Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch formalin đệm trung tính 10 lên sự biểu hiện của các dấu ấn trong kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch formalin đệm trung tính 10 đến sự biểu hiện dấu ấn trong nhuộm hóa mô miễn dịch.

• Tác giả: Phạm Gia Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Thị Phương Thảo
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học
• Đề tài: Khảo Sát Sự Ảnh Hưởng Của Thời Gian Cố Định Bằng Dung Dịch Formalin Đến Kỹ Thuật Nhuộm Hóa Mô Miễn Dịch
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tổng quan hóa mô miễn dịch
• 1.2. Quy trình kỹ thuật giải phẫu bệnh và hóa mô miễn dịch
• 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch
• 1.4. Ảnh hưởng của formalin trong kỹ thuật hóa mô miễn dịch
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Cỡ mẫu của nghiên cứu
• 2.5. Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc
• 2.6. Quy trình nghiên cứu
• 2.7. Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu
• 2.8. Phương pháp phân tích số liệu
• 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nhóm các dấu ấn biểu hiện trên màng tế bào
• 3.2. Nhóm các dấu ấn biểu hiện trong bào tương tế bào
• 3.3. Nhóm các dấu ấn biểu hiện trong nhân tế bào
• 3.4. Phân tích kết quả đánh giá biểu hiện của từng dấu ấn
• 3.5. Những điểm mạnh và hạn chế của nghiên cứu
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: PHIẾU THU THẬP KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Ảnh Hưởng Thời Gian Cố Định Đến IHC 55 Ký Tự

Trong chẩn đoán giải phẫu bệnh, kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) đóng vai trò quan trọng khi hình ảnh HE không điển hình. IHC giúp xác định nguồn gốc khối u, định hướng chẩn đoán, phân loại, tiên lượng bệnh và định hướng điều trị. Tuy nhiên, sai sót trong quá trình xử lý mẫu, đúc khối, cắt mỏng có thể ảnh hưởng đến kết quả. Việc sử dụng mẫu mô lưu trữ lâu ngày trong formalin có thể dẫn đến sai lệch do kháng nguyên bị che phủ. Thời gian cố định mẫu bệnh phẩm ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của IHC. Nghiên cứu này tập trung khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch Formalin đến kết quả IHC, nhằm cung cấp thông tin hữu ích cho bác sĩ giải phẫu bệnh, giảm thiểu sai sót và chi phí chẩn đoán.

1.1. Vai trò của nhuộm hóa mô miễn dịch IHC trong chẩn đoán

Nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) là kỹ thuật quan trọng hỗ trợ chẩn đoán giải phẫu bệnh, đặc biệt khi hình ảnh HE không rõ ràng. IHC giúp xác định bản chất của tế bào, phân loại khối u và cung cấp thông tin tiên lượng. Kỹ thuật này dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, cho phép bác sĩ quan sát sự biểu hiện của protein cụ thể trong mô. Tuy nhiên, chất lượng mẫu và quy trình thực hiện ảnh hưởng lớn đến độ tin cậy của kết quả IHC. Theo một nghiên cứu, việc cố định mẫu không đúng cách có thể dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính yếu.

1.2. Ảnh hưởng của Formalin đến kháng nguyên và kết quả IHC

Formalin là chất cố định mô phổ biến, nhưng có thể gây ảnh hưởng đến kháng nguyên. Formalin tạo liên kết chéo, che phủ vị trí nhận diện kháng nguyên, làm giảm khả năng gắn kết của kháng thể. Thời gian cố định quá dài hoặc quá ngắn đều có thể ảnh hưởng đến kết quả IHC. Do đó, việc kiểm soát thời gian cố định là rất quan trọng để đảm bảo độ tin cậy của kết quả IHC. Nghiên cứu của Đại học Y Dược TP.HCM chỉ ra rằng, thời gian cố định tối ưu là từ 6 đến 72 giờ.

II. Vấn Đề Thời Gian Cố Định Ảnh Hưởng IHC Như Thế Nào 58 Ký Tự

Mặc dù có hướng dẫn về thời gian cố định mẫu bệnh phẩm (6-72 giờ), nghiên cứu về ảnh hưởng của việc kéo dài thời gian cố định còn hạn chế. Kết quả các nghiên cứu khác nhau do sự khác biệt về kháng thể, phương pháp và kỹ thuật. Việc sử dụng mẫu mô lưu trữ lâu ngày trong formalin có thể dẫn đến sai lệch kết quả IHC. Cần xác định tình trạng biểu hiện của các dấu ấn miễn dịch trên mẫu mô lưu trữ lâu ngày để đưa ra kết luận chính xác. Nghiên cứu này nhằm xác định thời gian cố định tối ưu cho IHC, cung cấp thông tin hữu ích cho bác sĩ giải phẫu bệnh, giảm thiểu sai sót và chi phí.

2.1. Sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu về thời gian cố định

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian cố định đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy sự khác biệt đáng kể. Điều này có thể do sự khác nhau về loại kháng thể sử dụng, phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật thực hiện. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian cố định kéo dài làm giảm cường độ tín hiệu, trong khi những nghiên cứu khác lại không ghi nhận sự thay đổi đáng kể. Do đó, cần có thêm nghiên cứu để xác định thời gian cố định tối ưu cho từng loại kháng nguyên.

2.2. Nguy cơ sai lệch kết quả khi sử dụng mẫu lưu trữ lâu ngày

Việc sử dụng mẫu mô lưu trữ lâu ngày trong formalin có thể làm tăng nguy cơ sai lệch kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch. Formalin có thể gây biến đổi kháng nguyên, làm giảm khả năng gắn kết của kháng thể. Ngoài ra, quá trình bảo quản có thể làm thoái hóa DNA/RNA, ảnh hưởng đến kết quả các xét nghiệm phân tử. Do đó, cần có quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt đối với mẫu lưu trữ lâu ngày để đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Formalin Đến IHC 52 Ký Tự

Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch Formalin đệm trung tính 10% lên sự biểu hiện của các dấu ấn trong kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch. Mục tiêu là đánh giá sự biểu hiện của các dấu ấn thông qua hình ảnh nhuộm IHC của mẫu mô được cố định trong formalin ở những mốc thời gian khác nhau. Nghiên cứu cũng xác định khoảng thời gian tối ưu có thể thực hiện nhuộm IHC với mẫu mô cố định bằng formalin. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán bệnh chính xác và đạt kết quả tốt nhất khi thực hiện kỹ thuật nhuộm HMMD.

3.1. Thiết kế nghiên cứu và đối tượng tham gia

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp [Loại hình nghiên cứu]. Đối tượng nghiên cứu là [Mô tả đối tượng nghiên cứu, ví dụ: mẫu mô ung thư vú]. Mẫu mô được cố định trong dung dịch Formalin đệm trung tính 10% trong các khoảng thời gian khác nhau. Các dấu ấn miễn dịch được lựa chọn dựa trên tần suất sử dụng trong chẩn đoán và khả năng bị ảnh hưởng bởi thời gian cố định. Nghiên cứu được thực hiện tại [Địa điểm nghiên cứu] trong khoảng thời gian từ [Thời gian bắt đầu] đến [Thời gian kết thúc].

3.2. Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch và đánh giá kết quả

Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch được thực hiện theo протокол chuẩn. Các bước bao gồm: khử paraffin, phục hồi kháng nguyên, ức chế peroxidase nội sinh, ủ kháng thể, phát hiện tín hiệu và nhuộm nền. Kết quả được đánh giá bởi các nhà giải phẫu bệnh có kinh nghiệm, sử dụng thang điểm [Mô tả thang điểm đánh giá]. Các yếu tố được đánh giá bao gồm: cường độ bắt màu, tỷ lệ tế bào dương tính và vị trí biểu hiện của kháng nguyên. Kết quả được phân tích thống kê để xác định mối liên hệ giữa thời gian cố định và sự biểu hiện của các dấu ấn miễn dịch.

IV. Kết Quả Ảnh Hưởng Thời Gian Cố Định Đến Dấu Ấn Miễn Dịch 59 Ký Tự

Nghiên cứu cho thấy thời gian cố định ảnh hưởng đáng kể đến sự biểu hiện của một số dấu ấn miễn dịch. Các dấu ấn biểu hiện trên màng tế bào, trong bào tương và trong nhân tế bào có mức độ ảnh hưởng khác nhau. Phân tích kết quả đánh giá biểu hiện của từng dấu ấn cho thấy có sự thay đổi về cường độ bắt màu và tỷ lệ tế bào dương tính theo thời gian cố định. Kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát thời gian cố định để đảm bảo độ tin cậy của kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch.

4.1. Ảnh hưởng đến các dấu ấn biểu hiện trên màng tế bào

Các dấu ấn biểu hiện trên màng tế bào như CD20 và CD45 cho thấy sự thay đổi về cường độ bắt màu theo thời gian cố định. Cường độ bắt màu có xu hướng giảm khi thời gian cố định kéo dài. Điều này có thể do formalin gây biến đổi cấu trúc kháng nguyên trên màng tế bào, làm giảm khả năng gắn kết của kháng thể. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng khác nhau tùy thuộc vào từng dấu ấn cụ thể.

4.2. Ảnh hưởng đến các dấu ấn biểu hiện trong bào tương

Các dấu ấn biểu hiện trong bào tương như Cytokeratin (CK) cũng cho thấy sự thay đổi về cường độ bắt màu theo thời gian cố định. Tuy nhiên, xu hướng thay đổi có thể khác nhau so với các dấu ấn trên màng tế bào. Một số dấu ấn có thể tăng cường độ bắt màu trong giai đoạn đầu của thời gian cố định, sau đó giảm dần khi thời gian kéo dài. Điều này có thể do sự thay đổi về cấu trúc và vị trí của kháng nguyên trong bào tương.

4.3. Ảnh hưởng đến các dấu ấn biểu hiện trong nhân tế bào

Các dấu ấn biểu hiện trong nhân tế bào như Ki-67 và p63 cũng bị ảnh hưởng bởi thời gian cố định. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng có thể ít hơn so với các dấu ấn trên màng tế bào và trong bào tương. Điều này có thể do nhân tế bào được bảo vệ tốt hơn khỏi tác động của formalin. Tuy nhiên, thời gian cố định quá dài vẫn có thể gây biến đổi kháng nguyên trong nhân tế bào, làm giảm độ tin cậy của kết quả.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn và Hạn Chế Của Nghiên Cứu 51 Ký Tự

Nghiên cứu này cung cấp thông tin hữu ích cho việc chuẩn hóa quy trình cố định mẫu bệnh phẩm và lựa chọn thời gian cố định tối ưu cho nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả nghiên cứu giúp bác sĩ giải phẫu bệnh đưa ra chẩn đoán chính xác hơn, đặc biệt khi sử dụng mẫu mô lưu trữ lâu ngày. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng có một số hạn chế, như cỡ mẫu nhỏ và chỉ khảo sát một số dấu ấn miễn dịch nhất định. Cần có thêm nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và khảo sát nhiều dấu ấn hơn để có kết luận toàn diện.

5.1. Chuẩn hóa quy trình cố định mẫu bệnh phẩm

Kết quả nghiên cứu nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chuẩn hóa quy trình cố định mẫu bệnh phẩm. Cần xác định thời gian cố định tối ưu cho từng loại mô và dấu ấn miễn dịch. Ngoài ra, cần kiểm soát các yếu tố khác ảnh hưởng đến chất lượng mẫu, như nhiệt độ và thể tích dung dịch Formalin. Việc chuẩn hóa quy trình cố định mẫu giúp đảm bảo độ tin cậy của kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch và cải thiện chất lượng chẩn đoán.

5.2. Hạn chế của nghiên cứu và hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu này có một số hạn chế, như cỡ mẫu nhỏ và chỉ khảo sát một số dấu ấn miễn dịch nhất định. Do đó, cần có thêm nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và khảo sát nhiều dấu ấn hơn để có kết luận toàn diện. Ngoài ra, cần nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác, như loại dung dịch Formalin và nhiệt độ cố định, đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát triển các phương pháp phục hồi kháng nguyên hiệu quả hơn để cải thiện độ tin cậy của kết quả khi sử dụng mẫu lưu trữ lâu ngày.

VI. Kết Luận Tối Ưu Thời Gian Cố Định Cho IHC 45 Ký Tự

Nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch Formalin đến sự biểu hiện của các dấu ấn trong kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch. Kết quả cho thấy thời gian cố định ảnh hưởng đáng kể đến sự biểu hiện của một số dấu ấn, đặc biệt là các dấu ấn trên màng tế bào và trong bào tương. Việc kiểm soát thời gian cố định là rất quan trọng để đảm bảo độ tin cậy của kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch. Cần có thêm nghiên cứu để xác định thời gian cố định tối ưu cho từng loại mô và dấu ấn miễn dịch.

6.1. Tóm tắt kết quả chính và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng thời gian cố định là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch. Việc cố định quá lâu hoặc quá ngắn đều có thể dẫn đến sai lệch kết quả. Nghiên cứu này cung cấp thông tin hữu ích cho việc chuẩn hóa quy trình cố định mẫu bệnh phẩm và lựa chọn thời gian cố định tối ưu cho từng loại mô và dấu ấn miễn dịch. Kết quả nghiên cứu giúp bác sĩ giải phẫu bệnh đưa ra chẩn đoán chính xác hơn và cải thiện chất lượng chăm sóc bệnh nhân.

6.2. Hướng phát triển và nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần có thêm nghiên cứu để xác định thời gian cố định tối ưu cho nhiều loại mô và dấu ấn miễn dịch khác nhau. Ngoài ra, cần nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác, như loại dung dịch Formalin và nhiệt độ cố định, đến kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch. Các nghiên cứu nên tập trung vào việc phát triển các phương pháp phục hồi kháng nguyên hiệu quả hơn để cải thiện độ tin cậy của kết quả khi sử dụng mẫu lưu trữ lâu ngày. Ứng dụng trí tuệ nhân tạo (AI) trong phân tích hình ảnh IHC cũng là một hướng đi đầy tiềm năng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hóa mô miễn dịch (HMMD) là kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán giải phẫu bệnh, giúp phát hiện kháng nguyên trên mô bệnh, từ đó hỗ trợ phân loại, tiên lượng và định hướng điều trị. Tại Việt Nam, HMMD được áp dụng chủ yếu tại các cơ sở y tế lớn do yêu cầu kỹ thuật cao và chi phí sinh phẩm đắt đỏ. Một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả HMMD là thời gian cố định mẫu mô trong dung dịch formalin đệm trung tính 10% (NBF 10%). Mặc dù formalin là chất cố định phổ biến nhất, việc kéo dài thời gian cố định có thể làm giảm biểu hiện các dấu ấn miễn dịch, gây sai lệch kết quả chẩn đoán. Nghiên cứu này được thực hiện tại Bệnh viện Ung bướu TP.HCM từ tháng 11/2020 đến tháng 7/2021, khảo sát ảnh hưởng của thời gian cố định mẫu mô trong NBF 10% lên biểu hiện của 9 dấu ấn miễn dịch phổ biến trên các mẫu mô vú ung thư, amiđan viêm và ruột thừa viêm. Mục tiêu chính là xác định khoảng thời gian cố định tối ưu để đảm bảo kết quả HMMD chính xác, từ đó hỗ trợ bác sĩ giải phẫu bệnh trong chẩn đoán và giảm thiểu chi phí điều trị. Nghiên cứu có ý nghĩa lớn trong việc chuẩn hóa quy trình xử lý mẫu mô, nâng cao chất lượng chẩn đoán và góp phần phát triển kỹ thuật HMMD tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC): Kỹ thuật kết hợp phản ứng miễn dịch và hóa học để phát hiện kháng nguyên trên màng tế bào, bào tương và nhân tế bào. Sử dụng kháng thể đặc hiệu và hệ thống phát hiện men (thường là horseradish peroxidase - HRP) với chất nền diaminobenzidine (DAB) tạo màu nâu quan sát dưới kính hiển vi quang học.

• Ảnh hưởng của formalin lên kháng nguyên: Formalin tạo liên kết chéo giữa protein, che phủ epitope, làm giảm khả năng kháng thể nhận diện kháng nguyên, dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính yếu.

• Thang điểm đánh giá cường độ bắt màu: Sử dụng thang điểm 0-5 để đánh giá mức độ biểu hiện của các dấu ấn miễn dịch, giúp tăng tính khách quan và đồng thuận trong đánh giá.

Các khái niệm chính bao gồm: kháng nguyên (antigen), kháng thể (antibody), epitope, cố định mẫu mô, dấu ấn miễn dịch (CD20, CD45, Her-2, Caldesmon, CK, CK7, ER, Ki-67, p63), và kỹ thuật sắp xếp dãy mô (TMA).

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm mô tả, sử dụng mẫu mô bệnh nhân đã được cố định trong NBF 10% với thời gian cố định từ 24 giờ đến 27 tuần.

• Đối tượng nghiên cứu: 16 mẫu mô gồm 9 mẫu ung thư vú, 4 mẫu amiđan viêm, 3 mẫu ruột thừa viêm, đáp ứng tiêu chuẩn chọn mẫu như kích thước tối thiểu 3 cm, kết quả HMMD dương tính mạnh.

• Thu thập dữ liệu: Mẫu mô được cắt thành nhiều lát tương ứng với các mốc thời gian cố định khác nhau, xử lý, đúc khối paraffin, cắt mỏng 3-5 µm, nhuộm HE và HMMD trên hệ thống máy nhuộm tự động Ventana Benchmark XT và Dako Omnis.

• Phân tích số liệu: Đánh giá cường độ bắt màu theo thang điểm 0-5 bởi 3 chuyên gia giải phẫu bệnh độc lập, nhập liệu và phân tích bằng SPSS 26. Phân tích tương quan giữa cường độ bắt màu và thời gian cố định sử dụng hệ số tương quan Pearson (r) và hệ số xác định (r²).

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 11/2020 đến tháng 7/2021, với tối đa 13 mốc thời gian cố định (từ 24 giờ đến 27 tuần).

• Đạo đức nghiên cứu: Được Hội đồng đạo đức y sinh học Đại học Y dược TP.HCM và Bệnh viện Ung bướu TP.HCM phê duyệt, đảm bảo bảo mật thông tin và không ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Biểu hiện dấu ấn CD20: Trên 4 mẫu amiđan viêm, cường độ bắt màu trung bình dao động từ 3,5 đến 4,0 điểm trong suốt 21 tuần cố định, không có sự thay đổi đáng kể (độ lệch chuẩn tối đa 0,58). Hệ số tương quan r dao động từ -0,517 đến 0,140, không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

2. Biểu hiện dấu ấn CD45: Trên 4 mẫu amiđan viêm, cường độ bắt màu trung bình giảm nhẹ từ 4,0 điểm sau 24 giờ xuống 3,63 điểm sau 21 tuần, giảm khoảng 0,37 điểm. Hệ số tương quan r có giá trị âm ở một số mẫu, với p < 0,05 ở 2 mẫu, cho thấy sự giảm biểu hiện có ý nghĩa thống kê ở một số trường hợp.

3. Biểu hiện dấu ấn Her-2: Trên 5 mẫu ung thư vú, cường độ bắt màu trung bình giảm từ 4,2 điểm sau 24 giờ xuống 3,0 điểm sau 25-27 tuần, giảm khoảng 1,2 điểm. Hệ số tương quan r âm và có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) ở một số mẫu, cho thấy thời gian cố định kéo dài ảnh hưởng rõ rệt đến biểu hiện Her-2.

4. Tỷ lệ mẫu mất mô: Trong quá trình cắt lọc và nhuộm, khoảng 12,3% lát cắt khảo sát Her-2 không còn mô u để đánh giá do mất mẫu, ảnh hưởng đến độ tin cậy kết quả.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy các dấu ấn miễn dịch biểu hiện ổn định trong khoảng thời gian cố định ngắn (24 giờ đến vài tuần), tuy nhiên, với thời gian cố định kéo dài trên 7 tuần, một số dấu ấn như Her-2 bắt đầu giảm biểu hiện rõ rệt. Điều này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy formalin tạo liên kết chéo làm che phủ epitope, giảm khả năng nhận diện kháng nguyên. Sự khác biệt về mức độ ảnh hưởng giữa các dấu ấn phản ánh tính đặc hiệu của từng kháng nguyên và kháng thể sử dụng.

Biểu đồ tương quan cường độ bắt màu với thời gian cố định minh họa xu hướng giảm biểu hiện, đặc biệt rõ ở Her-2, trong khi CD20 và CD45 ít bị ảnh hưởng hơn. Điều này cho thấy cần kiểm soát nghiêm ngặt thời gian cố định để đảm bảo kết quả HMMD chính xác, tránh sai lệch chẩn đoán.

Ngoài ra, tỷ lệ mất mẫu trong quá trình xử lý cho thấy tầm quan trọng của kỹ thuật cắt lọc và xử lý mẫu chuẩn xác để giảm thiểu sai sót. Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ ảnh hưởng của thời gian cố định trong điều kiện thực tế tại Việt Nam, hỗ trợ xây dựng hướng dẫn chuẩn hóa quy trình HMMD.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Kiểm soát thời gian cố định mẫu mô: Khuyến nghị thời gian cố định tối ưu từ 24 giờ đến không quá 7 tuần để đảm bảo biểu hiện các dấu ấn miễn dịch chính xác, đặc biệt với các dấu ấn nhạy cảm như Her-2. Các phòng xét nghiệm cần thiết lập quy trình giám sát thời gian cố định mẫu.

2. Đào tạo kỹ thuật viên: Tăng cường đào tạo kỹ thuật viên về kỹ thuật cắt lọc, xử lý mẫu và nhuộm HMMD nhằm giảm tỷ lệ mất mẫu và sai sót kỹ thuật, nâng cao chất lượng kết quả chẩn đoán.

3. Áp dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô (TMA): Khuyến khích sử dụng TMA để thực hiện nhuộm đồng thời nhiều mẫu trong cùng điều kiện, giảm chi phí và tăng tính đồng nhất kết quả.

4. Xây dựng hướng dẫn chuẩn hóa quy trình HMMD: Các cơ sở y tế cần xây dựng và áp dụng hướng dẫn chuẩn về thời gian cố định, quy trình xử lý mẫu và đánh giá kết quả HMMD phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

5. Theo dõi và đánh giá chất lượng định kỳ: Thiết lập hệ thống kiểm chuẩn chất lượng nội bộ và tham gia kiểm chuẩn quốc tế để đảm bảo độ tin cậy và chính xác của kết quả HMMD.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ giải phẫu bệnh: Nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về ảnh hưởng thời gian cố định lên kết quả HMMD, giúp bác sĩ đưa ra chẩn đoán chính xác và lựa chọn mẫu mô phù hợp.

2. Kỹ thuật viên xét nghiệm y học: Hướng dẫn thực hành kỹ thuật cắt lọc, xử lý mẫu và nhuộm HMMD chuẩn xác, giảm thiểu sai sót kỹ thuật và nâng cao chất lượng xét nghiệm.

3. Quản lý phòng xét nghiệm: Cơ sở để xây dựng quy trình chuẩn, kiểm soát chất lượng và đào tạo nhân sự nhằm nâng cao hiệu quả hoạt động phòng xét nghiệm.

4. Nhà nghiên cứu y sinh học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về ảnh hưởng của formalin lên biểu hiện kháng nguyên, làm nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về kỹ thuật HMMD và cải tiến phương pháp cố định mẫu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao thời gian cố định mẫu mô lại ảnh hưởng đến kết quả HMMD?
   Formalin tạo liên kết chéo giữa protein, che phủ epitope trên kháng nguyên, làm giảm khả năng kháng thể nhận diện, dẫn đến kết quả nhuộm yếu hoặc sai lệch. Thời gian cố định càng dài, ảnh hưởng càng rõ.

2. Thời gian cố định tối ưu cho mẫu mô là bao lâu?
   Nghiên cứu cho thấy thời gian cố định từ 24 giờ đến 7 tuần là phù hợp để giữ biểu hiện các dấu ấn miễn dịch ổn định, đặc biệt với các dấu ấn nhạy cảm như Her-2.

3. Làm thế nào để giảm tỷ lệ mất mẫu trong quá trình xử lý?
   Cần kỹ thuật cắt lọc chính xác, xử lý mẫu đúng quy trình, sử dụng thiết bị hiện đại và đào tạo kỹ thuật viên bài bản để giảm mất mô và sai sót.

4. Có thể áp dụng kết quả nghiên cứu này cho các phòng xét nghiệm khác không?
   Kết quả có thể tham khảo và điều chỉnh phù hợp với điều kiện kỹ thuật và đặc điểm mẫu mô tại từng cơ sở, đồng thời cần kiểm chuẩn chất lượng định kỳ để đảm bảo tính chính xác.

5. Tại sao một số dấu ấn miễn dịch ít bị ảnh hưởng bởi thời gian cố định hơn?
   Mức độ nhạy cảm với formalin phụ thuộc vào đặc tính kháng nguyên và kháng thể, cũng như kỹ thuật bộc lộ kháng nguyên và quy trình nhuộm HMMD.

Kết luận

• Thời gian cố định mẫu mô trong dung dịch formalin đệm trung tính 10% ảnh hưởng khác nhau đến biểu hiện các dấu ấn miễn dịch, với Her-2 là dấu ấn nhạy cảm nhất, giảm biểu hiện rõ rệt sau 7 tuần cố định.
• Các dấu ấn CD20 và CD45 biểu hiện ổn định trong suốt 21 tuần cố định, cho thấy một số dấu ấn miễn dịch có khả năng chịu đựng thời gian cố định dài hơn.
• Kỹ thuật cắt lọc và xử lý mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mất mẫu và đảm bảo kết quả HMMD chính xác.
• Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng hướng dẫn chuẩn hóa thời gian cố định và quy trình HMMD tại các phòng xét nghiệm Việt Nam.
• Đề xuất các giải pháp kiểm soát thời gian cố định, đào tạo kỹ thuật viên và áp dụng kỹ thuật TMA nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán và giảm chi phí điều trị.

Next steps: Triển khai áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn tại các phòng xét nghiệm, đồng thời mở rộng nghiên cứu với số mẫu lớn hơn và đa dạng loại mô để hoàn thiện hướng dẫn kỹ thuật.

Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm cần phối hợp xây dựng quy trình chuẩn, đào tạo nhân sự và kiểm soát chất lượng nhằm nâng cao hiệu quả kỹ thuật HMMD, góp phần cải thiện chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong chẩn đoán bằng giải phẫu bệnh, khi hình ảnh vi thể trên tiêu bản Hematoxylin-Eosin (HE) không điển hình sẽ gây ra ít nhiều khó khăn cho việc chẩn đoán và kết luận bệnh. Hóa mô miễn dịch (HMMD) ra đời nhằm đáp ứng được những yêu cầu mà hình ảnh mô học nhuộm bằng kỹ thuật nhuộm thường quy chưa thể giải quyết được triệt để. Ngoài việc tìm ra được nguồn gốc của những khối u, định hướng chẩn đoán, HMMD còn cho phép bác sĩ giải phẫu bệnh tìm hiểu về đặc tính của khối u, từ đó có thể phân loại, tiên lượng bệnh cũng như định hướng điều trị phù hợp cho các bác sĩ lâm sàng [23]. Trên thực tế, thỉnh thoảng vẫn có những trường hợp tiêu bản sau nhuộm không đạt yêu cầu chẩn đoán bởi quá trình cắt lọc không đúng vị trí mô bệnh, không còn mô hoặc tế bào quan tâm; hay do những lỗi kỹ thuật nhỏ xảy ra trong quá trình xử lý mô, đúc khối, cắt mỏng, v.

làm ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian và quá trình chẩn đoán. Trong những trường hợp này, các bác sĩ giải phẫu bệnh thường yêu cầu thực hiện việc lục lại bệnh phẩm, cắt lọc và nhuộm lại đối với các mẫu không đạt yêu cầu chẩn đoán. Tuy nhiên, do mẫu mô của bệnh nhân đã được lưu trữ trong formalin đệm trung tính 10% (NBF 10%) một khoảng thời gian dài cho nên việc sử dụng mẫu mô này để nhuộm HMMD có thể dẫn đến sai lệch kết quả, hoặc âm tính giả hoặc dương tính yếu. Việc này được giải thích là do các kháng nguyên hay quyết định kháng nguyên bị formalin tạo các liên kết chéo, che phủ bề mặt của các vị trí nhận diện kháng nguyên [34].

Chính điều này làm cho kháng thể không thể bắt cặp đặc hiệu được với kháng nguyên trên tế bào mà bác sĩ giải phẫu bệnh quan tâm. Ngoài ra, formalin mặc dù là chất cố định tối ưu nhất cho mô nhưng khả năng bảo tồn kháng nguyên sau một thời gian dài lưu trữ của formalin cũng còn hạn chế [21, 43]. Cố định mô đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong kết quả chẩn đoán giải phẫu bệnh và HMMD. Mặc dù đã có hướng dẫn mức giới hạn về thời gian của việc cố định là từ 6 giờ cho đến 72 giờ, tốt nhất là 24 giờ tính từ thời điểm cho.

mô vào dung dịch formalin đệm trung tính. Tuy nhiên các nghiên cứu về việc kéo dài thời gian cố định là rất ít; kết quả của các nghiên cứu cũng có nhiều khác biệt do có sự khác nhau về kháng thể được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán ở các quốc gia; phương pháp tiến hành nghiên cứu và kỹ thuật thực hiện cũng khác nhau ở từng nghiên cứu. Vì thế, để tạo cơ sở, hỗ trợ cho việc chẩn đoán bệnh chính xác và đạt kết quả tốt nhất khi thực hiện kỹ thuật nhuộm HMMD trên mô bệnh học, nhất là khi phải sử dụng những mẫu mô bệnh đã lưu trữ lâu ngày trong formalin, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian cố định bằng dung dịch formalin đệm trung tính 10% lên sự biểu hiện của các dấu ấn trong kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch” với mong muốn xác định tình trạng biểu hiện của các dấu ấn miễn dịch phổ biến trên mẫu mô được lưu trữ trong formalin thời gian dài; từ đó xác định thời điểm cố định mà kết quả đánh giá không bị sai lệch, cung cấp cho các bác sĩ giải phẫu bệnh những thông tin hữu ích, nhằm hạn chế tối đa sai sót khi gởi mẫu bệnh phẩm và phân tích kết quả, giảm thiểu chi phí chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Mục tiêu tổng quát: Khảo sát ảnh hưởng của việc kéo dài thời gian cố định bằng formalin lên khả năng biểu hiện của các dấu ấn trong kỹ thuật nhuộm HMMD.

Mục tiêu cụ thể: - Đánh giá sự biểu hiện của các dấu ấn thông qua hình ảnh nhuộm HMMD của mẫu mô được cố định trong formalin ở những mốc thời gian khác nhau. - Xác định khoảng thời gian tối ưu có thể thực hiện nhuộm HMMD với mẫu mô cố định bằng formalin.1 Tổng quan hóa mô miễn dịch Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là kỹ thuật nhuộm kết hợp giữa phản ứng hóa học (-chemistry) và phản ứng miễn dịch (Immuno-) trên mẫu mô (-histo-), nhằm phát hiện những kháng nguyên trên màng tế bào, trên nhân cũng như trong bào tương. Kỹ thuật HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên hoặc quyết định kháng nguyên, kết hợp với hệ thống phát hiện giúp các bác sĩ giải phẫu bệnh nhìn thấy được các phức hợp kháng nguyên – kháng thể này bằng kính hiển vi quang học thông thường. Kỹ thuật nhuộm HMMD được sử dụng nhiều nhất trong các labo giải phẫu bệnh nhằm phục vụ cho công tác chẩn đoán là kỹ thuật nhuộm HMMD men, trong đó, hệ thống phát hiện bao gồm men (thông dụng nhất là Peroxidase củ cải ngựa (HRP)), chất nền (thông dụng nhất là H2O2) và chất màu (thông dụng nhất là Diaminobenzidine (DAB)).

Có nhiều phương pháp nhuộm HMMD dựa trên kỹ thuật này, chẳng hạn như phương pháp miễn dịch men trực tiếp, gián tiếp, sandwich, khuếch đại chuỗi HRP, v. Trên thế giới, HMMD từ lâu đã được sử dụng rộng rãi và rất hữu ích trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong chẩn đoán, điều trị và nghiên cứu ung thư. Tuy nhiên tại Việt Nam, kỹ thuật HMMD chỉ được thực hiện tại các cơ sở y tế lớn, có hệ thống chẩn đoán y khoa hiện đại và có đội ngũ nhân viên y tế nhiều kinh nghiệm. Một phần do HMMD vẫn được xem là một kỹ thuật chuyên sâu, đòi hỏi không những chuyên môn của người thực hiện kỹ thuật mà còn cần sự cẩn thận, khéo léo, bởi chỉ cần thực hiện không chính xác một bước trong số các bước của kỹ thuật là sẽ cho kết quả sai lệch.

Một phần khác là do chi phí từ việc sử dụng kháng thể khá đắt, thời hạn sử dụng ngắn, không có nhiều đơn vị y tế có khả năng trang bị và áp dụng. Từ đó dẫn đến việc cho đến hiện tại, các nghiên cứu về kỹ thuật nhuộm HMMD tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. HMMD là công cụ phụ trợ quan trọng cho các bác sĩ giải phẫu bệnh bởi vì khả năng trực quan hóa sự phân bố (diện), số phân tử có mặt (lượng) cũng như đặc tính (chất) của phân tử, mà ở đây là kháng nguyên của tế bào mà các bác sĩ giải phẫu bệnh quan tâm. HMMD bao gồm phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên hiện diện trong mô (trong bào tương, trên màng tế bào hay trên nhân) và kháng thể (được chế tạo và thương mại hóa bằng các kit của nhà sản xuất) tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể ngay tại vị trí kháng nguyên của tế bào cần quan sát, và phản ứng hóa học giữa phức hợp kháng nguyên – kháng thể đã bắt cặp với các hóa chất cho thêm vào.

Có hai cách thông dụng để quan sát phức hợp này: - Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescences – IF): Phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ gắn với chất phát huỳnh quang (fluorochrome) và được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Tùy thuộc loại chất màu được gắn vào kháng thể, khi chiếu tia cực tím vào sẽ cho ra màu sắc tương ứng như màu xanh táo của FITC (Fluorescein Isothiocyanate) hay màu đỏ của TRITC (Tetramethylrhodamin Isothiocyanate). Tuy nhiên, chi phí để đầu tư cho việc mua hóa chất, sinh phẩm và kính hiển vi huỳnh quang chuyên dụng có lắp bộ phận chiếu tia cực tím là khá cao, không phù hợp với khả năng kinh tế của bệnh nhân ở Việt Nam, nhất là khi chẩn đoán bằng HMMD bắt buộc phải phối hợp giữa nhiều dấn ấn khác nhau để cho ra kết chính xác; một phần khác khiến miễn dịch huỳnh quang ít được sử dụng là do tiêu bản sau nhuộm rất dễ bị nhạt màu dần theo thời gian, khó lưu trữ lâu. Hiện nay tại Việt Nam, miễn dịch huỳnh quang được sử dụng chính trong việc tìm kháng nguyên (trực tiếp) hoặc kháng thể (gián tiếp) của các vi sinh vật, các dấu ấn trong bệnh lý thận, bệnh lý da liễu và một số dấu ấn ung thư, v.

- Miễn dịch men: là kỹ thuật gắn phức hợp kháng nguyên – kháng thể với một loại men (peroxidase, hoặc alkalin phosphatase), sau đó gắn tiếp với chất chỉ thị màu (chromogen) và đem đi quan sát bằng kính hiển vi quang học thông thường. Hiện tại miễn dịch men được sử dụng phổ biến hơn tại các đơn vị giải phẫu bệnh có thực hiện kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch. Ưu điểm của miễn dịch men. hơn miễn dịch huỳnh quang là về chi phí thực hiện, thời gian lưu trữ cũng như trang thiết bị dùng để chẩn đoán.

Tuy nhiên, vì kỹ thuật miễn dịch men phải trải qua nhiều bước thực hiện và các hóa chất dễ bị tác động, ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài nên dễ dẫn đến sai lệch về sự biểu hiện màu, cường độ bắt màu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học [28, 32, 35].2 Quy trình kỹ thuật giải phẫu bệnh và hóa mô miễn dịch 1. Kỹ thuật thu thập, cắt lọc và cố định mẫu Mẫu thu thập phải là mẫu tươi hoặc đã được cố định trong dung dịch NBF10%, đảm bảo không quá 30 phút sau khi lấy ra khỏi cơ thể bệnh nhân. Việc cố định mẫu bằng dung dịch cố định giúp bất động cấu trúc tế bào và mô, hạn chế sự tự hủy và bảo quản hình thái cấu trúc giống tối đa như khi tế bào còn sống. Lưu ý khi đặt mẫu vào lọ chứa dung dịch cố định đảm bảo không có một phần nào của mẫu tiếp xúc với không khí hay dính trên thành lọ và yêu cầu thể tích dung dịch cố định tối thiểu phải gấp 20 lần thể tích mẫu.

Có nhiều loại dung dịch khác nhau để cố định mẫu mô như dung dịch Bouin, dung dịch Gendre, dung dịch Elftman, v. Tuy nhiên, hiện nay phần lớn các đơn vị y tế đều dùng dung dịch cố định NBF10% bởi sự tiện lợi, giá thành thấp, ít độc hơn các dung dịch cố định khác và cho kết quả cố định mô tốt hơn.