Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Viêm giác mạc do virus Herpes simplex (HSV) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa do nhiễm trùng trên toàn cầu, với ước tính hơn 1,8 triệu ca mắc mới mỗi năm, trong đó chủng Herpes simplex týp 1 (HSV-1) chiếm tỷ lệ chủ yếu. Phác đồ điều trị phổ biến hiện nay sử dụng acyclovir gặp nhiều hạn chế do thuốc không tác động lên virus ở thể tiềm ẩn, dẫn đến nguy cơ tái phát cao, đồng thời đã ghi nhận sự xuất hiện của các biến chủng HSV-1 kháng acyclovir.

Mangiferin (C19H18O11) là một C-glucosylxanthon tự nhiên, chiết xuất chủ yếu từ lá cây xoài (Mangifera indica L., họ Anacardiaceae). Hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng HSV-1 và HSV-2 thông qua cơ chế làm thay đổi cấu trúc protein vỏ virus, ngăn chặn sự xâm nhập của virus vào tế bào chủ ngay từ giai đoạn đầu. Cơ chế này giúp mangiferin có hiệu lực ức chế tốt trên cả chủng HSV-1 AR-29 đã kháng acyclovir (với nồng độ ức chế $IC_{50} = 2,9\ \mu\text{g/ml}$ và chỉ số chọn lọc $> 172,4$). Tuy nhiên, mangiferin thuộc nhóm IV theo hệ thống phân loại sinh dược học (BCS), có độ tan trong nước rất kém và khó thấm qua màng sinh học. Khi dùng tại mắt, các cơ chế bảo vệ sinh lý như chớp mắt và tiết nước mắt làm thuốc bị rửa trôi nhanh chóng, khiến sinh khả dụng tại nhãn cầu thường dưới 5%. Các nghiên cứu bào chế nhỏ mắt trước đây đối với mangiferin gặp trở ngại về độ ổn định hóa học (dễ bị oxy hóa) hoặc gây kích ứng niêm mạc mắt thỏ khi bào chế bằng phương pháp phân tán cơ học thông thường.

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Lương Thị Thu Hà (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2022) thực hiện đề tài "Nghiên cứu bào chế hỗn dịch mangiferin định hướng nhỏ mắt" nhằm giải quyết các thách thức trên, với 2 nhiệm vụ cụ thể:

  1. Xây dựng được công thức và thông số quy trình nghiền làm nhỏ kích thước nguyên liệu mangiferin bằng phương pháp nghiền bi có khuấy.
  2. Bước đầu bào chế và đánh giá được một số đặc tính của hỗn dịch mangiferin định hướng dùng để nhỏ mắt.
  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất mangiferin (độ tinh khiết 97,8%, tiêu chuẩn DĐVN V) cùng các tá dược polyme (HPMC E6, PVP K30, HPC L, PVA 250, Carbopol 974P), chất diện hoạt (Tween 80, Span 80, Tween 60, Cremophor EL) và các tá dược điều chỉnh áp suất thẩm thấu, pH, chống oxy hóa.
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Vật lý – Hóa lý, Trường Đại học Dược Hà Nội; hoàn thành vào tháng 6 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên các nguyên lý sinh dược học và công nghệ bào chế hệ phân tán dị thể dùng cho nhãn khoa:

  • Tiêu chuẩn nhãn khoa: Áp dụng Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) về giới hạn kích thước tiểu phân (KTTP) trong thuốc nhỏ mắt hỗn dịch: trong lượng chế phẩm tương đương $10\ \mu\text{g}$ pha rắn không được có quá 20 tiểu phân $> 25\ \mu\text{m}$, không quá 2 tiểu phân $> 50\ \mu\text{m}$ và không có tiểu phân $> 90\ \mu\text{m}$.
  • Lý thuyết nghiền bi có khuấy (Wet Stirred Media Milling): Phân rã tiểu phân thô theo cơ chế "top-down" thông qua ứng suất cơ học sinh ra từ va chạm và ma sát của bi nghiền. Quá trình động học chịu sự cạnh tranh giữa cơ chế nghiền vỡ do năng lượng va chạm và cơ chế tái kết tập tiểu phân do năng lượng bề mặt cao.
  • Cơ chế ổn định hệ phân tán: Sử dụng polyme (ổn định không gian) và chất diện hoạt (ổn định tĩnh điện/lực cản không gian) để ngăn chặn hiện tượng kết tụ và hiện tượng lão hóa Ostwald.
Phương pháp nghiên cứu Thiết bị / Kỹ thuật chính Thông số và điều kiện áp dụng
Bào chế làm nhỏ KTTP Thiết bị mô phỏng nghiền bi có khuấy Lọ thủy tinh 20 ml, 20 g bi zirconia ($d = 0,1 - 1,0\text{ mm}$), máy khuấy từ Heidolph MR 1000.
Thiết kế thí nghiệm Mô hình Fractional Factorial Resolution IV Phần mềm MODDE 8 sàng lọc 6 biến đầu vào (nồng độ MF, nồng độ polyme, nồng độ CDH, bán kính bi, tốc độ khuấy, thời gian nghiền) với 20 thí nghiệm.
Đo kích thước tiểu phân Tán xạ laser (Mastersizer 3000E, Malvern) Áp dụng định luật tán xạ Mie (chỉ số khúc xạ MF = 1,64; tỷ trọng = 1,843 g/cm³); đo nền trừ placebo; soi kính hiển vi Nikon.
Định lượng hoạt chất Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC Agilent 1200) Cột C18 ($4,6 \times 150\text{ mm}, 5\ \mu\text{m}$), $40^\circ\text{C}$, detector UV 258 nm, pha động Acetonitril : dd acid acetic 3% (15:85 v/v), dòng 1,1 ml/phút.
Đánh giá dạng thù hình DSC (Mettler Toledo) & XRD (D8 Advance Bruker) Quét DSC từ $25 - 350^\circ\text{C}$ ($10\text{ K/phút}$); Quét XRD góc $2\theta$ từ $5^\circ - 60^\circ$ (tốc độ $0,020^\circ/\text{giây}$).
Đánh giá giải phóng in vitro Khuếch tán kiểu Franz & Thiết bị khuấy từ Đệm phosphat đẳng trương pH 7,4, nhiệt độ $34^\circ\text{C}$ (Franz) hoặc nhiệt độ phòng (khuấy từ), định lượng HPLC.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về:

  • Cấu trúc hóa học của mangiferin (2-C-$\beta$-D-glucopyranosido-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon, $M = 422,2\text{ g/mol}$, $\text{pKa}_1 = 6,52$, nhiệt độ nóng chảy $271^\circ\text{C}$), đặc tính dược động học không ngăn phi tuyến tính, cùng các bằng chứng dược lý về khả năng ức chế HSV-1, HSV-2 và tính an toàn tế bào.
  • Yêu cầu chất lượng của thuốc nhỏ mắt hỗn dịch, các yếu tố ảnh hưởng của KTTP đến độ kích ứng giác mạc, thời gian lưu và diện tích dưới đường cong (AUC) trong thủy dịch.
  • Nguyên lý kỹ thuật nghiền bi có khuấy ướt, phương trình năng lượng va chạm $E_w$, cũng như vai trò của các nhóm tá dược ổn định polyme và chất diện hoạt không ion hóa.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết:

  • Danh mục hóa chất, dung môi, thiết bị chuyên dụng và hệ thống mô phỏng buồng nghiền sử dụng lực khuấy từ.
  • Quy trình sàng lọc các biến công thức (loại polyme: HPMC E6, PVP K30, HPC L, PVA 250; loại CDH: Tween 80, hỗn hợp Tween 80/Span 80 HLB 11, Tween 60, Cremophor EL) và biến quy trình (bán kính bi 0,1 - 1,0 mm; tốc độ khuấy mức 6 - 8; thời gian 2 - 6 giờ).
  • Ma trận thiết kế thí nghiệm sàng lọc trên phần mềm MODDE 8 gồm 20 công thức thực nghiệm (4 công thức lặp tại tâm) nhằm xác định tác động lên kích thước trung bình $D[4,3]$ và độ phân tán SPAN.
  • Quy trình phân tích HPLC, khảo sát độ tan, độ ổn định hóa học của mangiferin trong dung dịch theo pH, nhiệt độ, ánh sáng, chất chống oxy hóa và hệ đệm.
  • Phương pháp đánh giá dạng thù hình bằng DSC, XRD và hai phương pháp thử giải phóng in vitro (tế bào Franz và khuấy từ).

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  • Xây dựng đường chuẩn HPLC định lượng mangiferin tuyến tính cao trong khoảng nồng độ $0,15 - 40\ \mu\text{g/ml}$ ($y = 32,2191x + 0,6041; R^2 = 1,000$).
  • Đặc tính nguyên liệu: Mangiferin thô có $D[4,3] \approx 40\ \mu\text{m}$, $\text{SPAN} = 5,083$, cấu trúc tinh thể que/kim (DSC xuất hiện đỉnh thu nhiệt nhọn tại $284,79^\circ\text{C}$). Hoạt chất bền ở môi trường acid (pH 4 - 6), kém bền ở $70^\circ\text{C}$, môi trường kiềm và ánh sáng; độ ổn định tăng lên khi có mặt $\text{Na}_2\text{EDTA}$ hoặc $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ trong đệm phosphat.
  • Sàng lọc tá dược nghiền: HPMC E6 và hỗn hợp Tween 80/Span 80 (HLB 11) cho hiệu quả làm giảm KTTP tốt và hệ phân tán ổn định; mẫu dùng PVP K30 bị biến màu (xuất hiện tạp nâu đen sau 1 tháng).
  • Tối ưu hóa quá trình nghiền (MODDE 8): Nồng độ mangiferin và CDH ảnh hưởng không đáng kể đến KTTP. Mô hình hồi quy chỉ ra $D[4,3]$ giảm khi tăng bán kính bi, tốc độ khuấy và thời gian nghiền, nhưng tăng khi tăng nồng độ polyme do độ nhớt cản trở bi chuyển động.
  • Biến đổi dạng thù hình: Quá trình nghiền ở mức năng lượng cao làm chuyển đổi mạng tinh thể của mangiferin. Mẫu CT 10 ($D[4,3] = 0,522\ \mu\text{m}$) có đỉnh nóng chảy DSC dịch chuyển về $262,04^\circ\text{C}$ và xuất hiện các đỉnh nhiễu xạ XRD mới ($2\theta = 16,1^\circ; 16,36^\circ; 17,12^\circ; 25,1^\circ; 27,28^\circ$).
  • Bào chế hỗn dịch nhỏ mắt 2%: Phối hợp dịch nghiền với nền tá dược gồm Carbopol 974P 0,4%, NaCl 0,1%, Manitol 3,6%, $\text{Na}_2\text{EDTA}$ 0,01% và đệm phosphat pH 6,0. Kết quả ghi nhận hiện tượng các hạt nano mangiferin trong công thức CT 10 tương tác với Carbopol 974P tạo thành các đám kết tụ kích thước khoảng $93\ \mu\text{m}$, dẫn đến tốc độ giải phóng hoạt chất chậm hơn so với công thức hạt micromet CT 1.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và đặc tính chế phẩm

Nghiên cứu đã hoàn thiện công thức hỗn dịch nhỏ mắt mangiferin 2% với thông số lý hóa được kiểm soát:

  • Công thức nền tối ưu: Mangiferin 2%, Carbopol 974P 0,4%, Tween 80 + Span 80 (HLB 11) 0,1%, NaCl 0,1%, $\text{NaH}_2\text{PO}_4$ 0,06%, $\text{Na}_2\text{EDTA}$ 0,01%, Manitol 3,6% (đẳng trương $290 - 310\text{ mOsmol/kg}$), pH điều chỉnh đạt $5,9 - 6,0$.
  • Đặc tính 3 mẫu hỗn dịch thử nghiệm:
Chỉ tiêu đánh giá HD CT 1 (Năng lượng thấp) HD CT 11 (Năng lượng trung bình) HD CT 10 (Năng lượng cao)
KTTP dịch nghiền $D[4,3]$ $10,667\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 3,512$) $3,123\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 3,465$) $0,522\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 0,956$)
KTTP hỗn dịch 2% $D[4,3]$ $7,467\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 2,157$) $3,270\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 3,030$) $93,033\ \mu\text{m}$ ($\text{SPAN} = 0,970$)
pH chế phẩm 5,93 5,98 5,91
Giải phóng (khuấy từ) Giải phóng 100% sau 7 phút 2 giai đoạn: 50% sau 9 phút, 100% sau 60 phút Giải phóng 30% sau 15 phút, 100% sau 180 phút
Giải phóng (tế bào Franz) Đạt ~54% sau 6 giờ Đạt ~40% sau 6 giờ Đạt ~34% sau 6 giờ

Đóng góp khoa học và thực tiễn

  • Thiết lập thành công mô hình thực nghiệm nghiền bi có khuấy quy mô phòng thí nghiệm, chứng minh khả năng đưa kích thước tiểu phân mangiferin từ dạng thô ($40\ \mu\text{m}$) xuống kích thước sub-micron/nano ($0,522\ \mu\text{m}$).
  • Ứng dụng công cụ thiết kế sàng lọc thống kê (Screening Design Resolution IV - MODDE 8) làm rõ mối tương quan giữa nồng độ polyme, bán kính bi, tốc độ khuấy và thời gian nghiền đối với phân bố KTTP.
  • Phát hiện và làm sáng tỏ hiện tượng chuyển đổi cấu trúc mạng tinh thể của mangiferin dưới tác động của năng lượng cơ học nghiền bi thông qua phân tích nhiệt vi sai (DSC) và nhiễu xạ tia X (XRD).
  • Phát hiện hiện tượng tương tác liên kết làm kết tụ hạt nano mangiferin khi phối hợp vào chất tăng độ nhớt Carbopol 974P, giải thích cơ chế giải phóng hoạt chất chậm lại ở hệ phân tán nano kết tụ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã thẳng thắn ghi nhận các hạn chế thực nghiệm:

  • Tương tác kết tụ nano: Tiểu phân mangiferin kích thước nanomet ($< 1\ \mu\text{m}$) bị kết tụ khi phối hợp vào gel Carbopol 974P tạo thành cụm tiểu phân kích thước lớn ($~93\ \mu\text{m}$), gây mất ưu thế phân tán ban đầu của hệ nano.
  • Độ ổn định dài hạn: Mới dừng lại ở bước khảo sát độ ổn định ngắn hạn (10 ngày đối với phân bố KTTP hỗn dịch hoàn chỉnh và 1 tháng đối với dịch nghiền ở điều kiện phòng).
  • Thử nghiệm in vivo và tiệt khuẩn: Chưa tiến hành quy trình tiệt trùng vô khuẩn (nhiệt ẩm hoặc lọc) và chưa đánh giá độ kích ứng nhãn khoa cũng như sinh khả dụng trên mắt thỏ thực nghiệm đối với công thức hỗn dịch hoàn chỉnh.

Hướng nghiên cứu phát triển tiếp theo:

  • Khảo sát các chất làm tăng độ nhớt hoặc chất ổn định polyme khác thay thế Carbopol 974P để ngăn chặn hiện tượng kết tụ của các tiểu phân nano mangiferin.
  • Xây dựng và thẩm định quy trình tiệt trùng vô khuẩn phù hợp cho hỗn dịch nhỏ mắt mangiferin.
  • Tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng đánh giá mức độ kích ứng mắt in vivo trên thỏ theo hướng dẫn OECD 405 và thử nghiệm sinh khả dụng tại nhãn cầu.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên môn giá trị cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Dược: Cung cấp quy trình bài bản từ khảo sát tiền công thức, thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa (DoE) bằng phần mềm MODDE 8 đến đánh giá đặc tính lý hóa của hệ phân tán dị thể.
  • Nghiên cứu viên lĩnh vực Bào chế - Công nghệ Dược phẩm: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về kỹ thuật nghiền bi ướt (wet milling), các biến đổi thù hình của hoạt chất tự nhiên dưới tác động cơ học, và bài học thực tiễn về hiện tượng tương tác bất lợi giữa tiểu phân nano với polyme tạo độ nhớt trong nhãn khoa.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao HPMC E6 được chọn làm polyme cho công thức nghiền thay vì PVP K30?

Mặc dù PVP K30 tạo ra hỗn dịch sau nghiền có kích thước tiểu phân nhỏ ($D[4,3] = 0,346\ \mu\text{m}$) và phân bố hẹp ($\text{SPAN} = 0,694$), mẫu sử dụng PVP K30 bị xuất hiện tạp chất màu nâu đen sau 1 tháng bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm. HPMC E6 cho kích thước tiểu phân tương đương ($D[4,3] = 0,384\ \mu\text{m}; \text{SPAN} = 0,690$) nhưng đảm bảo độ ổn định cảm quan, không bị đổi màu sau bảo quản nên được chọn.

2. Kỹ thuật nghiền bi có khuấy làm thay đổi dạng thù hình của mangiferin như thế nào?

Dưới tác động cơ học của bi nghiền, mạng tinh thể của mangiferin bị biến đổi tùy thuộc vào mức năng lượng. Khi nghiền ở năng lượng cao (công thức CT 10), đỉnh nóng chảy sắc nhọn của nguyên liệu tại $284,79^\circ\text{C}$ trên giản đồ DSC biến mất hoàn toàn và thay thế bằng đỉnh mới tại $262,04^\circ\text{C}$. Trên phổ XRD của CT 10 xuất hiện thêm các đỉnh nhiễu xạ mới tại góc $2\theta = 16,1^\circ; 16,36^\circ; 17,12^\circ; 25,1^\circ; 27,28^\circ$, chứng minh mangiferin đã chuyển sang một dạng tinh thể mới.

3. Vì sao hỗn dịch nano mangiferin (HD CT 10) lại giải phóng dược chất chậm hơn hỗn dịch hạt micromet (HD CT 1)?

Khi phối hợp vào nền tá dược Carbopol 974P 0,4%, các tiểu phân nano mangiferin ($0,522\ \mu\text{m}$) bị bám dính vào các phân tử polyme và kết tụ thành các đám lớn có kích thước khoảng $93\ \mu\text{m}$. Trong thử nghiệm giải phóng kiểu khuấy từ, các đám kết tụ này bám trên màng giữ mẫu và cần thời gian phân rã trước khi hòa tan, khiến tốc độ giải phóng kéo dài (180 phút mới đạt 100%), trong khi các tiểu phân micromet tự do trong HD CT 1 hòa tan hoàn toàn chỉ sau 7 phút.

4. Vai trò của NaCl trong công thức hỗn dịch nhỏ mắt chứa Carbopol 974P 0,4% là gì?

NaCl có tác dụng điều chỉnh độ nhớt và thể chất của dung dịch polyme Carbopol 974P. Khảo sát thực nghiệm cho thấy nồng độ NaCl 0,10% giúp dung dịch đạt độ lỏng thích hợp nhất, cho độ chênh lệch khối lượng giữa các giọt nhỏ giọt qua pipet là nhỏ nhất ($\Delta = 5,19%$, so với $\Delta = 29,56%$ khi không có NaCl), đảm bảo tính chính xác và đồng đều khi phân liều nhỏ mắt.

5. Yếu tố nào trong quy trình nghiền bi ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến kích thước tiểu phân trung bình $D[4,3]$?

Phân tích hồi quy từ phần mềm MODDE 8 ($R^2 = 0,885; Q^2 = 0,625; p < 0,05$) xác định có 4 biến độc lập ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến $D[4,3]$: nồng độ polyme HPMC E6 (ảnh hưởng thuận, làm tăng $D[4,3]$ do tăng độ nhớt), bán kính bi, tốc độ khuấy và thời gian nghiền (3 yếu tố này ảnh hưởng nghịch, làm giảm $D[4,3]$ do làm tăng tần suất và năng lượng va chạm phá vỡ tiểu phân).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lương Thị Thu Hà đã hoàn thành mục tiêu xây dựng công thức và quy trình nghiền bi có khuấy làm giảm kích thước tiểu phân mangiferin đạt yêu cầu dùng cho nhãn khoa ($D_{90} \le 25\ \mu\text{m}$). Công trình đã làm sáng tỏ ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến phân bố kích thước hạt, sự biến đổi dạng thù hình tinh thể của hoạt chất và bước đầu bào chế thành công hỗn dịch mangiferin nhỏ mắt 2% đẳng trương, pH ổn định ở mức 5,9 - 6,0. Kết quả nghiên cứu là tiền đề thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa hoạt chất tự nhiên điều trị viêm giác mạc do virus Herpes simplex.