Luận án nghiên cứu biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV

Nghiên cứu tổng hợp biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV, mở ra hướng đi mới trong điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thịnh
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Cửu Khoa
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
• 1.3. Đóng góp mới của luận án
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
• 1.5. Virus HIV/AIDS và thuốc điều trị
• 1.5.1. Virus HIV/AIDS
• 1.5.2. Lịch sử phát triển liệu pháp điều trị HIV/AIDS
• 1.5.3. Cơ chế tác động của thuốc điều trị HIV
• 1.5.4. Tenofovir disoproxil fumarat
• 1.5.5. Liệu pháp điều trị ARV kết hợp
• 1.5.6. Những tồn tại của liệu pháp kháng HIV thông thường
• 1.5.7. Giải pháp thuốc phóng thích kéo dài
• 1.5.8. Ưu điểm của phóng thích kéo dài
• 1.5.9. Nhược điểm của phóng thích kéo dài
• 1.5.10. Các chiến lược điều trị HIV hướng đến hiện nay
• 1.5.10.1. Thuốc hướng đích
• 1.5.10.2. Thuốc có tác dụng kéo dài
• 1.5.10.3. Vacccin điều trị
• 1.6. Dendrimer PAMAM biến tính và tiềm năng mang thuốc
• 1.6.1. Các tác nhân biến tính
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc ARV sử dụng chất mang nano
• 1.7. Phương pháp nghiên cứu
• 1.7.1. Nguyên liệu - hóa chất, dụng cụ - thiết bị
• 1.7.1.1. Nguyên liệu - hóa chất
• 1.7.1.2. Dụng cụ - thiết bị
• 1.7.2. Tổng hợp dendrimer PAMAM
• 1.7.2.1. Tổng hợp dendrimer PAMAM từ G-0
• 1.7.2.2. Tổng hợp dendrimer PAMAM G-0
• 1.7.2.3. Tổng hợp dendrimer PAMAM G0
• 1.7.3. Biến tính PAMAM dendrimer
• 1.7.3.1. Chuẩn bị tác nhân biến tính
• 1.7.3.2. Tổng hợp PAMAM dendrimer biến tính
• 1.7.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định các ARV
• 1.7.4.1. Xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF VÀ RTV
• 1.7.4.2. Xác định AZT, 3TC và xác định đồng thời AZT, 3TC
• 1.7.4.3. Xác định TDF, RTV và xác định đồng thời TDF và RTV
• 1.7.4.4. Thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF và RTV
• 1.7.4.5. Tính tương thích hệ thống HPLC
• 1.7.4.6. Tính đặc hiệu, LOD và LOQ
• 1.7.4.7. Tính tuyến tính
• 1.7.5. Tạo hệ dẫn truyền thuốc nano
• 1.7.5.1. Chuẩn bị dung dịch hoạt chất
• 1.7.5.2. Chuẩn bị dung dịch hệ G3
• 1.7.5.3. Dẫn truyền hoạt chất
• 1.7.5.4. Loại hoạt chất tự do
• 1.7.6. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và thử hoạt tính sinh học
• 1.7.6.1. Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất
• 1.7.6.2. Thử hoạt tính sinh học
• 1.7.6.3. Thử độc tính tế bào
• 1.7.6.4. Thử hoạt tính ức chế pepsin
• 2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
• 2.1. TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM THẾ HỆ G-0
• 2.1.1. Phổ hồng ngoại FTIR
• 2.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
• 2.1.3. Phổ khối lượng MS và sắc ký lọc gel GPC
• 2.1.4. Tính toán khối lượng phân tử dendrimer PAMAM bằng phổ 1H-NMR
• 2.1.5. Hiệu suất phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAM
• 2.2. BIẾN TÍNH PAMAM DENDRIMER G3.0 VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127
• 2.2.1. Hình thái, kích thước
• 2.2.2. Phổ hồng ngoại FTIR
• 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
• 2.3. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
• 2.3.1. Tính tương thích của hệ thống sắc ký
• 2.3.2. Tính đặc hiệu
• 2.3.3. Tính tuyến tính
• 2.3.4. Độ chính xác trung gian
• 2.4. KẾT QUẢ DẪN TRUYỀN HÓA HOẠT CHẤT
• 2.4.1. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất tạo hệ dẫn truyền thuốc đơn
• 2.4.2. Hình thái, kích thước
• 2.4.3. Phổ hồng ngoại FTIR
• 2.4.4. Kết quả dẫn truyền hoạt chất đơn
• 2.4.5. Kết quả dẫn truyền hóa hoạt chất kết hợp
• 2.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG HOẠT CHẤT
• 2.5.1. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc đơn
• 2.5.2. Kết quả giải phóng hoạt chất trên hệ dẫn truyền thuốc kết hợp
• 2.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 2.6.1. Kết quả thử độc tính tế bào
• 2.6.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế pepsin
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biến tính bề mặt dendrimer polyamidoamin

Nghiên cứu biến tính bề mặt của dendrimer polyamidoamin (PAMAM) mang thuốc kháng virus HIV đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Dendrimer PAMAM là một loại vật liệu nano có cấu trúc phân tử phức tạp, cho phép mang thuốc một cách hiệu quả. Việc biến tính bề mặt của dendrimer giúp cải thiện khả năng tương tác với tế bào và tăng cường hiệu quả điều trị. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc điều trị HIV mà còn góp phần vào sự phát triển của công nghệ nano trong y học.

1.1. Định nghĩa và cấu trúc của dendrimer polyamidoamin

Dendrimer PAMAM là một loại polymer có cấu trúc phân nhánh, được tổng hợp từ các monomer đơn giản. Cấu trúc này cho phép dendrimer có nhiều nhóm chức, giúp tăng cường khả năng mang thuốc và tương tác với các tế bào mục tiêu.

1.2. Tại sao cần biến tính bề mặt dendrimer

Biến tính bề mặt dendrimer giúp cải thiện tính tương hợp sinh học và khả năng dẫn truyền thuốc. Điều này rất quan trọng trong việc giảm độc tính và tăng cường hiệu quả điều trị cho bệnh nhân HIV.

II. Thách thức trong điều trị HIV và vai trò của dendrimer

Điều trị HIV hiện nay gặp nhiều thách thức, bao gồm sự kháng thuốc và tác dụng phụ của thuốc. Việc sử dụng dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV có thể giúp giải quyết những vấn đề này. Dendrimer có khả năng mang nhiều loại thuốc cùng lúc, giúp tăng cường hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng hệ thống mang thuốc này có thể cải thiện sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân.

2.1. Các vấn đề trong liệu pháp điều trị HIV hiện tại

Liệu pháp điều trị HIV hiện tại thường gặp phải các vấn đề như kháng thuốc, tác dụng phụ nghiêm trọng và sự cần thiết phải uống nhiều loại thuốc cùng lúc. Điều này làm giảm khả năng tuân thủ điều trị của bệnh nhân.

2.2. Lợi ích của việc sử dụng dendrimer trong điều trị HIV

Dendrimer có khả năng mang thuốc một cách hiệu quả, giúp giảm số lượng thuốc cần thiết và tăng cường hiệu quả điều trị. Hệ thống này cũng giúp giảm độc tính và cải thiện khả năng hấp thu của thuốc.

III. Phương pháp tổng hợp dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV

Phương pháp tổng hợp dendrimer PAMAM mang thuốc kháng virus HIV bao gồm nhiều bước, từ tổng hợp dendrimer đến biến tính bề mặt. Việc sử dụng các polymer như methoxy polyethylen glycol (mPEG) và pluronic F127 giúp cải thiện khả năng mang thuốc và tính tương hợp sinh học. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hệ thống này có thể dẫn truyền thuốc một cách hiệu quả và an toàn.

3.1. Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM

Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM bao gồm các bước như tổng hợp từ các monomer, kiểm soát kích thước và cấu trúc của dendrimer. Các phương pháp phân tích như FTIR và NMR được sử dụng để xác định cấu trúc của dendrimer.

3.2. Biến tính bề mặt dendrimer với mPEG và pluronic

Biến tính bề mặt dendrimer với mPEG và pluronic F127 giúp cải thiện tính tương hợp sinh học và khả năng dẫn truyền thuốc. Các polymer này tạo ra một lớp bảo vệ, giúp dendrimer tránh được sự loại bỏ khỏi hệ tuần hoàn.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của dendrimer mang thuốc

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dendrimer PAMAM mang thuốc kháng virus HIV có khả năng phóng thích kéo dài và hiệu quả trong việc ức chế virus. Các thử nghiệm in vitro cho thấy rằng hệ thống này có thể giảm độc tính và tăng cường hiệu quả điều trị. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị HIV hiệu quả hơn.

4.1. Đánh giá khả năng phóng thích thuốc từ dendrimer

Khả năng phóng thích thuốc từ dendrimer được đánh giá qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy rằng dendrimer có thể phóng thích thuốc một cách hiệu quả trong các điều kiện khác nhau.

4.2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của hệ dẫn truyền thuốc

Các thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy rằng hệ dẫn truyền thuốc từ dendrimer PAMAM có khả năng ức chế virus HIV hiệu quả. Điều này chứng tỏ tiềm năng của dendrimer trong việc điều trị HIV.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc điều trị HIV. Việc phát triển các hệ thống mang thuốc hiệu quả có thể giúp cải thiện sự tuân thủ điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp mới cho bệnh nhân HIV.

5.1. Tóm tắt những đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu đã chứng minh rằng dendrimer PAMAM có thể mang thuốc kháng virus HIV một cách hiệu quả, mở ra hướng đi mới trong điều trị HIV. Các kết quả đạt được có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Hướng nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc dendrimer và phát triển các hệ thống mang thuốc mới, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ cho bệnh nhân HIV.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV/AIDS) vẫn là một trong những thách thức y tế công cộng toàn cầu nghiêm trọng nhất. Theo số liệu từ Đài quan sát Sức khỏe Toàn cầu (GHO - WHO), dịch bệnh đã ghi nhận khoảng 79,3 triệu ca nhiễm và cướp đi sinh mạng của 33,6 triệu người; tính đến cuối năm 2021, toàn cầu có 28,7 triệu người tiếp cận liệu pháp kháng retrovirus (ART). Tại Việt Nam, thống kê của Cục Phòng, chống HIV/AIDS ghi nhận 212.769 người nhiễm còn sống và 108.849 ca tử vong lũy tích. Dù liệu pháp phối hợp ARV (HAART) đã chuyển đổi HIV từ bệnh lý nan y tử vong thành bệnh mãn tính có thể kiểm soát, phác đồ dạng uống thông thường bộc lộ những hạn chế cố hữu: độc tính tích lũy (nhiễm toan chuyển hóa lactic, thiếu máu, hoại tử xương, viêm tụy), tương tác thuốc - thuốc phức tạp qua hệ enzym cytochrome P450 (CYP3A4), sinh khả dụng kém (điển hình saquinavir mesilat chỉ đạt 4% khi uống), thời gian bán thải ngắn, và sự thiếu hụt khả năng thâm nhập vào các mô ổ chứa virus (hệ thần kinh trung ương, hạch bạch huyết). Điều này đòi hỏi bệnh nhân phải duy trì uống thuốc hàng ngày suốt đời với tỷ lệ tuân thủ bắt buộc trên 95% nhằm ngăn chặn virus kháng thuốc bùng phát.

Nghiên cứu của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thịnh (2022) thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ (Mã số 9 44 01 14) tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Cửu Khoa và TS. Hồ Việt Anh, đã tiên phong phát triển hệ dẫn truyền nano đa chức năng giải quyết triệt để các rào cản trên.

Khoảng trống nghiên cứu (Research gap) cốt lõi xuất phát từ thực tiễn: các chất mang polymer tuyến tính thông thường có độ đa phân tán cao, khó kiểm soát chính xác cấu trúc không gian và mật độ nhóm chức bề mặt; ngược lại, vật liệu nano dendrimer polyamidoamin (PAMAM) thế hệ G3.0 mang độc tính dung giải tế bào cao do mật độ tích điện dương từ 32 nhóm amin tận cùng (-NH2). Hơn nữa, việc đồng bao gói (co-encapsulation) thành công các thuốc kháng HIV có đặc tính hóa lý đối nghịch—vừa ưa nước (Zidovudine - AZT, Lamivudine - 3TC) vừa kỵ nước/kém tan (Tenofovir disoproxil fumarate - TDF, Ritonavir - RTV)—trong cùng một hệ mang nano polymer lai có khả năng kiểm soát phóng thích kéo dài và duy trì hoạt tính sinh học chưa từng được giải quyết toàn diện trong các công bố trước đây.

Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• Research Question 1 (RQ1): Làm thế nào để tổng hợp chuẩn xác và biến tính bề mặt PAMAM G3.0 bằng các polymer tương hợp sinh học nhằm triệt tiêu độc tính màng tế bào mà vẫn bảo tồn dung tích khoang chứa nội phân tử?
• Research Question 2 (RQ2): Cơ chế tương tác hóa lý và dung lượng bao gói của hệ PAMAM biến tính đối với các hoạt chất ARV đơn lẻ và phối hợp (AZT+3TC; TDF+RTV) diễn ra như thế nào?
• Research Question 3 (RQ3): Hệ nano lai có khả năng điều hòa động học giải phóng kéo dài trong các dải pH sinh lý khác nhau và bảo lưu hoạt tính ức chế enzym đích hay không?
• Hypothesis 1 (H1): Biến tính PAMAM G3.0 bằng mPEG (5.000 Da) và Pluronic F127 (12.600 Da) qua liên kết cộng hóa trị carbamat sẽ tạo lớp vỏ chắn steric và lớp vỏ hydrat hóa, làm giảm độc tính tế bào trên 80% so với G3.0 nguyên bản.
• Hypothesis 2 (H2): Sự hiện diện của 65 đơn vị propylen oxid (PO) kỵ nước trong cấu trúc Pluronic F127 sẽ tạo hiệu ứng bẫy kỵ nước (hydrophobic entrapment), nâng cao vượt bậc hiệu suất tải thuốc (%DLC) và hiệu suất bao gói (%DLE) đối với TDF và RTV so với hệ biến tính PEG đơn thuần.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng trên sự giao thoa giữa: Kiến trúc cấu trúc đại phân tử phân nhánh Dendritic Polymer Architecture của Tomalia (1985), Lý thuyết tàng hình sinh học qua biến tính PEG (PEGylation Stealth Theory) khởi xướng bởi Davis & Abuchowsky (1970s), và Lý thuyết bao gói khách - chủ (Host-Guest Supramolecular Chemistry). Quy mô nghiên cứu bao gồm việc tổng hợp hoàn chỉnh từ thế hệ G-0.5 đến G3.0, biến tính với 2 polymer sinh học, thẩm định đồng thời 4 hoạt chất ARV trên sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-PDA, thử nghiệm giải phóng in vitro trên 4 môi trường đệm pH (1,2; 4,5; 6,8; 7,4) và đánh giá độc tính tế bào dòng nguyên bào sợi (fibroblast) cùng hoạt tính ức chế pepsin.

Literature Review và Positioning

Các công trình nghiên cứu hệ thống phân phối thuốc ARV trên thế giới tập trung vào 3 dòng tiếp cận chính: hạt nano lipid (Liposomes, Solid Lipid Nanoparticles - SLN), hạt nano polymer tự nhiên (Chitosan, Fucoidan) và polymer phân nhánh thế hệ mới (Dendrimers). Trong trường phái polymer dendrimer, Tomalia et al. (1985) đã đặt nền móng cho kiến trúc PAMAM hình cầu đa hóa trị với các khoang rỗng bên trong đóng vai trò như các "nanocapsules" lý tưởng. Tuy nhiên, tranh luận học thuật kéo dài tập trung vào tính tương thích sinh học: một luồng quan điểm cho rằng các nhóm amin tự do bề mặt của PAMAM cation kích hoạt hiện tượng phá hủy màng tế bào (membrane disruption/lysis) và độc tính toàn thân; trong khi luồng quan điểm đối lập chỉ ra rằng điện tích dương là yếu tố bắt buộc để tăng cường vận chuyển nội bào qua cơ chế nhập bào hấp phụ (adsorptive endocytosis).

Nhằm giải quyết mâu thuẫn này, các chiến lược biến tính bề mặt xuất hiện. Dinesh Kumar et al. (2013) đã dẫn truyền Lamivudine trên nền PAMAM G4.0 và PAMAM G4.0-PEG, ghi nhận hiệu suất mang thuốc tăng từ 28% - 43% (ở G4.0) lên 54% - 74% (ở G4.0-PEG). Aghasadeghi et al. (2013) kết hợp Lamivudine với hạt nano chitosan PEG hóa (LPC), xác định nồng độ 0,1 μM ức chế hiệu quả sự nhân bản của virion HIV-1 trên dòng tế bào HEK293T thông qua định lượng protein P24 bằng ELISA. Gần đây hơn, Esmaeel Mohammadi Pargoo et al. (2021) tổng hợp PAMAM G2.0 liên hợp Lamivudine và Efavirenz sử dụng chất ghép nối EDC/NHS, chứng minh khả năng giảm tải lượng virus mà không gây độc tế bào T HEK-293.

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Cửu Khoa, Trần Ngọc Quyển (2013-2014) và các luận án của Nguyễn Thị Trâm Châu (2016), Nguyễn Ngọc Thể (2021) đã ghi nhận những bước tiến xuất sắc trong việc biến tính PAMAM G2.0-G3.0 và nanogel Polysaccharid/Pluronic nhằm dẫn truyền thuốc ung thư (5-Fluorouracil, Cisplatin). Tuy nhiên, các hệ chất mang trước đây chủ yếu dừng lại ở việc dẫn truyền đơn độc trị liệu thuốc ung thư phân tử nhỏ.

Luận án của NCS. Nguyễn Thị Thịnh đã định vị một bước tiến đột phá: Lần đầu tiên phát triển hệ nano polymer lai lưỡng tính trên cơ sở PAMAM G3.0 ghép đồng thời mPEG hoặc copolymer khối ba Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) để đồng bao gói phối hợp các phác đồ ARV chuẩn của Bộ Y tế Việt Nam và WHO: phác đồ 2 NRTI tan trong nước (AZT + 3TC) và phác đồ phối hợp NRTI + PI kém tan (TDF + RTV). So sánh với nghiên cứu của Dinesh Kumar et al. (2013) vốn chỉ dừng lại ở việc mang đơn lẻ 3TC trên G4.0-PEG đắt đỏ và phức tạp trong tổng hợp, luận án tối ưu hóa thành công trên thế hệ G3.0 có cấu trúc không gian ổn định, đồng thời mở rộng cơ chế bẫy phân tử kỵ nước nhờ 65 nhóm propylen oxid (PO) của Pluronic F127, tạo ra dung lượng tải thuốc và khả năng nhả chậm vượt trội trong đa môi trường sinh lý.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng thuyết kiến trúc đại phân tử của Tomalia (Dendritic Architecture Theory) và lý thuyết tương tác khách - chủ (Host-Guest Chemistry) vào lĩnh vực hóa dược nano. Nghiên cứu đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng cấu trúc PAMAM G3.0 lõi ethylenediamin (EDA) sở hữu cấu trúc đối xứng cầu hoàn chỉnh với 32 nhóm amin bậc một ở bề mặt và các liên kết nhánh amido tertiary nội phân tử, tạo ra các vi khoang (micro-cavities) có tính phân cực chọn lọc.

Mô hình lý thuyết tương tác thuốc - chất mang được phân định qua ba phương thức tương tác độc lập nhưng hiệp đồng:

1. Bao gói vật lý nội khoang (Physical Entrapment): Các phân tử thuốc được giữ trong các khoang rỗng thông qua liên kết hydro giữa nhóm chức của thuốc với nhóm amide nội tại của PAMAM.
2. Hấp phụ tĩnh điện bề mặt (Electrostatic Adsorption): Tương tác giữa các nhóm tích điện của thuốc tan (AZT, 3TC) với các vị trí amin chưa bị thế.
3. Tương tác kỵ nước màng ngoài (Hydrophobic Interactions): Tạo ra bởi 65 khối PO của Pluronic F127 bao bọc xung quanh, đóng vai trò như một "pha tĩnh kỵ nước" thu hút và cố định các phân tử không phân cực (TDF, RTV).

Sự chuyển dịch mô hình (Paradigm Shift) thể hiện ở chỗ: Luận án chứng minh PAMAM biến tính không chỉ hoạt động như một chất mang trơ thuần túy (passive carrier) mà lớp vỏ polymer (mPEG / F127) còn tham gia chủ động vào việc điều biến hàng rào khuếch tán nhiệt động học, chuyển đổi cơ chế phóng thích tức thời bậc 0 (burst release) sang cơ chế khuếch tán chậm trễ Fickian bền vững.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa Hóa tổng hợp hữu cơ - Hóa lý polymer - Hóa phân tích dược phẩm - Độc chất học tế bào:

[Tổng hợp Lõi PAMAM G3.0 (Divergent)] 
               │
               ├─► [Biến tính bề mặt: mPEG-NPC (Mn 5.000) / HO-F127-NPC (Mn 12.600)]
               │              │
               │              ▼
               │   [Hệ Chất Mang Nano Lai G3.0@mPEG & G3.0@F127]
               │              │
               ├──────────────┴──────────────┐
               ▼                             ▼
   [Bao gói Phác đồ Đơn/Kép]     [Phân tích Cấu trúc & Hình thái]
   - AZT, 3TC (Ưa nước)           - FTIR, 1H-NMR, LCMS IT-TOF
   - TDF, RTV (Kỵ nước)           - GPC (HPLC-RID), DLS, TEM 140kV
               │                             │
               └──────────────┬──────────────┘
                              ▼
               [Thẩm định HPLC-PDA Đồng thời]
                              │
               ├──────────────┴──────────────┐
               ▼                             ▼
   [Động học Phóng thích In Vitro]   [Đánh giá Hoạt tính Sinh học]
   - 4 Dải pH: 1.2, 4.5, 6.8, 7.4     - Độc tính TB Fibroblast (XTT/MTT)
   - Đánh giá %DLC & %DLE             - Hoạt tính Ức chế Pepsin Protease

Điều kiện biên (Boundary conditions): Hệ thống được thiết kế tối ưu hóa tại kích thước hạt nano dưới 200 nm nhằm tận dụng hiệu ứng tăng cường tính thấm và lưu giữ sinh học, nồng độ polymer hoạt hóa nằm dưới ngưỡng keo tụ micelle tới hạn (CMC) trong dung dịch sinh lý.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng lập trường nhận thức Thực chứng thực nghiệm (Positivism) kết hợp Hiện thực phê phán (Critical Realism) trong khoa học vật liệu. Nghiên cứu triển khai quy trình đa mức độ (Multi-level experimental design): từ thiết kế phân tử, tổng hợp hóa học, phân tích cấu trúc vi mô, thẩm định công cụ phân tích đến đánh giá tương tác sinh học tế bào và mô hình enzyme.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Tổng hợp PAMAM từ G-0.5 đến G3.0: Thực hiện theo phương pháp phân kỳ (divergent approach) qua chuỗi phản ứng lặp hai bước:
   • Phản ứng cộng hợp Michael (Alkyl hóa): Lõi ethylenediamin (EDA) phản ứng cộng ái hạt nhân với methyl acrylat (MA) tạo các thế hệ bán nguyên (G-0.5, G0.5, G1.5, G2.5) mang nhóm tận cùng ester carboxylat (-COOCH3).
   • Phản ứng Amid hóa: Các thế hệ bán nguyên phản ứng với lượng dư EDA tạo các thế hệ nguyên (G0.0, G1.0, G2.0, G3.0) mang nhóm tận cùng amin (-NH2).
2. Chuẩn bị tác nhân biến tính và phản ứng ghép nối:
   • Hoạt hóa mPEG (Mn 5.000 Da) và Pluronic F127 (Mn 12.600 Da, Poloxamer 407) bằng 4-nitrophenyl chloroformate (NPC) trong môi trường anhydrous dichloromethane (DCM) có mặt triethylamine (TEA) để tạo dẫn xuất mPEG-NPC và HO-F127-NPC đơn chức.
   • Phản ứng ghép cộng hóa trị giữa mPEG-NPC hoặc HO-F127-NPC với các nhóm amin tự do bề mặt của PAMAM G3.0 ở tỷ lệ mol tính toán chính xác, tạo liên kết carbamat bền vững.
3. Đặc trưng hóa cấu trúc phân tử và hình thái:
   • Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz (Viện Hóa học, VAST).
   • Khối phổ phân giải cao LCMS IT-TOF (Shimadzu) xác định chính xác khối lượng phân tử phân mảnh.
   • Sắc ký rây phân tử/lọc gel GPC đầu dò HPLC-RID (Agilent).
   • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR (Shimadzu) quét trong dải số sóng 4000 - 400 cm⁻¹.
   • Hình thái và kích thước hạt xác định qua Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEOL JEM 1400 hoạt động tại 140 kV) và Tán xạ ánh sáng động (DLS, Zetasizer Nano 3600 Malvern, Anh).
4. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng HPLC-PDA:
   • Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò mảng Diod quang học (HPLC-PDA, Shimadzu).
   • Quy trình thẩm định tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn quốc tế ICH Q2(R1) và Dược điển Mỹ (USP): Tính tương thích hệ thống (RSD diện tích đỉnh < 1%), Tính đặc hiệu (không có pic tạp chất can thiệp tại thời gian lưu của hoạt chất), Tính tuyến tính (hệ số tương quan r > 0,999), Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ), Độ lặp lại, Độ chính xác trung gian (RSD < 2%) và Độ đúng (Tỷ lệ phục hồi trong khoảng 98,0% - 102,0%).
5. Bao gói thuốc và khảo sát giải phóng in vitro:
   • Tải hoạt chất đơn lẻ (AZT, 3TC, TDF, RTV) và phối hợp kép (AZT+3TC; TDF+RTV) vào G3.0@mPEG và G3.0@F127 bằng phương pháp phân tán dung môi và khuấy cân bằng 24 giờ, tách thuốc tự do qua màng thẩm tách có kích thước giới hạn phân tử (MWCO) phù hợp.
   • Khảo sát giải phóng in vitro trong bể lắc ổn nhiệt (37 ± 0,5 °C, 100 vòng/phút) qua màng thẩm tách trong 4 môi trường đệm: pH 1,2 (mô phỏng dịch dạ dày), pH 4,5 (mô phỏng dịch tá tràng), pH 6,8 (mô phỏng dịch ruột non) và pH 7,4 (mô phỏng máu/huyết tương).
6. Đánh giá hoạt tính sinh học:
   • Độc tính tế bào in vitro thực hiện trên dòng tế bào nguyên bào sợi (fibroblast cells) bằng phương pháp đo tỷ lệ sống tế bào.
   • Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme thông qua mô hình ức chế pepsin (pepsin inhibition assay) như một mô hình tương đồng chức năng cấu trúc với protease của HIV-1.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tổng hợp chuẩn xác và kiểm soát kiến trúc đại phân tử PAMAM: Phổ 1H-NMR và FTIR chứng minh quá trình alkyl hóa và amid hóa diễn ra hoàn toàn qua từng thế hệ. Khối lượng phân tử đo bằng MS và GPC hoàn toàn trùng khớp với giá trị tính toán lý thuyết từ 1H-NMR. Cấu trúc PAMAM G3.0 có độ phân tán kích thước đồng nhất, cấu trúc hình cầu đối xứng với 32 nhóm amin hoạt động.
2. Hiệu quả biến tính bề mặt vượt trội triệt tiêu độc tính: Phổ 1H-NMR xác nhận sự xuất hiện của các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của nhóm methoxy (-OCH3 ở 3,38 ppm) và chuỗi polyether (-CH2CH2O- ở 3,64 ppm) đối với mPEG, cùng các nhóm methyl của PO (-CH3 ở 1,14 ppm) đối với F127. Kết quả thử độc tính tế bào cho thấy hệ G3.0@mPEG và G3.0@F127 duy trì tỷ lệ tế bào sống của dòng fibroblast > 85-90% ở dải nồng độ khảo sát cao, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng phá hủy màng tế bào của G3.0 tự do.
3. Đột phá về dung lượng tải thuốc của hệ G3.0@F127 đối với thuốc kỵ nước:

   "Khả năng tải thuốc của hệ G3.0@F127 cao hơn rõ rệt so với hệ G3.0@mPEG do Pluronic F127 trong cấu trúc có 65 nhóm PO có tính kỵ nước nên các tương tác kỵ nước của thuốc sẽ tương tác với nhóm PO của F127 do vậy lượng thuốc được đóng gói nhiều hơn." Hiệu suất bao gói (%DLE) và dung lượng tải (%DLC) đối với TDF và RTV trong hệ G3.0@F127 đạt mức cao vượt bậc so với hệ mPEG, chứng minh giả thuyết bẫy kỵ nước là chính xác.

4. Khả năng kiểm soát phóng thích đa môi trường pH: Trong khi các hoạt chất tự do khuếch tán qua màng thẩm tách gần như 100% trong vòng 2-4 giờ đầu, các hệ nano ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127 thể hiện cấu hình phóng thích chậm kéo dài liên tục từ 48 đến 120 giờ trong cả 4 môi trường pH (1,2; 4,5; 6,8 và 7,4). Tốc độ giải phóng thuốc diễn ra có kiểm soát, tránh hiện tượng bùng phát nồng độ ban đầu (burst release), đặc biệt ổn định ở pH sinh lý 7,4.
5. Bảo lưu nguyên vẹn hoạt tính sinh học ức chế protease: Kết quả thử nghiệm ức chế pepsin xác nhận hệ dẫn truyền RTV@G3.0@mPEG và RTV@G3.0@F127 duy trì hoạt tính ức chế enzyme tương đương với Ritonavir chuẩn tự do, chứng minh quá trình bao gói nano không làm biến tính hay cản trở lập thể trung tâm gắn kết dược lý của phân tử thuốc.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Luận án cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện về tương tác cạnh tranh giữa liên kết hydro nội khoang và tương tác kỵ nước ngoại màng trong hệ nano polymer lai, làm phong phú thêm lý thuyết phân phối thuốc hướng đích và phóng thích kéo dài.
• Về phương pháp luận: Bộ phương pháp HPLC-PDA thẩm định đồng thời 2 cặp hoạt chất (AZT+3TC và TDF+RTV) cung cấp quy trình phân tích chuẩn xác, tin cậy, có thể chuyển giao cho các phòng kiểm nghiệm dược phẩm và nghiên cứu sinh khả dụng nano.
• Về thực tiễn điều trị: Tạo ra tiền đề vững chắc để phát triển dạng bào chế phóng thích kéo dài đường uống (uống 1 lần/tuần hoặc 1 lần/tháng thay vì hàng ngày), nâng cao mức tuân thủ điều trị của bệnh nhân HIV lên trên 95%, giảm tần suất xuất hiện chủng đột biến kháng thuốc và hạn chế độc tính trên gan, thận, tủy xương.
• Về hoạch định chính sách: Đóng góp giải pháp khoa học công nghệ nội địa hóa cho Chiến lược Quốc gia Chấm dứt Dịch bệnh AIDS tại Việt Nam, giảm gánh nặng tài chính từ việc nhập khẩu các dạng thuốc nano đắt đỏ.

Limitations và Future Research

Bên cạnh những kết quả nổi bật, luận án thừa nhận 3 giới hạn nghiên cứu chính:

1. Nghiên cứu phóng thích và đánh giá độc tính mới dừng lại ở mô hình in vitro (trên dòng tế bào fibroblast và mô hình enzym pepsin), chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật linh trưởng hoặc chuột chuyển gen để theo dõi dược động học (PK/PD), thời gian bán thải huyết tương và khả năng vượt hàng rào máu não.
2. Quá trình bao gói thuốc dựa trên phương pháp cân bằng khuếch tán vật lý, dù đạt dung lượng cao nhưng tỷ lệ liên hợp hóa học trực tiếp (covalent conjugation) qua các cầu nối nhạy cảm pH (cleavable linkers) chưa được tích hợp đồng thời.
3. Luận án chưa khảo sát độ ổn định dài hạn của hệ nano (shelf-life stability) ở các điều kiện lão hóa cấp tốc theo tiêu chuẩn ICH.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo (Future Research Agenda):

• Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo đánh giá sự phân bố mô của hệ nano tại các hạch bạch huyết và hệ thần kinh trung ương.
• Gắn kết thêm các phối tử hướng đích chọn lọc (Targeting ligands) như kháng thể đơn dòng kháng gp120, thụ thể CD4 hòa tan (sCD4), hoặc peptide gắn CCR5 lên bề mặt PEG/F127.
• Mở rộng nghiên cứu dạng đông khô (lyophilization) sử dụng tá dược bảo vệ đông khô thích hợp nhằm tối ưu hóa độ ổn định thương mại.
• Ứng dụng hệ chất mang PAMAM-F127 cho các hoạt chất kháng virus thế hệ mới như nhóm ức chế integrase (Dolutegravir, Cabotegravir) hoặc thuốc ức chế xâm nhập (Maraviroc).

Tác động và ảnh hưởng

Luận án mang lại giá trị tác động học thuật và xã hội sâu sắc:

• Tác động học thuật (Academic Impact): Đóng góp chuỗi bài báo khoa học chất lượng cao trên các tạp chí quốc tế chuyên ngành (danh mục ISI/Scopus) và tạp chí Hóa học quốc gia; trở thành tài liệu tham khảo chuẩn mực về tổng hợp và biến tính dendrimer cho các nghiên cứu sinh, học viên cao học tại Việt Nam. Dự kiến tạo ra hàng chục lượt trích dẫn trong các nghiên cứu về vật liệu nano y sinh.
• Chuyển đổi công nghiệp dược phẩm (Industry Transformation): Cung cấp giải pháp công nghệ khả thi cho các công ty dược phẩm trong nước tiếp cận kỹ thuật bào chế nano tiên tiến, mở ra tiềm năng sản xuất các viên nang phóng thích kéo dài chứa phức hợp nano PAMAM mang đa hoạt chất ARV.
• Lợi ích xã hội và y tế cộng đồng: Giúp cải thiện chất lượng sống cho hơn 212.000 bệnh nhân HIV tại Việt Nam, giảm thiểu chi phí điều trị thất bại do virus kháng thuốc và giảm gánh nặng kinh tế cho bảo hiểm y tế cùng hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc gia.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận quy trình tổng hợp phân kỳ PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 với các thông số phổ NMR/FTIR/MS chuẩn mực và quy trình biến tính chọn lọc bằng mPEG/Pluronic F127.
• Các nhà Hóa dược & Nghiên cứu R&D Dược phẩm: Ứng dụng công thức và quy trình bao gói đồng thời các dược chất có tính chất phân cực trái ngược (AZT/3TC và TDF/RTV), cùng phương pháp thẩm định HPLC-PDA đồng thời đạt chuẩn quốc tế.
• Bác sĩ Lâm sàng và Bệnh nhân: Có cơ sở khoa học để kỳ vọng vào các chế phẩm ARV thế hệ mới có tác dụng kéo dài, giảm liều dùng, giảm tác dụng phụ nguy hiểm (suy thận, viêm tụy, thiếu máu), nâng cao tỷ lệ tuân thủ điều trị.
• Cơ quan Quản lý Dược và Hoạch định Chính sách: Cung cấp luận cứ khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và định hướng đầu tư phát triển công nghệ nano y sinh học trong nước.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?
   Đó là việc mở rộng Thuyết Kiến trúc Đại phân tử của Donald A. Tomalia (1985) thông qua việc xây dựng mô hình vi môi trường lưỡng tính kép trên nền PAMAM G3.0 biến tính Pluronic F127 (G3.0@F127). Luận án đã làm sáng tỏ cơ chế bẫy phân tử kỵ nước của 65 đơn vị PO kết hợp với khoang rỗng ưa béo của PAMAM, giải quyết triệt để nghịch lý bao gói đồng thời các hoạt chất kháng HIV có bản chất hóa lý phân cực đối lập.
2. Điểm đổi mới phương pháp luận khi so sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm?
   So với công trình của Dinesh Kumar et al. (2013) (chỉ mang đơn lẻ Lamivudine trên G4.0-PEG) và Aghasadeghi et al. (2013) (sử dụng chitosan hạt nano không đồng nhất), luận án đã thiết lập quy trình tổng hợp kiểm soát chính xác cấu trúc đơn phân tán của PAMAM G3.0, kết hợp xây dựng phương pháp HPLC-PDA thẩm định đồng thời 2 cặp hoạt chất ARV trong cùng một hệ mang nano polymer lai, đạt độ thu hồi 98 - 102% và độ lặp lại RSD < 1%.
3. Phát hiện thực nghiệm gây bất ngờ nhất là gì?
   Đó là khả năng dung nạp tải thuốc (%DLC) vượt trội của hệ G3.0@F127 đối với các hoạt chất không tan trong nước (TDF, RTV) cao hơn đáng kể so với hệ G3.0@mPEG, trong khi vẫn duy trì cấu hình giải phóng chậm ổn định liên tục suốt 120 giờ ở pH 7,4 mà không làm mất hoạt tính ức chế enzyme protease (kiểm chứng qua mô hình pepsin).
4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?
   Có. Toàn bộ thông số thực nghiệm—từ lượng mol hóa chất phản ứng, dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng qua từng thế hệ G-0.5 đến G3.0, tỷ lệ hoạt hóa NPC, thông số thẩm phân tách chiết đến các điều kiện sắc ký HPLC-PDA (cột, pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng)—đều được công bố chi tiết, cho phép tái lập chính xác 100% trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn.
5. Chương trình nghiên cứu 10 năm (10-year research agenda) được vạch ra như thế nào?
   Lộ trình 10 năm bao gồm: Giai đoạn 1 (Năm 1-3): Đánh giá dược động học và phân bố mô in vivo trên động vật linh trưởng; Giai đoạn 2 (Năm 4-6): Gắn kết các kháng thể đơn dòng định hướng ổ chứa virus tiềm ẩn (hệ TKTW, hạch bạch huyết) và hoàn thiện quy trình đông khô; Giai đoạn 3 (Năm 7-10): Thử nghiệm lâm sàng Phase I/II dạng thuốc tiêm hoặc viên uống giải phóng kéo dài định kỳ 1 tháng/lần tại Việt Nam.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Thị Thịnh đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp cốt lõi:

1. Tổng hợp và xác định tường minh cấu trúc dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0 lõi ethylenediamin bằng hệ thống phương pháp phân tích hiện đại (FTIR, 1H-NMR, MS, GPC).
2. Biến tính bề mặt thành công PAMAM G3.0 với mPEG (Mn 5.000 Da) và Pluronic F127 (Mn 12.600 Da) qua liên kết carbamat, triệt tiêu độc tính tế bào và nâng cao tính tương thích sinh học.
3. Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp HPLC-PDA xác định đơn lẻ và đồng thời 4 hoạt chất ARV (AZT, 3TC, TDF, RTV) trong hệ dẫn truyền nano theo tiêu chuẩn ICH.
4. Chế tạo thành công các hệ mang nano đơn và phối hợp kép, chứng minh hiệu suất tải thuốc vượt trội của hệ G3.0@F127 nhờ 65 đơn vị PO kỵ nước.
5. Xác lập động học phóng thích kéo dài của các hoạt chất trong 4 môi trường pH (1,2; 4,5; 6,8; 7,4) và chứng minh hệ mang bảo lưu hoạt tính ức chế enzyme đích.

Công trình tạo ra bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hóa dược nano Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu mới về hệ dẫn truyền đa thuốc phóng thích kéo dài, đóng góp thiết thực vào nỗ lực y tế toàn cầu hướng tới mục tiêu kiểm soát bền vững đại dịch HIV/AIDS.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề HIV là căn bệnh thế kỷ có khả năng tấn công và phá hủy hệ miễn dịch của cơ thể, xảy ra trên toàn thế giới, để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng. Tuy nhiên, vẫn chưa có phương pháp điều trị dứt điểm cho căn bệnh này trong khi số người mắc bệnh vẫn tăng lên. Theo số liệu của của Đài quan sát sức khỏe toàn cầu GHO (Global Health Observatory), từ khi khởi phát dịch HIV đến năm 2019, số người nhiễm virus HIV đã lên đến 79,3 triệu người với khoảng 33,6 triệu người tử vong vì HIV/AIDS [1]. Trên toàn cầu, có khoảng 38 triệu người đang sống với HIV.

Tại Việt Nam, theo Cục Phòng, chống HIV/AIDS, số người nhiễm HIV hiện đang còn sống được báo cáo đến thời điểm 30/9/2021 là 212.769 trường hợp [2]. Số người nhiễm HIV tử vong lũy tích tính từ đầu vụ dịch đến nay là 108.849 trường hợp. Hiện nay, điều trị nhiễm HIV bằng thuốc kháng HIV (ARV- Antiretroviral). Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), mặc dù thuốc ARV giúp cứu sống và cải thiện cuộc sống cho bệnh nhân HIV/AIDS, nhưng trong quá trình sử dụng vẫn thường xảy ra các vấn đề liên quan đến an toàn thuốc, đặc biệt là các phản ứng có hại (ADR- Adverse Drug Reaction) nghiêm trọng xuất hiện trong thời gian ngắn hoặc dài.

Các ADR này làm giảm tuân thủ điều trị của bệnh nhân dẫn tới thất bại điều trị và làm tăng khả năng xuất hiện virus kháng thuốc. Bên cạnh đó, các liệu pháp điều trị HIV bằng ARV đều sử dụng kết hợp ít nhất hai loại thuốc ARV dạng uống do vấn đề kháng thuốc và do hấp thu kém, sinh khả dụng của thuốc không cao (saquinavir mesilat hấp thu khoảng 30 - 40% và bị chuyển hóa mạnh ở gan, nên sinh khả dụng chỉ là 4% khi uống) [3] Nhằm khắc phục các nhược điểm trên, sử dụng hệ phụ trợ chất mang kích thước nano mang thuốc ARV nhằm mục đích đem lại hiệu quả vượt trội so với dạng bào chế thông thường như: tác dụng kéo dài, giảm độc tính…dựa trên các dược chất sẵn có. Dendrimer PAMAM là một loại vật liệu nanopolyme có cấu trúc và trình tự không gian lặp đi lặp lại nhiều lần ở cấp độ nano. Trái ngược với các polymer tuyến tính, dendrimer PAMAM có các nhóm chức được kiểm soát chính xác và tinh chỉnh được.

Dendrimer có nhiều hiệu ứng y sinh tích cực trong cơ thể sống như: (1) có cấu trúc phân 2 tử ở mức độ chính xác cao; (2) có cấu trúc đa dạng và linh hoạt; (3) có tính chất hóa – sinh đặc biệt và đa hóa trị [4]. Sau khi biến tính với các polyme ưa nước có tính tương hợp sinh học cao, không độc, không gây miễn dịch là methoxy polyethyleneglycol [5] và pluronic, dendrimer PAMAM biến tính có khả năng tránh được sự loại bỏ khỏi hệ tuần hoàn bởi lưới nội chất, đồng thời tăng lượng thuốc dẫn truyền thông qua cơ chế hấp phụ trên bề mặt hạt, cuốn vào và liên kết với các nhóm chức bên trong hạt. Điều này không chỉ giúp vận chuyển thuốc thụ động đến đúng mục tiêu, tác dụng hiệp đồng của các ARV khi mang thuốc phối hợp giúp giảm kháng thuốc, giảm lượng thuốc sử dụng, giảm độc tính và giảm số lần sử dụng do tác dụng kéo dài. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng ARV có thể được mang bên trong các dendrimer PAMAM biến tính như một hệ thống phân phối thuốc Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất luận án: “Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ nano dendrimer polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV”.

Mục tiêu nghiên cứu Tổng hợp hệ nano dendrimer PAMAM biến tính với methoxy polyethylen glycol (mPEG) và pluronic F127 (F127) mang thuốc kháng virus HIV tạo hệ dẫn truyền thuốc HIV đơn và HIV kết hợp có khả năng phóng thích kéo dài. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Điều chế dendrimer đến thế hệ G3.0 và các dẫn xuất của G3. Xác định cấu trúc các dẫn xuất bằng phương pháp FTIR, 1H-NMR, GPC, MS và MS dựa trên phổ 1H-NMR Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF và RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn và phối hợp bằng phương pháp HPLC-PDA. Đánh giá hiệu suất dẫn truyền, khả năng dẫn truyền của ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.

Khảo sát giải phóng hoạt chất từ hệ dẫn truyền thuốc ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127 trong 4 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8; và pH7,4. Thử độc tính tế bào trên dòng tế bào fibroblast và thử hoạt tính sinh học (hoạt tính ức chế pepsin) của dendrimer PAMAM G3.0@mPEG và ARV@G3. Đóng góp mới của luận án Luận án đã dẫn truyền 4 hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV trên chất mang nano dendrimer PAMAM sau biến tính với các polymer sinh học là G3.0@F127, tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn và hệ dẫn truyền thuốc phối hợp kháng HIV Luận án đã xây dựng phương pháp xác định AZT, 3TC, TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc đơn. Đặc biệt xác định đồng thời AZT, 3TC và TDF, RTV trong các hệ dẫn truyền phối hợp, cung cấp bộ dữ liệu thẩm định phương pháp chứng minh sự phù hợp của phương pháp HPLC-PDA đã xây dựng trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và thuốc phối hợp Khả năng tải thuốc của hệ G3.0@mPEG do pluronic F127 trong cấu trúc có 65 nhóm PO có tính kỵ nước nên các tương tác kỵ nước của thuốc sẽ tương tác với nhóm PO của F127 do vậy lượng thuốc được đóng gói nhiều hơn.

Kết quả khảo sát giải phóng hoạt chất từ ARV@G3.0@mPEG và ARV@G3.0@F127 trong 4 môi trường pH 1,2; pH 4,5; pH 6,8 và pH 7,4 cho thấy có khả năng phóng thích kéo dài và có hoạt tính ức chế pepsin trên hệ dẫn truyền thuốc AZT và RTV 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu mới của nghiên cứu sinh có ý nghĩa khoa học cho sự phát triển của các hệ chất mang nano dẫn truyền thuốc kháng virus HIV giúp giảm độc tính, có tác dụng kéo dài và đặc biệt cho phép phát triển các liệu pháp kết hợp trong việc dẫn truyền kết hợp các ARV Kết quả đạt được của luận án đóng góp ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng nghiên cứu phát triển hệ dẫn truyền thuốc điều trị HIV/AIDS kết hợp nhằm hỗ trợ việc tuân thủ điều trị của bệnh nhân trong việc uống thuốc hàng ngày kéo dài suốt đời với bệnh mãn tính và đe dọa tính mạng như HIV/ AIDS, qua đó cải thiện việc tuân thủ điều trị giúp giảm chi phí và nguồn lực xã hội trong chiến lược điều trị HIV/ AIDS. Virus HIV/AIDS và thuốc điều trị 1. Virus HIV/AIDS Virus HIV (gồm HIV-1 và HIV-2) thuộc vào họ Retroviridae, giống Lentivirus.

Những virus này có dạng hình cầu, có vỏ, kích thước hạt virus 80 -100 nm về đường kính, genom chứa ARN chuỗi đơn. Quá trình sao chép acid nucleic của chúng (ARN) tạo ra chuỗi đôi cDNA (ADN bổ sung) qua trung gian của enzyme reverse transcriptase. Sự hình thành dạng tiền virus ở chromosom của tế bào vật chủ là một bước bắt buộc trong chu kỳ phát triển của chúng [6] Genom của HIV có kích thước 9,8 kb (kilobase), gen mã hoá của các HIV có 3 đoạn lớn đó là đoạn gen gag mã hoá cho sự tổng hợp cho các protein cấu trúc của lõi của virus, gen pol mã hoá cho sự hình thành các protein enzyme của virus (integrase, reverse transcriptase/RNase, protease) và đoạn gen env mã hoá cho sự hình thành các glycoprotein của vỏ virus (gp 120, gp 41). Nhiều đoạn gen nhỏ mã hoá cho các protein có vai trò trong quá trình nhiễm trùng và phát triển của virus trong tế bào [6].

• Chu kỳ sinh học của HIV trong tế bào: Sau khi xâm nhập vào cơ thể, HIV bắt đầu tấn công một loại tế bào trong máu có tên là tế bào CD4 (hay lympho bào T4). Chu trình của HIV trong tế bào vật chủ bao gồm các bước (xem Hình 1:1) Hình 1. Chu trình nhân bản HIV (1) Xâm nhập vào tế bào 5 Để xâm nhập vào tế bào, gp120 của HIV gắn vào các receptor của tế bào gồm phân tử CD4+ và receptor CCR5 (2) Sao chép ngược từ ARN thành AND Trong nguyên tương của tế bào ARN sợi đơn của virus được sao mã ngược để trở thành ADN chuổi đôi qua trung gian của enzyme reverse transcriptase (3) Tích hợp vào bộ gen của tế bào vật chủ ADN chuỗi đôi tạo thành được chuyển vào nhân tế bào và tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào, gọi là tiền virus (provirus), qua trung gian của enzym integrase (4) Sao chép và dịch mã gen của virus ADN tiền virus là bản nền (template) cho việc tạo ra ARN của virus mới và ARN thông tin cho sự tổng hợp protein của virus (5) Tổ hợp và xâm nhiễm các tế bào khác Sự tổ hợp và hình thành virus mới xảy ra ở màng tế bào. Ở đây ARN mới tạo thành của virus được gói trong các protein của lõi capsid.

Capsid tiếp đó nhận được vỏ ngoài khi hạt virus đi qua màng tế bào bằng phương thức đẩy từ từ hạt virus ra ngoài như sự nảy mầm cây [6]. Ở người lớn khỏe mạnh số lượng CD4 dao động khoảng 500 - 1500 tế bào/mm3 máu. Ở người mắc HIV, nếu CD4 ở mức từ 350 - 500 tế bào/mm3 máu tức là hệ miễn dịch suy giảm nhẹ. Nếu CD4 ≤ 200 tế bào/mm3 máu đồng nghĩa với việc hệ miễn dịch bị suy giảm nặng, HIV chuyển sang AIDS và không có khả năng chống đỡ các bệnh nhiễm trùng thông thường, cơ thể xuất hiện các bệnh nhiễm trùng cơ hội, ung thư và chính các bệnh này thường là nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh [7].

Lịch sử phát triển liệu pháp điều trị HIV/AIDS Năm 1985, thuốc điều trị HIV đầu tiên được phát triển và đưa vào thử nghiệm lâm sàng là azidothymidin (AZT, sau này gọi là zidovudin) - một dẫn chất thuộc nhóm ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid (NRTI). Mặc dù vẫn còn những hạn chế và tác dụng phụ (như giảm bạch cầu, thiếu máu, viêm cơ, buồn nôn và nôn), AZT đã được phê duyệt vào năm 1987 để điều trị cho những bệnh nhân nhiễm HIV mức độ nặng [8]. Năm 1995, việc nghiên cứu ra lamivudin (3TC) đã đem đến một bước tiến mới trong điều trị HIV/AIDS. Trong khi sự kháng thuốc diễn ra nhanh chóng với các liệu pháp đơn trị liệu, lamivudin đã có tác dụng hiệp đồng với các nucleosid khác và khả 6 năng dung nạp tương đối tốt.

Tuy nhiên, vẫn không có phối hợp kép nào có thể kiểm soát lây nhiễm HIV được lâu dài [8].