Đặt vấn đề Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học là một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột.
Tác dụng của chế phẩm sinh học là làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính [11]. Protease là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi trong chế phẩm sinh học. Người ta có thể thu enzyme protease từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên thu enzyme từ cơ thể động vật hay thực vật thì rất khó khăn và tốn kém vì thường phải phá bỏ tổ chức để thu enzyme và quá trình bảo quản rất phức tạp.
Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzyme có hoạt tính cao. Chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzyme từ các nguồn nguyên liệu khác nhau [12]. Vì vậy vi sinh vật là nguồn thu enzyme rất tiềm năng. Trong các nguồn thu protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis vì loài vi khuẩn này rất phổ biến dễ phân lập, thu enzyme và enzyme thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn [7].
n 2 Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Phân lập tuyển chọn các chủng của Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi”. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn được các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease làm cơ sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học Phân lập được loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn được chủng có khả năng sinh protease. Biết và hiểu rõ hơn về các thoa tác kĩ thuật cũng như các thông số quy trình công nghệ trong quá trình thực hiện đề tài.
- Ý nghĩa thực tiễn + Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu càng cao của ngành chăn nuôi. n 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 2. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức.
Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm [9].
Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis - Đặc điểm phân loại: Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19]. Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2. Vi khuẩn Bacillus subtilis http://www.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/ n 4 - Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g.
Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis [19]. Đặc điểm hình thái - Đặc điểm hình thái tế bào Bacillus subtilis là trực khuẩn, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm.
Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ [1]. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Trên môi trường thạch đĩa MPA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường thạch nghiêng MPA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Trên môi trường gelatin: khuẩn lạc phát triển và làm tan chảy gelatin. Trên thạch khoai tây: khuẩn lạc phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. Trên môi trường canh MPA: khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều. Đặc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Chúng phát triển tốt trên môi trường MPA với nhiệt độ tối ưu là 37 oC, pH = 7,0 - 7,4 [19]. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)[9] 2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.
Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất.
Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi n 6 chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm. Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý [1]. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) [1].
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore).
Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra.
Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử [1]. Giới thiệu về enzyme protease 2. Tổng quan về enzyme Protease Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc ditripepton.
Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…). So với protease động vật và thực vật protease vi sinh vật có những đặc điểm rất khác biệt.
Trước hết hệ enzyme protease của vi sinh vật là 1 hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối n 7 lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng đồng nhất. Cũng do đó nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu cao, cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng [2].2 Phân loại và đặc điểm của protease Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH của phân tử protein và peptid thành các axit amin tự do và một ít peptid khối lượng phân tử nhỏ [12]. Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Hiện nay có nhiều cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì.1 Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này được chia thành 4 phân nhóm phụ - Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ của mạch polypeptid.
- Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của mạch polypeptid. - Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid. - Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.2 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2004)[12], protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhất có vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme. - Protease serine (EC 3.