Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình. Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi hỏi sâu sắc hơn.
Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt, thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003): - Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản.
- Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao. - Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống. - Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai thác tế bào mầm. Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro (IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn khá thấp (Farstad, 2000).
Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện. Mục tiêu Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Yêu cầu - Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
- Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên khả năng hoạt hóa tinh trùng. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng 2.
Cấu tạo Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng. Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. - Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm. Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có lông, tế bào đáy và tế bào trung gian.
Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen.
Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết.
Những tế bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng. Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng.
Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh. Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết.
Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp đệm của nội mạc tử cung. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 - Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc. - Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh.
Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng - Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc tiến hành nhờ ba yếu tố: + Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004). + Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự chuyển động của các lông.
+ Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng (Trịnh Bình và ctv, 2004). - Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng vai trò quan trọng.
Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn. Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội mạc tử cung. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể - Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng đời sinh sản của tế bào.
Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 - Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). - Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi trƣờng nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005): + Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau: Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng.
Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết thúc vòng đời tái sản. Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao. Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào. + Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng.
Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh. Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005): + Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào.
+ Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1- 2.106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).