Phát Hiện Hợp Chất Ức Chế Enzym Protease (Mpro và PLpro) Của Virus SARS-CoV-2

Đại dịch COVID-19 do SARS-CoV-2 gây ra là một thách thức toàn cầu. 70 trang · Đại học Dược Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Lê Đăng Huy
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thế Hải
• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Phát Hiện Hợp Chất Ức Chế Enzym Protease Của Virus SARS-CoV-2
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2
• 1.2. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2
• 1.3. Protease của virus SARS-CoV-2
• 1.4. Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus
• 1.5. Cấu trúc của Mpro và PLpro
• 1.6. Tổng quan về mô phỏng động lực học phân tử
• 1.7. Đại cương về mô phỏng động lực học phân tử
• 1.8. Năng lượng tự do liên kết
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 2.5. Mô phỏng docking
• 2.6. Mô phỏng động lực học phân tử
• 2.7. Kiểm tra tính ổn định của phức hợp
• 2.8. Tính toán năng lượng tự do liên kết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Xây dựng mô hình 2D QSAR và sàng lọc sơ bộ
• 3.2. Mô phỏng docking
• 3.3. Mô phỏng động lực học phân tử
• 3.4. Ưu điểm của phương pháp
• 3.5. Nhược điểm của phương pháp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Enzym Protease SARS CoV 2 Cấu Trúc Chức Năng

Đại dịch COVID-19 do SARS-CoV-2 gây ra là một thách thức toàn cầu. Virus này ảnh hưởng đến nhiều cơ quan, gây ra các triệu chứng từ nhẹ đến nặng. Việc phát triển thuốc điều trị COVID-19 là vô cùng cấp thiết. Enzym protease SARS-CoV-2, đặc biệt là Mpro và PLpro, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus. Nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các hợp chất ức chế protease để ngăn chặn sự phát triển của virus. Các phương pháp thiết kế thuốc dựa trên công nghệ thông tin (CADD) ngày càng được áp dụng rộng rãi để tiết kiệm thời gian và chi phí.

1.1. Cấu trúc bộ gen và quá trình dịch mã của SARS CoV 2

SARS-CoV-2 là một loại coronavirus thuộc nhóm beta, có cấu trúc đặc trưng với sợi đơn ARN dương tính. Bộ gen của virus mã hóa các protein cấu trúc chính (S, E, M, N) và nhiều protein phi cấu trúc (nsp). Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, bộ gen được dịch mã để tạo ra các polyprotein, sau đó được phân cắt bởi các enzym protease như Mpro và PLpro. Quá trình này giải phóng các nsp cần thiết cho sự nhân lên của virus. Theo tài liệu gốc, hai phần ba bộ gen tính từ đầu 5’ bao gồm hai khung đọc mở (ORF 1 a và ORF 1 b) được dịch mã thành hai polyprotein (ppla và pplab) thông qua cơ chế chuyển dịch khung ribosome.

1.2. Vai trò của protease Mpro và PLpro trong vòng đời virus

Protease Mpro (3CLpro) và PLpro là hai enzym protease quan trọng của SARS-CoV-2. Chúng chịu trách nhiệm phân cắt các polyprotein thành các protein chức năng, cần thiết cho sự nhân lên của virus. Mpro phân cắt tại 11 vị trí trên polyprotein, trong khi PLpro có vai trò phức tạp hơn, bao gồm cả việc loại bỏ ubiquitin và ISG15 từ các protein của tế bào chủ, giúp virus trốn tránh hệ miễn dịch. Do đó, việc ức chế protease SARS-CoV-2 là một chiến lược đầy hứa hẹn để phát triển thuốc kháng virus.

II. Thách Thức Phát Triển Thuốc Ức Chế Protease SARS CoV 2 Hiệu Quả

Việc phát triển thuốc ức chế protease SARS-CoV-2 hiệu quả đối mặt với nhiều thách thức. Cần tìm kiếm các hợp chất ức chế protease có hoạt tính cao, chọn lọc và ít độc tính. Các biến thể SARS-CoV-2 có thể làm giảm hiệu quả của thuốc. Cần có các phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính nhanh chóng và chính xác. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc hiểu rõ cơ chế ức chế protease và tương tác thuốc-protein để tối ưu hóa cấu trúc và hiệu quả điều trị của thuốc.

2.1. Vấn đề kháng thuốc và sự xuất hiện của các biến thể SARS CoV 2

Sự xuất hiện của các biến thể SARS-CoV-2 là một thách thức lớn trong việc phát triển thuốc kháng virus. Các đột biến trong bộ gen của virus có thể làm thay đổi cấu trúc của enzym protease, làm giảm khả năng liên kết của thuốc và dẫn đến kháng thuốc. Do đó, cần có các nghiên cứu liên tục để theo dõi sự tiến hóa của virus và phát triển các loại thuốc có thể chống lại các biến thể SARS-CoV-2 mới.

2.2. Yêu cầu về độ chọn lọc và độc tính của chất ức chế protease

Một chất ức chế protease lý tưởng cần có độ chọn lọc cao đối với enzym protease SARS-CoV-2, tránh ảnh hưởng đến các protease khác trong cơ thể người. Độc tính của thuốc cũng là một yếu tố quan trọng cần xem xét. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc đánh giá dược động học và dược lực học của thuốc để đảm bảo an toàn và hiệu quả khi sử dụng trên người.

III. Phương Pháp Sàng Lọc Hợp Chất Ức Chế Protease SARS CoV 2

Các phương pháp sàng lọc hợp chất ức chế protease bao gồm sàng lọc in silico, thử nghiệm in vitro và thử nghiệm lâm sàng. Sàng lọc in silico sử dụng mô hình hóa phân tử và docking phân tử để dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với enzym protease. Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế protease của các hợp chất trong môi trường phòng thí nghiệm. Thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả điều trị và độ an toàn của thuốc trên người.

3.1. Ứng dụng tin sinh học và hóa tin học trong sàng lọc in silico

Tin sinh học và hóa tin học đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc hợp chất ức chế protease in silico. Các công cụ mô hình hóa phân tử và docking phân tử cho phép dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với enzym protease SARS-CoV-2. Các phương pháp học máy (Machine Learning) và trí tuệ nhân tạo (AI) có thể được sử dụng để xây dựng các mô hình dự đoán hoạt tính và tối ưu hóa cấu trúc của hợp chất.

3.2. Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính ức chế protease

Thử nghiệm in vitro là bước quan trọng để xác nhận hoạt tính ức chế protease của các hợp chất được sàng lọc in silico. Các thử nghiệm này sử dụng các enzym protease SARS-CoV-2 tái tổ hợp và các cơ chất đặc hiệu để đo lường khả năng ức chế protease của các hợp chất. Kết quả thử nghiệm in vitro cung cấp thông tin quan trọng về cơ chế ức chế protease và giúp lựa chọn các chất ức chế protease tiềm năng để phát triển thành thuốc.

IV. Mô Phỏng Động Lực Học Phân Tử Đánh Giá Tương Tác Thuốc Protein

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) là một công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu tương tác thuốc-protein. MD cho phép mô phỏng chuyển động của các nguyên tử trong phân tử theo thời gian, cung cấp thông tin chi tiết về sự ổn định của phức hợp thuốc-protein, các liên kết hydro và tương tác kỵ nước giữa thuốc và protein. MD giúp hiểu rõ cơ chế ức chế protease và tối ưu hóa cấu trúc của hợp chất ức chế protease.

4.1. Phân tích liên kết hydro và tương tác kỵ nước trong túi liên kết

Liên kết hydro và tương tác kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong sự liên kết của hợp chất ức chế protease với enzym protease SARS-CoV-2. Mô phỏng động lực học phân tử cho phép phân tích chi tiết các liên kết hydro và tương tác kỵ nước trong túi liên kết, giúp xác định các vị trí quan trọng cho sự liên kết và tối ưu hóa cấu trúc của hợp chất.

4.2. Đánh giá độ ổn định của phức hợp thuốc protein theo thời gian

Mô phỏng động lực học phân tử cho phép đánh giá độ ổn định của phức hợp thuốc-protein theo thời gian. Bằng cách mô phỏng chuyển động của các nguyên tử trong phân tử, MD có thể xác định các thay đổi cấu trúc và năng lượng của phức hợp, giúp đánh giá khả năng duy trì liên kết của thuốc với protein và dự đoán hiệu quả điều trị.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Phát Hiện Hợp Chất Tiềm Năng Từ Tự Nhiên

Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc tìm kiếm hợp chất ức chế protease từ nguồn gốc tự nhiên. Các hợp chất tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học cao và ít độc tính. Các phương pháp sàng lọc và mô phỏng động lực học phân tử đã được sử dụng để xác định các hợp chất tiềm năng từ thực vật, vi sinh vật và các nguồn gốc tự nhiên khác. Các hợp chất này có thể là tiền chất để phát triển thuốc điều trị COVID-19.

5.1. Sàng lọc hợp chất từ thư viện hợp chất tự nhiên và tổng hợp

Việc sàng lọc hợp chất từ thư viện hợp chất tự nhiên và hợp chất tổng hợp là một phương pháp hiệu quả để tìm kiếm chất ức chế protease tiềm năng. Các thư viện này chứa hàng ngàn hợp chất khác nhau, cung cấp một nguồn tài nguyên phong phú cho việc phát triển thuốc kháng virus. Các phương pháp sàng lọc in silico và thử nghiệm in vitro được sử dụng để xác định các hợp chất có hoạt tính cao và chọn lọc.

5.2. Tối ưu hóa cấu trúc và đánh giá dược động học dược lực học

Sau khi xác định được các hợp chất tiềm năng, cần tối ưu hóa cấu trúc của chúng để tăng hoạt tính ức chế protease và giảm độc tính. Các nghiên cứu dược động học và dược lực học được thực hiện để đánh giá khả năng hấp thụ, phân phối, chuyển hóa và thải trừ của thuốc trong cơ thể, cũng như tác dụng của thuốc lên mục tiêu sinh học. Kết quả của các nghiên cứu này giúp lựa chọn các hợp chất có tiềm năng phát triển thành thuốc điều trị COVID-19.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Ức Chế Protease SARS CoV 2

Việc phát hiện hợp chất ức chế protease SARS-CoV-2 là một hướng đi đầy hứa hẹn trong việc phát triển thuốc điều trị COVID-19. Các phương pháp sàng lọc và mô phỏng động lực học phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các hợp chất tiềm năng và hiểu rõ cơ chế ức chế protease. Các nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc, đánh giá dược động học, dược lực học và độ an toàn của thuốc để đưa ra các giải pháp điều trị hiệu quả và an toàn.

6.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu liên tục và hợp tác quốc tế

Nghiên cứu liên tục và hợp tác quốc tế là rất quan trọng trong cuộc chiến chống lại SARS-CoV-2. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học, các tổ chức nghiên cứu và các công ty dược phẩm trên toàn thế giới giúp chia sẻ thông tin, tài nguyên và kinh nghiệm, đẩy nhanh quá trình phát triển thuốc điều trị COVID-19.

6.2. Hướng nghiên cứu tương lai về chất ức chế protease phổ rộng

Hướng nghiên cứu tương lai cần tập trung vào việc phát triển chất ức chế protease phổ rộng, có khả năng chống lại nhiều loại coronavirus khác nhau, bao gồm cả các biến thể SARS-CoV-2 mới và các coronavirus gây bệnh trong tương lai. Điều này giúp chuẩn bị sẵn sàng cho các đại dịch tiềm năng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đại dịch COVID-19 do coronavirus 2 gây hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS-CoV-2) bùng phát từ tháng 12 năm 2019 tại Vũ Hán (Trung Quốc) đã tạo nên cuộc khủng hoảng y tế toàn cầu. Tính đến ngày 12 tháng 6 năm 2022, thế giới ghi nhận hơn 533 triệu ca nhiễm và hơn 6,3 triệu ca tử vong. Bệnh biểu hiện đa dạng từ sốt, ho khan, mệt mỏi đến tổn thương phổi cấp và suy hô hấp cấp tính. Trong các chiến lược ứng phó, phát triển phác đồ điều trị bằng thuốc đóng vai trò trọng tâm. Tuy nhiên, quy trình nghiên cứu và phát triển thuốc truyền thống từ sàng lọc hoạt chất đến thử nghiệm lâm sàng thường kéo dài trung bình 14 năm với chi phí lên tới 800 triệu USD. Nhằm tối ưu hóa thời gian và nguồn lực tài chính trong bối cảnh dịch bệnh cấp bách, phương pháp thiết kế thuốc với sự trợ giúp của máy tính (Computer-Aided Drug Design - CADD) trở thành hướng tiếp cận tối ưu. Khóa luận tập trung nghiên cứu hai enzym protease thiết yếu trong vòng đời virus là protease chính (Mpro) và protease giống papain (PLpro) – những cấu trúc có tính bảo tồn rất cao giữa các biến thể và chủng coronavirus, ít nguy cơ đột biến kháng thuốc.

Khóa luận xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đề xuất được phương pháp sàng lọc nhiều lớp có thể áp dụng trên số lượng lớn các chất để tìm ra chất có hoạt tính ức chế đồng thời Mpro và PLpro của virus SARS-CoV-2.
2. Đánh giá được hoạt tính các chất tiềm năng bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cấu trúc không gian của hai protease SARS-CoV-2 (Mpro và PLpro); cơ sở dữ liệu các chất ức chế đã công bố hoạt tính thực nghiệm; thư viện 7,3 triệu hợp chất phân tử nhỏ từ cơ sở dữ liệu ZINC thỏa mãn quy tắc 5 Lipinski; các phức hợp protein - phối tử hình thành từ quá trình gắn kết.
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung vào nhóm chất ức chế không phải peptidomimetic và liên kết không cộng hóa trị. Nghiên cứu thực hiện hoàn toàn trên mô hình tính toán (in silico) tại Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng sinh học cấu trúc của SARS-CoV-2 và các nguyên lý hóa tin học, cơ học phân tử:

• Khung lý thuyết và cấu trúc đích sinh học: Bộ gen ARN sợi đơn dương của virus mã hóa hai polyprotein (pp1a và pp1ab). Mpro (nsp5) hoạt động dưới dạng dimer với bộ đôi xúc tác Cys145-His41, nhận diện mô-típ cắt X-(Leu/Phe/Met)-Gln|(Gly/Ala/Ser)-X. PLpro (thuộc nsp3) tồn tại ở dạng monomer gồm 4 miền (Ubl, ngón cái, ngón tay chứa cụm ngón tay kẽm tạo bởi Cys189, Cys192, Cys224, Cys226, và lòng bàn tay), sở hữu bộ ba xúc tác Cys111-His272-Asp286 cùng hố oxyanion chứa Trp106, nhận diện mô-típ Leu-X-Gly-Gly|X để cắt polyprotein và thực hiện hoạt tính khử ubiquitin (Ub) cũng như ISG15 nhằm ức chế miễn dịch bẩm sinh của vật chủ.
• Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trên máy tính:
  • Phương pháp tương quan định lượng cấu trúc - tác dụng hai chiều (2D QSAR): Xây dựng bằng mô hình hồi quy tuyến tính đa biến (MLR) kết hợp thuật toán di truyền (GA) và quy tắc lọc QUIK (ngưỡng delta K = 0,05) để chọn tập con tham số tối ưu. Đánh giá độ phù hợp và kiểm chứng mô hình qua các thông số: hệ số xác định ($R^2$), $R^2$ hiệu chỉnh ($R^2_{adj}$), kiểm chứng chéo leave-one-out ($Q^2_{LOO}$), leave-many-out ($Q^2_{LMO}$ qua 2000 lần lặp với 30% mẫu bị loại trừ), xáo trộn ngẫu nhiên biến phụ thuộc Y (Y-randomization qua 2000 lần lặp để xác định $R^2_Y$ và $Q^2_Y$), cùng các chỉ số kiểm chứng ngoại ($Q^2_{F1}, Q^2_{F2}, Q^2_{F3}$). Miền ứng dụng (AD) được kiểm soát qua biểu đồ Williams dựa trên giá trị đòn bẩy giới hạn $h^* = 3p'/n$.
  • Phương pháp gắn kết phân tử (Molecular Docking): Tiến hành trên phần mềm MOE với thuật toán Triangle Matcher, trường lực Amber10:EHT; chấm điểm sơ bộ bằng London dG và tái xếp hạng bằng hàm Affinity dG.
  • Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics - MD): Mô phỏng quỹ đạo 100 ns bằng phần mềm NAMD 2, thiết lập điều kiện đẳng nhiệt - đẳng áp (NPT) ở 298,15 K, xử lý tương tác tĩnh điện tầm xa bằng Particle-Mesh Ewald (PME), solvat hóa trong hộp nước trực giao mở rộng 20 Å và trung hòa điện tích bằng ion NaCl. Đánh giá sự ổn định hệ thống qua độ lệch bình phương gốc (RMSD), dao động bình phương gốc (RMSF) và biến thiên khoảng cách liên kết hydro (ngưỡng D-A < 3,5 Å).
  • Phương pháp nhiệt động học: Tính toán năng lượng tự do liên kết điểm cuối theo mô hình cơ học phân tử kết hợp diện tích bề mặt Born khái quát hóa (MM/GBSA) trên công cụ MolAICal trong 40 ns mô phỏng cuối cùng.
• Nguồn dữ liệu và cấu trúc:
  • Dữ liệu hoạt tính thực nghiệm $IC_{50}$ (chuyển đổi thành $pIC_{50} = -\log IC_{50}$) gồm 100 chất ức chế Mpro và 91 chất ức chế PLpro thu thập từ các công bố khoa học.
  • Tọa độ tinh thể tia X của Mpro (mã PDB: 7LMD) và PLpro (mã PDB: 7LBR) từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB).
  • Thư viện 7,3 triệu phân tử sàng lọc ban đầu từ cơ sở dữ liệu ZINC.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về cấu trúc phân tử và quá trình dịch mã của SARS-CoV-2. Văn bản phân tích cơ chế sao chép khi hai phần ba bộ gen dịch mã thành polyprotein pp1a và pp1ab, từ đó hai cystein protease là Mpro và PLpro thực hiện 14 nhát cắt giải phóng 16 protein phi cấu trúc (nsp). Trình tự Mpro của SARS-CoV-2 tương đồng 96% với SARS-CoV và 50% với MERS-CoV; trong khi PLpro tương đồng 83% với SARS-CoV và 31% với MERS-CoV. Cấu trúc ba chiều và các acid amin xúc tác của cả hai enzyme đều bảo tồn tuyệt đối. Chu trình xúc tác 5 bước của Mpro và PLpro đều thông qua trung gian acyl hóa và thủy phân giải phóng peptide.

Chương này cũng tổng quan cơ sở vật lý của mô phỏng động lực học phân tử dựa trên phương trình định luật chuyển động Newton và trường lực (mô tả thế năng liên kết gồm kéo dãn liên kết, biến dạng góc, quay nhị diện và thế năng không liên kết gồm tĩnh điện Coulomb, van der Waals). Các phương pháp tính năng lượng tự do liên kết như MM/PB(GB)SA, năng lượng tương tác tuyến tính (LIE) và phương pháp chuyển đổi trạng thái giả kim (alchemical free energy) được phân tích rõ về ưu thế và hạn chế trong thiết kế thuốc.

Chương 2: Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình nghiên cứu đa tầng và hệ thống công cụ triển khai. Phần cứng sử dụng gồm máy tính cá nhân Asus X556UF (Windows 10) và máy chủ ảo Google. Các phần mềm chuyên dụng được áp dụng bao gồm: alvaDesc 2.0 (tính 4179 tham số phân tử 2D), QSARINS 2.2.4 (xây dựng và thẩm định mô hình QSAR), Open Babel (chuyển đổi cấu trúc), MOE 2009.10 (chuẩn bị protein, tối ưu hóa phối tử và docking), CHARMM-GUI (xây dựng hệ solvat hóa), NAMD 2.14 (chạy mô phỏng MD 100 ns), VMD (quan sát quỹ đạo), MolAICal (tính năng lượng tự do MM/GBSA) và PyMOL 2.2.

Tập dữ liệu được phân chia theo cấu trúc thành tập huấn luyện và tập kiểm tra theo tỷ lệ 80:20 đối với Mpro và 74:17 đối với PLpro. Quy trình sàng lọc triển khai qua 3 bước liên hoàn: (1) Sàng lọc 7,3 triệu chất ZINC qua mô hình 2D QSAR với tiêu chuẩn nằm trong miền ứng dụng và dự đoán $pIC_{50} \ge 6,2$; (2) Docking chéo các chất thực nghiệm và docking đồng thời 30 chất có dự đoán tốt nhất từ QSAR vào hai protease, chọn lọc bằng điểm số đánh giá chuẩn hóa; (3) Thẩm định độ bền cấu trúc và tính năng lượng tự do liên kết bằng mô phỏng MD và MM/GBSA cho các phức hợp có điểm số cao nhất.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả tính toán chi tiết và thảo luận sâu về cơ chế tương tác:

• Mô hình 2D QSAR: Mô hình MLR được lựa chọn cho Mpro gồm 7 tham số phân tử và PLpro gồm 7 tham số phân tử. Cả hai mô hình đều đạt độ tin cậy thống kê cao, không bị quá khớp, không tương quan ngẫu nhiên và có khả năng ngoại suy xuất sắc trên tập kiểm tra. Miền ứng dụng xác định ngưỡng đòn bẩy $h^* = 0,300$ cho Mpro và $h^* = 0,324$ cho PLpro; hầu hết các chất đều nằm trong miền an toàn.

Chỉ số thống kê	Mô hình Mpro	Mô hình PLpro
Số lượng quan sát ($n_{train} : n_{test}$)	80 : 20	74 : 17
Hệ số tương quan đa biến nội tại $K_{xx}$	0,3754	0,3674
Ngưỡng khác biệt $\delta K$	0,0505	0,0643
Hệ số xác định tập huấn luyện $R^2$	0,8944	0,9165
Hệ số xác định hiệu chỉnh $R^2_{adj}$	0,8841	0,9076
Kiểm chứng chéo nội bộ $Q^2_{LOO}$	0,8711	0,8965
Độ lệch ổn định ($R^2 - Q^2_{LOO}$)	0,0233	0,0200
Kiểm chứng lặp leave-many-out $Q^2_{LMO}$	0,8643	0,8901
Ngẫu nhiên hóa Y ($R^2_Y / Q^2_Y$)	0,0893 / -0,1290	0,0952 / -0,1440
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F1}$	0,7441	0,8039
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F2}$	0,7423	0,8039
Kiểm chứng ngoại $Q^2_{F3}$	0,7617	0,8518

• Kết quả Docking và sàng lọc: Thẩm định quy trình docking qua việc redock phối tử đồng kết tinh cho giá trị RMSD tái cấu trúc đạt 1,1642 Å đối với Mpro và 1,0732 Å đối với PLpro. Quá trình docking chéo và docking sàng lọc thư viện đã xác định được ba hợp chất tiềm năng nhất tác động đồng thời trên cả hai đích: hợp chất PL64, hợp chất M88 và hợp chất ZINC 1687828.

Hợp chất	Đích Mpro: Điểm Docking	Đích Mpro: $pIC_{50}$	Đích PLpro: Điểm Docking	Đích PLpro: $pIC_{50}$
Đối chứng Redock	-5,67	-	-7,14	-
PL64 (chất đã công bố)	-5,84	-	-	5,96 (thực nghiệm)
M88 (chất đã công bố)	-	7,44 (thực nghiệm)	-10,09	-
1687828 (từ ZINC)	-7,47	6,46 (dự đoán)	-7,06	6,25 (dự đoán)

• Kết quả mô phỏng động lực học phân tử (100 ns):
  • Giá trị RMSF của các acid amin trong túi liên kết của cả hai protease đều duy trì dưới mức dao động 2 Å, khẳng định khung protein giữ nguyên độ ổn định khi gắn phối tử.
  • Phân tích RMSD phối tử ở 40 ns cuối cho thấy các cấu trúc đều đạt trạng thái cân bằng bền vững trong trung tâm hoạt động: Mpro_PL64 đạt $2,82 \pm 0,48$ Å; Mpro_1687828 đạt $7,55 \pm 0,51$ Å; PLpro_M88 đạt $4,09 \pm 0,69$ Å; PLpro_1687828 đạt $5,17 \pm 1,08$ Å.
  • Khảo sát liên kết hydro (khoảng cách D-A < 3,5 Å): Mpro_PL64 duy trì liên tục hai liên kết hydro với Gly143 và Glu166, sau 60 ns xuất hiện thêm hai liên kết với His41 và Cys44. Phức hợp Mpro_1687828 hình thành hai liên kết hydro bền vững với Cys44 và một liên kết với Asp187 sau 40 ns đầu. Phức hợp PLpro_M88 được neo giữ bởi hai liên kết hydro với Tyr264 và Gln269. Phức hợp PLpro_1687828 duy trì hai liên kết hydro với Gly266.
  • Nhánh 2,6-difluorobenzyl của M88 và vòng imidazole của 1687828 nhô ra dung môi, dao động linh động khiến giá trị RMSD tổng thể tăng nhẹ nhưng phần khung làm lá chắn che lấp bộ đôi/bộ ba xúc tác vẫn liên kết rất chặt chẽ.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả định lượng cụ thể về năng lượng tự do liên kết MM/GBSA tính toán trong 40 ns cuối, cho thấy các phức hợp sàng lọc đều có ái lực gắn kết vượt trội so với phối tử đồng kết tinh chuẩn:

Phức hợp	Thành phần $\Delta E_{int}$	Thành phần $\Delta E_{ele} + \Delta G_{sol}$	Thành phần $\Delta E_{vdw} + \Delta G_{sol}$	Năng lượng liên kết $\Delta G_{bind}$ (kJ/mol)
Mpro_Đồng kết tinh	$-13,54 \times 10^{-4}$	37,18	-165,00	-127,83
Mpro_PL64	$-12,08 \times 10^{-4}$	29,51	-182,42	-152,91
Mpro_1687828	$1,83 \times 10^{-4}$	52,42	-150,29	-97,87
PLpro_Đồng kết tinh	$1,04 \times 10^{-4}$	62,64	-155,74	-93,10
PLpro_M88	$-8,32 \times 10^{-4}$	37,31	-145,18	-107,87
PLpro_1687828	$0,87 \times 10^{-4}$	51,21	-143,41	-92,21

Các đóng góp khoa học chính mà tác giả đã thực hiện:

• Xây dựng thành công quy trình sàng lọc ảo tích hợp ba cấp độ (2D QSAR -> Molecular Docking -> Mô phỏng MD kết hợp MM/GBSA), cho phép xử lý dữ liệu lớn lên tới 7,3 triệu hợp chất với độ chính xác và tính khả thi cao trên điều kiện máy tính thông thường.
• Phát hiện tiềm năng ức chế đa đích (dual-target): Chứng minh hai hợp chất đã biết hoạt tính đơn đích (M88 trên Mpro và PL64 trên PLpro) có khả năng ức chế chéo mạnh mẽ lên protease còn lại với điểm docking vượt trội phối tử đồng kết tinh; đồng thời tìm ra hợp chất mới 1687828 từ thư viện ZINC có ái lực gắn kết đồng thời trên cả Mpro và PLpro.
• Làm sáng tỏ ở độ phân giải nguyên tử cơ chế ức chế không cộng hóa trị dạng "lá chắn" che chắn trung tâm hoạt động, xác định mạng lưới liên kết hydro chủ chốt với các acid amin Cys44, Gly143, Glu166 (trên Mpro) và Gly266, Tyr264, Gln269 (trên PLpro).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Mô hình 2D QSAR bị ràng buộc trong miền ứng dụng (AD) xây dựng từ tập dữ liệu ban đầu, có thể bỏ sót các chất có hoạt tính nằm ngoài miền cấu trúc này; sai số dự đoán $pIC_{50}$ vẫn tồn tại do chỉ khai thác thông tin cấu trúc 2D phẳng mà chưa tính đến tương tác không gian 3D.
• Quá trình docking áp dụng cơ chế bán linh động (protein cố định, loại bỏ phân tử nước) để giảm tải tính toán nên chưa phản ánh hoàn toàn tương tác vi môi trường sinh học thực tế.
• Do hạn chế về thời gian và tài nguyên tính toán, mô phỏng MD 100 ns chỉ mới thực hiện được trên một số lượng rất nhỏ các hợp chất đứng đầu bảng xếp hạng, có nguy cơ bỏ qua các hợp chất tiềm năng khác. Toàn bộ kết quả dừng lại ở mức độ tính toán in silico, chưa có kiểm chứng sinh học thực nghiệm in vitro.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Ứng dụng các thuật toán học sâu (Deep Learning) và mạng nơ-ron nhân tạo để cải thiện độ chính xác và tính khái quát của mô hình QSAR, đồng thời mở rộng tập dữ liệu đầu vào.
• Tăng số lượng phức hợp được đánh giá qua mô phỏng động lực học phân tử để mở rộng tệp dẫn chất có hoạt tính.
• Dựa trên phân tích các vị trí cấu trúc linh động (như nhánh 2,6-difluorobenzyl của M88 và vòng imidazole của 1687828), đề xuất hướng biến đổi và tối ưu hóa cấu trúc hóa học nhằm gia tăng số lượng liên kết định vị trong túi gắn kết, nâng cao độ bền vững và hoạt tính sinh học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Dược học, Hóa dược, Tin sinh học và Công nghệ sinh học định hướng thiết kế thuốc. Các nội dung có giá trị ứng dụng cao gồm:

• Quy trình chuẩn hóa dữ liệu tham số phân tử bằng alvaDesc và phương pháp kiểm chứng toàn diện mô hình QSAR (LOO, LMO 2000 chu kỳ, Y-randomization, biểu đồ Williams) trình bày tại Chương 2 và Chương 3.
• Giao thức thiết lập mô phỏng động lực học phân tử trên NAMD sử dụng CHARMM-GUI và phương pháp tính năng lượng tự do MM/GBSA bằng MolAICal, có thể áp dụng trực tiếp cho các nghiên cứu sàng lọc thụ thể protein khác.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn nhắm vào cả hai enzyme Mpro và PLpro thay vì chỉ một protease đơn lẻ? Mpro và PLpro là hai cysteine protease thiết yếu chịu trách nhiệm phân cắt toàn bộ 14 vị trí trên polyprotein pp1a và pp1ab để giải phóng các protein phi cấu trúc giúp virus sao chép. Đồng thời, các acid amin xúc tác của cả hai enzyme này được bảo tồn tuyệt đối giữa các biến thể SARS-CoV-2 và giữa các chủng coronavirus người (SARS-CoV, MERS-CoV). Việc phát hiện chất ức chế đồng thời cả hai enzyme giúp tăng cường hiệu quả kháng virus và giảm thiểu nguy cơ phát sinh đột biến kháng thuốc.

2. Tiêu chí lựa chọn các hợp chất từ thư viện ZINC sau bước sàng lọc 2D QSAR là gì? Hợp chất được chọn phải thỏa mãn đồng thời hai điều kiện khắt khe: (1) Cấu trúc phân tử phải nằm hoàn toàn trong miền ứng dụng (AD) của mô hình (giá trị đòn bẩy $h_i < h^$, với $h^$ của Mpro là 0,300 và PLpro là 0,324) để đảm bảo độ tin cậy dự đoán; (2) Hoạt tính ức chế dự đoán $pIC_{50}$ trên cả hai mô hình Mpro và PLpro phải đồng thời đạt giá trị $\ge 6,2$.

3. Hợp chất 1687828 thể hiện đặc tính liên kết và năng lượng tự do như thế nào trong mô phỏng MD? Trong 40 ns mô phỏng cuối, phức hợp Mpro_1687828 đạt trạng thái ổn định với RMSD $7,55 \pm 0,51$ Å, tạo hai liên kết hydro với Cys44 và một liên kết với Asp187, đạt năng lượng tự do liên kết MM/GBSA là -97,87 kJ/mol. Trên đích PLpro, phức hợp đạt RMSD $5,17 \pm 1,08$ Å, duy trì hai liên kết hydro với Gly266 và đạt năng lượng tự do liên kết là -92,21 kJ/mol (tương đương phối tử đồng kết tinh -93,10 kJ/mol). Mặc dù vòng imidazole dao động tự do ngoài dung môi làm tăng nhẹ biên độ RMSD, phần khung chính vẫn liên kết chặt chẽ che lấp bộ ba xúc tác.

4. Dữ liệu thực nghiệm của hai hợp chất M88 và PL64 trước khi thực hiện docking chéo là gì? Hợp chất M88 ban đầu được công bố là chất ức chế Mpro với hoạt tính thực nghiệm $pIC_{50} = 7,44$. Hợp chất PL64 được công bố là chất ức chế PLpro với $pIC_{50} = 5,96$. Khi docking chéo, PL64 cho điểm docking trên Mpro là -5,84 (tốt hơn redock -5,67); M88 cho điểm docking trên PLpro là -10,09 (tốt hơn redock -7,14), chứng minh tiềm năng ức chế kép.

5. Vì sao thành phần entropy bị bỏ qua trong tính toán năng lượng liên kết MM/GBSA của khóa luận? Trong phương pháp MM/GBSA, việc tính toán thành phần biến thiên entropy ($-T\Delta S$) đòi hỏi phân tích dao động chuẩn (normal mode analysis) tiêu tốn rất nhiều tài nguyên tính toán và thời gian của hệ thống máy tính, trong khi các đại lượng phân tử sinh học có dao động lớn thường đưa vào sai số mà không làm thay đổi đáng kể thứ hạng năng lượng tương đối giữa các phối tử. Do đó, việc bỏ qua entropy là quy ước tiêu chuẩn để tối ưu hóa hiệu quả tính toán.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Đăng Huy đã xây dựng thành công quy trình sàng lọc ảo tích hợp ba bước (2D QSAR, docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử NAMD kết hợp MM/GBSA) trên thư viện 7,3 triệu hợp chất. Nghiên cứu đã phát hiện ba phân tử tiềm năng có khả năng ức chế đồng thời Mpro và PLpro của SARS-CoV-2 gồm PL64, M88 và ZINC 1687828 với năng lượng liên kết thuận lợi và mạng lưới tương tác ổn định tại trung tâm xúc tác. Đây là cơ sở khoa học in silico có giá trị định hướng cho các nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc và thử nghiệm sinh học tiếp theo nhằm phát triển thuốc kháng coronavirus phổ rộng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN 1. Tổng quan về protease của SARS-CoV-2 1. Cấu trúc và bước đầu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng, biểu hiện trên lâm sàng bao gồm sốt, ho khan và mệt mỏi và thường có liên quan đến phổi. SARS-CoV-2 dễ lây lan, có vật chủ là động vật hoang dã hoặc người [51].

Có bốn phân nhóm chính của coronavirus là a, p, Ỵ và ô, trong đó SARS-CoV-2 là một loại p coronavirus [69]. Nhìn chung cấu trúc của SARS-CoV-2 mang đặc trưng của các chủng coronavirus, chứa sợi đơn ARN dương tính với đầu 5’ và đuôi 3’ poly-A, mã hóa bổn protein cấu trúc chính (S: gai; E: vỏ; M: màng; N: nucleocapsid) và nhiều protein phi cấu trúc (nsp). Hạt virion coronavirus thường có hình tròn hoặc nhiều hình dạng, có đường kính 120-160 nm. Protein s làm trung gian cho sự gắn kết của virus và hợp nhất màng trong quá trình lây nhiễm.

Protein M có 218-263 acid amin, có đầu tận cùng N được biến đối bởi một O- hoặc N-glycan và một đầu tận cùng c ưa nước. Protein E, 74- 109 acid amin, có thể tham gia vào việc thúc đấy độc lực của virus; thường có khoảng 20 bản sao của protein này trên môi virion. Protein N của coronavirus, 349-470 acid amin, là một protein được phosphoryl hóa liên kết với ARN, tạo điều kiện thuận lợi cho việc gấp bộ gen ARN vào nucleocapsid một cách thích họp [29]. Chu kỳ xâm nhập và sao chép tế bào bắt đầu khi virus xâm nhập vào tế bào chủ, dẫn đến sự dung hợp màng tế bào - virus.

Sau quá trình nhập bào và thoát vở, hai phần ba bộ gen tính từ đầu 5 ’ bao gồm hai khung đọc mở (ORF 1 a và ORF 1 b) được dịch mã thành hai polyprotein (ppla và pplab) thông qua cơ chế chuyển dịch khung ribosome. Hai polyprotein được phân cắt để tạo ra 16 protein phi cấu trúc, trong đó bao gồm hai cystein protease là Mpro (main protease hay 3-chymotrypsin-like protease, được mã hóa bởi nsp5) và PLpro (papain-like protease, được mã hóa trong nsp3) [22]. Những protease này là yếu tố chính cho sự phân cắt protein, đóng vai trò quan trọng trong vòng đời của virus. Bên cạnh việc phân cắt các cơ chất của virus, chúng cũng có thế sửa đối hoặc vô hiệu hóa hoạt động của các protein tế bào, do đó làm tăng khả năng tương thích đối với virus [36].

Bước đầu quá trình dịch mã được thể hiện ở Hình 1. nsp3 nspll Ệ Ệ Ệ Ệ nsp3 Ribosomal frameshift Ậ PL proteinase 3CL protease Hình 1. Bộ gen và bước đâu quá trình dịch mã của virus SARS-CoV-2 2 1. Protease của virus SARS-CoV-2 1.

Sự tương đồng giữa các chủng coronavirus Tương tự như những phát hiện liên quan đến SARS-CoV [13] và coronavirus gây hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoV) [67], SARS-CoV-2 được cho là lai giữa các loài để khởi phát các bệnh nhiễm trùng sơ cấp ở người; hiện nay nó lây lan chú yếu qua đường lây truyền từ người sang người. Trình tự bộ gen của SARS-CoV-2 có sự đồng nhất đến 80% với SARS-CoV và 50% với MERS-CoV [33]. Mặc dù giữa các chủng có những đột biến khác nhau, các protein quan trọng của các coronavirus được bảo tồn rất cao vì hầu hết các đột biến trong các protein này đều gây chết virus, trong đó có Mpro và PLpro [68]. A al pi P2 P3 ni n2 MproISARS-CoV-2 ----- » TT 2_p_p_p.