thì, độ nhạy cao và khả năng bảo toàn hoạt tính sinh học của cảm biến.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học và công nghệ mang tính đột phá:

Thứ nhất, quá trình làm giàu thư viện qua 12 vòng SELEX diễn ra thành công vượt trội. Nồng độ ssDNA đo được trên máy NanoDrop sau các chu kỳ giải hấp tăng trưởng rõ rệt từ mức 2,63 ng/microL ở các vòng đầu lên tới 33,25 ng/microL ở các vòng sau. Kết quả điện di trên gel agarose 0,8% xác nhận sản phẩm PCR thu được dải băng đồng nhất có kích thước chuẩn xác 100 bp.

Thứ hai, xác định được hai trình tự Aptamer đặc hiệu cao là Aptamer-1 và Aptamer-2 có cấu trúc không gian dạng kẹp tóc ổn định với mức năng lượng tự do thấp. Khi gắn Aptamer lên hạt nano vàng tạo phức hệ Apt-Au, phổ hấp thụ UV-Vis dịch chuyển đỉnh hấp thụ quang học đặc trưng từ 520 nm lên 535 nm. Thử nghiệm trên tế bào BT474 cho thấy sự gắn kết chọn lọc mạnh mẽ, trong khi không xuất hiện tín hiệu bắt cặp trên dòng tế bào đối chứng âm tính MCF7. Kỹ thuật Dot blot trên màng nitrocellulose cho thấy phức hệ Apt-Au tạo chấm màu đỏ đậm rõ nét với kháng nguyên HER2 chỉ sau 10 phút quan sát.

Thứ ba, chế tạo thành công lớp biến tính phân tử trên điện cực vàng với độ chọn lọc cao. Tín hiệu dòng đỉnh oxy hóa khử (Ip) của cặp chất Fe(CN)6 3-/4- ghi nhận mức suy giảm có quy luật qua từng công đoạn: từ điện cực Au sạch ban đầu, giảm mạnh khi tạo lớp Au-MPA, tiếp tục giảm khi liên kết với NH2-Aptamer và đạt trạng thái ổn định khi được phủ kín bằng BSA 1X.

Thứ tư, thiết lập dải tuyến tính định lượng HER2 rộng từ 5 ng/mL đến 500 ng/mL. Cường độ dòng đỉnh trên phổ sóng vuông SWV giảm dần tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng nguyên HER2 được ủ trên bề mặt cảm biến trong 30 phút. Điện cực thể hiện khả năng tái sử dụng xuất sắc khi chỉ cần xử lý trong dung dịch đệm PBS có pH từ 4,5 đến 5,0 trong 10 phút, khôi phục lại hơn 95% độ nhạy ban đầu và hoạt động ổn định qua 5 chu kỳ đo liên tiếp.

Thảo luận kết quả

Cơ chế suy giảm tín hiệu dòng điện có thể giải thích do kháng nguyên HER2 là một đại phân tử protein có kích thước cồng kềnh và mang điện tích. Khi HER2 liên kết đặc hiệu với Aptamer đã được cố định trên lớp MPA-NHS, nó tạo ra một hàng rào cản trở không gian dày đặc, ngăn chặn các ion chỉ thị điện hóa tiếp cận và trao đổi điện tử với bề mặt dẫn của điện cực vàng.

Khi so sánh với dữ liệu dịch tễ học lâm sàng, một nghiên cứu tiêu biểu của Tan và cộng sự năm 2011 trên 126 bệnh nhân ung thư vú nguyên phát chỉ ra rằng nồng độ HER2 trong huyết thanh dao động từ 0,7 ng/mL đến 133,1 ng/mL, với giá trị trung bình là 20,5 ng/mL. Trong đó, mức độ âm tính có nồng độ dưới 19 ng/mL, dương tính yếu từ 19 đến 32 ng/mL, dương tính trung bình từ 32 đến 66 ng/mL và dương tính mạnh vượt trên 66 ng/mL. Dải phát hiện từ 5 ng/mL đến 500 ng/mL của cảm biến chế tạo trong luận văn hoàn toàn bao trùm toàn bộ dải phân loại bệnh lý này, giúp phát hiện chính xác mọi giai đoạn tiến triển của bệnh nhân.

Trong thực tế công bố học thuật, toàn bộ diễn biến động học của phản ứng được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị vôn-ampe quét sóng vuông SWV thể hiện các đường cong hạ thấp dòng đỉnh tương ứng với từng nồng độ HER2 tăng dần, cùng với biểu đồ chuẩn tuyến tính giữa độ suy giảm cường độ dòng điện (delta I) và logarit của nồng độ kháng nguyên. So với phương pháp ELISA mất từ 4 đến 6 giờ, cảm biến sinh học điện hóa này rút ngắn thời gian thao tác xuống chỉ còn 30 phút mà vẫn duy trì độ chính xác tương đương.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu từ quy mô phòng thí nghiệm sang ứng dụng thực tiễn y tế, bốn khuyến nghị chiến lược được đề xuất như sau:

Thứ nhất, hoàn thiện quy trình vi chế tạo điện cực in màng mỏng (Screen-Printed Electrodes - SPE). Các viện nghiên cứu chuyên ngành cùng các trung tâm công nghệ cao cần phối hợp tối ưu hóa dây chuyền sản xuất chip cảm biến màng mỏng tích hợp trong vòng 12 tháng tới, nhằm hạ giá thành chế tạo xuống dưới 50.000 VNĐ cho mỗi cảm biến và giảm thể tích mẫu bệnh phẩm cần thiết xuống dưới 10 microL.

Thứ hai, phát triển thiết bị đo cầm tay đa kênh phục vụ chẩn đoán tại chỗ (Point-of-Care Testing - POCT). Các kỹ sư y sinh và chuyên gia phát triển phần cứng cần thiết kế mạch vi điều khiển tích hợp truyền dữ liệu không dây qua Bluetooth trong thời gian 18 tháng, hướng tới mục tiêu phát hiện nồng độ HER2 dưới 1 ng/mL với thời gian tự động xuất kết quả trong vòng 15 phút.

Thứ ba, triển khai thử nghiệm mù đôi trên mẫu bệnh phẩm huyết thanh người thực tế. Đề nghị các bệnh viện ung bướu trung ương chủ trì thu thập và phân tích tối thiểu 300 mẫu huyết thanh bệnh nhân ung thư vú trong giai đoạn 24 tháng, đối chiếu song song với kết quả hóa mô miễn dịch IHC và lai huỳnh quang FISH để kiểm định độ đặc hiệu đạt trên 95%.

Thứ tư, nghiên cứu cải biến hóa học nhằm nâng cao độ bền bảo quản của Aptamer. Các nhà khoa học công nghệ sinh học cần tiếp tục thử nghiệm gắn các gốc bảo vệ kháng nuclease và áp dụng kỹ thuật đông khô bề mặt cảm biến trong 6 tháng, giúp nâng cao thời hạn lưu trữ của điện cực lên trên 6 tháng ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 20 đến 25 độ C.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn này mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn sâu sắc cho bốn nhóm đối tượng chính:

Một là, các học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Hóa phân tích. Tài liệu cung cấp cẩm nang chi tiết về quy trình SELEX 12 chu kỳ, kỹ thuật tách dòng plasmid pCR2.1 và phương pháp biến tính bề mặt kim loại bằng lớp tự lắp ghép đơn phân tử MPA.

Hai là, các kỹ sư y sinh và chuyên gia R&D tại các doanh nghiệp sản xuất thiết bị y tế (MedTech). Đây là nguồn tư liệu tham khảo hữu ích để thiết kế các hệ thống cảm biến sinh học thế hệ mới, hỗ trợ tối ưu hóa các module cảm biến điện hóa trên vi mạch.

Ba là, các bác sĩ chuyên khoa ung bướu và kỹ thuật viên xét nghiệm lâm sàng. Luận văn giúp người đọc nắm bắt cơ chế định lượng protein HER2 ở mức độ phân tử không xâm lấn, tạo cơ sở để theo dõi đáp ứng điều trị bằng các liệu pháp kháng thể trúng đích như Trastuzumab.

Bốn là, các nhà quản lý y tế và đơn vị đầu tư phát triển công nghệ chẩn đoán. Nội dung tài liệu cung cấp bức tranh toàn cảnh về tính khả thi kinh tế, tiềm năng tự chủ công nghệ sản xuất kit chẩn đoán ung thư chi phí thấp phục vụ cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Kháng nguyên HER2 có vai trò quyết định như thế nào trong tiên lượng ung thư vú? Thụ thể HER2 khi siêu biểu hiện gấp 50 đến 100 lần trên màng tế bào sẽ kích hoạt mạnh mẽ các chuỗi tín hiệu nội bào MAPK và PI3K. Điều này kích thích khối u tăng sinh mạch máu, xâm lấn mô xung quanh và di căn nhanh. Bệnh nhân có HER2 dương tính thường có tiên lượng xấu nếu không được phát hiện sớm và can thiệp bằng phác đồ điều trị trúng đích.

Aptamer có những ưu điểm gì vượt trội so với kháng thể truyền thống trong chế tạo Biosensor? Aptamer được tổng hợp hoàn toàn bằng con đường hóa học in vitro nên có độ tinh khiết cao, giá thành sản xuất thấp hơn nhiều so với nuôi cấy kháng thể trên động vật. Ngoài ra, Aptamer có kích thước phân tử nhỏ, bền nhiệt, hạn sử dụng lâu dài và có thể biến tính - hồi tính thuận nghịch mà không bị mất hoạt tính liên kết.

Quy trình SELEX gồm những bước cơ bản nào để thu nhận Aptamer đặc hiệu? Quy trình SELEX bắt đầu từ thư viện 10 mũ 15 phân tử ssDNA ngẫu nhiên, trải qua 12 chu kỳ liên kết với protein HER2 cố định trên hạt niken. Sau mỗi vòng, các đoạn gắn kết được giải hấp bằng DMSO, nhân bản bằng PCR và cắt thành sợi đơn bằng enzym Lambda Exonuclease. Vòng sàng lọc loại trừ được thực hiện để loại bỏ các phân tử gắn không đặc hiệu trước khi giải trình tự Sanger.

Nguyên lý đo nồng độ HER2 của cảm biến sinh học điện hóa dựa trên cơ chế nào? Cảm biến sử dụng điện cực vàng đã gắn Aptamer đặc hiệu. Trong dung dịch đệm chứa chất chỉ thị oxy hóa khử Fe(CN)6 3-/4-, khi có mặt kháng nguyên HER2 với nồng độ từ 5 đến 500 ng/mL, phức hợp Aptamer-HER2 hình thành sẽ tạo lớp cản trở không gian, làm suy giảm cường độ dòng điện đỉnh đo được trên phổ sóng vuông SWV tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên.

Điện cực Biosensor sau khi phân tích có thể tái sinh để sử dụng lại được không? Hoàn toàn có thể tái sinh điện cực một cách dễ dàng. Sau mỗi lần đo, điện cực chỉ cần được ngâm trong dung dịch đệm PBS có độ pH từ 4,5 đến 5,0 trong thời gian 10 phút. Môi trường axit nhẹ sẽ phá vỡ liên kết giữa Aptamer và HER2, giải phóng bề mặt cảm biến và khôi phục trên 95% độ nhạy ban đầu qua 5 lần đo liên tiếp.

Kết luận

Luận văn đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với năm kết quả then chốt:

• Sàng lọc thành công các trình tự ADN Aptamer có ái lực và độ đặc hiệu cao với kháng nguyên ung thư vú HER2 từ thư viện 10 mũ 15 phân tử qua 12 chu kỳ SELEX nghiêm ngặt.
• Xác định cấu hình không gian hairpin-loop bền vững của Aptamer và kiểm chứng thành công tính gắn kết chọn lọc trên tế bào ung thư BT474 và kỹ thuật Dot blot hạt nano vàng.
• Xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo màng biến tính trên điện cực vàng Au thông qua liên kết cộng hóa trị MPA-NHS và phong tỏa bằng BSA 1X.
• Thiết lập cảm biến sinh học điện hóa định lượng chính xác kháng nguyên HER2 trong dải nồng độ tuyến tính rộng từ 5 ng/mL đến 500 ng/mL, thời gian phản hồi dưới 30 phút.
• Khẳng định khả năng tái sinh điện cực vượt trội trong dung dịch đệm PBS pH 4,5 đến 5,0 với hiệu suất thu hồi tín hiệu đạt trên 95% sau 5 chu kỳ phân tích.

Công trình đóng góp một giải pháp công nghệ mang tính đột phá cho nền y học chẩn đoán phân tử tại Việt Nam, mở ra hướng phát triển các bộ kit xét nghiệm ung thư vú tại chỗ với chi phí tối ưu. Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, việc tích hợp cảm biến vào các vi mạch điện cực in màng mỏng sẽ là bước đi quyết định để thương mại hóa sản phẩm. Kính mời các nhà khoa học, chuyên gia y tế và bạn đọc quan tâm nghiên cứu toàn văn luận văn để cùng hợp tác phát triển các ứng dụng cảm biến sinh học tiên tiến.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 1. Ung thư vú Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1,1 triệu ca và 410.000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới, trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú.

Ở Mỹ, trong những năm gần đây, ước tính có khoảng 230.480 trường hợp mắc ung thư vú xâm lấn và 57.650 trường hợp mắc ung thư vú tại chỗ. Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm, đứng đầu là Anh. Năm 2009, ở Anh mỗi ngày có 125 ca ung thư vú mới, 35 người tử vong do ung thư vú và 12 bệnh nhân được cứu sống do phát hiện sớm. Ở châu Á và một số nước đang phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng đang có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.

Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100,000 phụ nữ ở Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là 20/100,000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010). Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì (Human epithelial growth factor receptor - HER2).

HER2 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984 bởi Schechter AL và các cộng sự. HER2 là protein xuyên màng thuộc họ thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì gồm -3- LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] HER1, HER2, HER3 và HER4. Các thụ thể này đều có cấu trúc gồm ba vùng: vùng ngoại bào là vị trí gắn với phối tử, vùng xuyên màng và vùng nội bào có hoạt tính enzyme tyrosine kinase tham gia tương tác với các protein truyền tín hiệu nội bào. Trong đó, thụ thể HER2 không có vị trí gắn với phối tử, vùng nội bào của HER3 không có hoạt tính tyrosine kinase.

Các thụ thể HER chỉ có hoạt tính khi gắn với phối tử, chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào và điều hòa sự phát triển, biệt hóa và tăng sinh của tế bào. HER2 luôn tồn tại ở dạng cấu hình mở nên nó có khả năng tạo dimer với các thụ thể HER khác hoặc với chính nó để tạo phân tử dị dimer hoặc đồng dimer. Khi đó các phân tử dimer liên kết được với phối tử nên thụ thể HER2 có hoạt tính. Tế bào vú bình thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến HER2 biểu hiện trên bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987).

Siêu biểu hiện HER2 làm tăng số lượng phức hợp thụ thể đồng dimer hoặc dị dimer chứa HER2. Những phức hợp thụ thể này phosphoryl hóa protein nội bào gắn với nó làm hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào như MAPK (mitogen- activated protein kinase) và PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) dẫn tới kích thích sự tăng sinh và phân chia của tế bào. Điều này khiến tế bào phát triển và phân chia mất kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u. Ngoài ra, các con đường truyền tín hiệu này còn ức chế quá trình apoptosis đồng thời hình thành mạch máu mang chất dinh dưỡng tới nuôi khối u, duy trì sự sống sót của các khối u giúp chúng phát triển và xâm lấn các tế bào xung quanh, di căn đến những vị trí khác (Witton, 2003).

Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được vài năm sau khi mắc bệnh. Các kỹ thuật sinh học phân tử giữ vai trò quan trọng trong việc phát hiện, dự đoán và tiên lượng ung thư vú để tìm ra liệu pháp điều trị phù hợp. Hiện nay có một số -4- LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] phương pháp được áp dụng phổ biến để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở bệnh nhân ung thư vú ở mức độ protein (IHC), mức độ ARN (q-RT-PCR), mức độ ADN (FISH) (Moelans, 2011). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN Phương pháp sử dụng để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở mức ADN thường là kỹ thuật lai tại chỗ nhiễm sắc thể như FISH, CISH, SISH.

Trong đó, FISH là phương pháp thường quy đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER2/neu trên NST 17 của tế bào mô vú. Mảnh mô vú của bệnh nhân ung thư vú chứa ADN mã hóa thụ thể HER2 (ADN đích) được cố định trên bề mặt tiêu bản và làm biến tính. Mẫu dò ADN được đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và/hoặc một hapten không nhuộm huỳnh quang (nonfluorescent hapten), biến tính và lai trước với ADN lặp lại không đánh dấu. Sau đó, mẫu dò ADN được lai với ADN đích.

Sau khi rửa để loại bỏ chuỗi đơn ADN không gắn và những đoạn ADN gắn không đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ hapten không gắn huỳnh quang và bổ sung dung dịch chống phai màu DAPI (4,6- diamidino-2-phenylindol.2 HCl l), quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1. -5- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào mô vú bằng phương pháp FISH.

Tín hiệu màu xanh là tín hiệu của HER2/neu, tín hiệu màu xanh lục là tín hiệu của tâm động của nhiễm sắc thể số 17. Nhiều tín hiệu màu đỏ: ung thư vú, hai tín hiệu màu đỏ: bình thường. Các mẫu A là mô vú bình thường, mẫu B là mô vú của bệnh nhân ung thư vú nhưng gen HER2 không được khuếch đại, mẫu C là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức thấp, mẫu D là mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức cao. Ngoài các phương pháp đã mô tả ở trên, phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu thụ thể HER2 khảo sát sự biểu hiện HER2 ở tế bào ung thư vú dương tính đang được phát triển.

Phương pháp này được coi là phương pháp hiện đại, có nhiều triển vọng cho kết quả nhạy, chính xác và được ứng dụng kết hợp với điều trị ung thư vú để kiểm tra đáp ứng của thuốc (Moelans, 2011). Cách đọc kết quả: Tìm và đếm trên 20 tế bào u các tín hiệu màu đỏ (tín hiệu của HER2) và các tín hiệu màu xanh lục (tín hiệu tâm động của nhiễm sắc thể số 17). Lấy trung bình cộng của các tín hiệu màu đỏ chia cho trung bình cộng của các tín hiệu màu xanh. Nếu kết quả > 2.2 là dương tính HER2, kết quả < 1.8 là âm tính HER2, kết quả nằm trong khoảng 1.2 thì phải đếm lại trên 60 tế bào và tính toán tương tự như trên.

-6- LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn và được coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự khuếch đại của gen HER với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mất nhiều thời gian, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và việc đọc kết quả khó khăn hơn do khó ghi nhận được những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác định vùng ung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH. Tiêu bản không thể quan sát lại nếu thời gian lưu giữ lâu vì tín hiệu huỳnh quang bị nhạt màu dần theo thời gian (Dhillon, 2007). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN Phương pháp định lượng real-time PCR (qRT-PCR) được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của HER2 bằng cách định lượng hàm lượng ARN trong khối u.

Để tăng độ nhạy của phương pháp, các nhà khoa học thường sử dụng PCR lồng. Phương pháp qRT-PCR hiếm khi được sử dụng để đánh giá trạng thái biểu hiện HER2 do việc phân lập mARN từ tế bào khối u vú tương đối khó và phân tử ARN không bền như ADN (Moelans, 2011). Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein Phương pháp hóa mô miễn dịch IHC (Immunohistochemistry) thường được sử dụng để khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 ở mức độ protein từ sinh thiết của bệnh nhân ung thư vú. Phương pháp IHC bao gồm các bước theo thứ tự: cắt mẫu được cố định trên paraffin, chuyển mẫu lên lam kính, xử lý mẫu khử paraffin, nhuộm lam kính (để bộc lộ kháng nguyên HER2), đọc kết quả.

Kháng thể thứ nhất là c-erB-2, kháng thể thứ hai có gắn Biotin, Streptavidin, chất hiện màu 3,3’-diaminobenzidine chromogen (DAB). Kết quả được đọc bằng kính hiển vi quang học. Sự biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo bảng điểm của DAKO (Moelans, 2011; Dhillon, 2007). Điểm 0: Màng tế bào không bắt màu, điểm 1+: bắt màu yếu, rải rác trên màng tế -7- LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] bào, điểm 2+: bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào, điểm 3+: bắt màu mạnh trên màng tế bào > 10% tế bào (Hình 1.

Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC. Mức độ biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO. Điểm 0: mẫu âm tính; điểm 1+: mẫu âm tính, điểm 2+: HER2 biểu hiện yếu, là mẫu nghi ngờ; điểm 3+: mẫu dương tính, HER2 biểu hiện mạnh. Ưu điểm của phương pháp IHC là tiện lợi, rẻ tiền, tiêu bản xét nghiệm dễ bảo quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi quang học thông thường để quan sát.

Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kết quả không khách quan do ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại kháng thể sử dụng (đơn dòng hay đa dòng), và điều quan trọng là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để đưa ra kết luận chính xác. Có một tỉ lệ khá lớn trường hợp kết quả biểu hiện là 2+ khi dùng phương pháp IHC nhưng không thấy có sự khuyếch đại gen tương ứng khi dùng phương pháp FISH (lai huỳnh quang tại chỗ). -8- LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.