Tổng quan luận án

Dung môi hữu cơ chứa các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (VOCs), trong đó nhóm benzen, toluen, ethylbenzen và xylen (BTEX) được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp sản xuất sơn, nhựa tổng hợp, keo dán và da giày. Mặc dù benzen đã bị hạn chế sử dụng do độc tính cao và được thay thế bằng toluen, ethylbenzen, xylen (TEX), nhưng trong nguyên liệu thương phẩm của nhóm TEX vẫn tồn dư một lượng benzen nhất định (toluen thường chứa khoảng 5% benzen; xylen công nghiệp chứa từ 20% đến 40,4% ethylbenzen). Do đó, người lao động trong ngành sản xuất sơn thường xuyên phải tiếp xúc đồng thời với hỗn hợp nhóm chất BTEX.

Khi xâm nhập vào cơ thể, BTEX gây suy giảm sức nghe, giảm chức năng hô hấp, tổn thương da, ức chế tủy xương gây thiếu máu và làm tăng nguy cơ ung thư. Quá trình chuyển hóa BTEX trong cơ thể phụ thuộc chủ yếu vào enzym cytochrom P450 2E1 do gen CYP2E1 mã hóa. Mặc dù Việt Nam đã công nhận nhiễm độc benzen và các đồng đẳng là bệnh nghề nghiệp và quy định chỉ số giám sát sinh học riêng lẻ cho từng chất, nhưng việc giám sát sinh học cho tình trạng phơi nhiễm đồng thời với cả nhóm BTEX chưa được triển khai. Các nghiên cứu trước đây trong nước chủ yếu dừng lại ở việc khảo sát nồng độ ô nhiễm môi trường và hiện trạng sức khỏe lâm sàng thông thường, chưa phân tích chuyên sâu về sự biến đổi biểu hiện mRNA và các biến thể di truyền trên vùng promoter của gen CYP2E1 ở người lao động phơi nhiễm.

Luận án tiến sĩ sinh học của tác giả Nguyễn Thị Hiền, chuyên ngành Hóa sinh học (mã số: 9420101.16), được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Bùi Phương Thuận và PGS. Nguyễn Quang Huy, nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu trên.

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Xác định mức độ thấm nhiễm của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp tại cơ sở nghiên cứu.
  2. Xác định ảnh hưởng của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện gen CYP2E1 ở đối tượng nghiên cứu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Người lao động trực tiếp sản xuất có tiếp xúc với nhóm dung môi hữu cơ BTEX (nhóm tiếp xúc) và người lao động không có nguy cơ tiếp xúc với BTEX (nhóm không tiếp xúc/đối chứng); môi trường lao động tại các cơ sở nghiên cứu.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được tiến hành tại 4 cơ sở sản xuất, gồm 3 doanh nghiệp sản xuất sơn tại Hà Nội (Công ty TNHH Sơn công nghiệp Hòa Phát - Thanh Oai; Công ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp - Thường Tín; Công ty Cổ phần Sơn Tổng hợp Hà Nội - Thanh Trì) và 1 doanh nghiệp may mặc (Công ty May Tứ Kỳ - Hải Dương). Các thực nghiệm chuyên sâu được thực hiện tại Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trung tâm Sức khỏe Nghề nghiệp, Trạm Quan trắc Môi trường Lao động thuộc Viện Khoa học An toàn và Vệ sinh Lao động.
  • Phạm vi thời gian: Thời gian thu thập mẫu thực địa từ năm 2016 đến năm 2018; toàn bộ quá trình phân tích và hoàn thiện nghiên cứu được tiến hành từ tháng 01/2016 đến tháng 03/2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan y văn trong luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về dung môi hữu cơ, cơ chế chuyển hóa của nhóm BTEX, độc tính và các chỉ dấu sinh học phân tử liên quan đến gen CYP2E1:

Các nghiên cứu quốc tế

  • Phơi nhiễm môi trường và nghề nghiệp: Nghiên cứu của Moon và cộng sự (1995–1997) tại khu công nghiệp Iangrim (Hàn Quốc) trên 862 xưởng sản xuất cho thấy dung môi hữu cơ được dùng nhiều nhất trong ngành sản xuất sơn, keo dán, chất làm sạch; trong đó toluen và xylen là hai hóa chất xuất hiện với tần suất cao nhất.
  • Đặc điểm và đa hình gen CYP2E1: Stephens E. và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RFLP để phân tích đa hình gen CYP2E1 và chỉ ra sự khác biệt về tần số alen giữa các quần thể. Hayashi và cộng sự chứng minh các biến thể di truyền tại vùng promoter (-1372 đến -960) với 5 vị trí sai khác nucleotide (-1259 PstI, -1165, -1019 RsaI, -991, -771) làm tăng hoạt tính phiên mã của promoter loại C lên gấp 10 lần so với loại A, khẳng định vị trí RsaI giữ vai trò thiết yếu trong điều hòa phiên mã. Munaka và cộng sự xác định hai biến thể đơn nucleotide (SNPs) rs3813867 (-1293G>C) và rs2031920 (-1053C>T) có liên quan đến việc gia tăng phiên mã CYP2E1 và nguy cơ ung thư gan. Wang và cộng sự công bố kiểu gen C/C hoặc G/C tại vị trí -1293 làm tăng độ nhạy cảm của cơ thể với độc tính của benzen. Hanioka và cộng sự chứng minh các biến thể CYP2E1*2, *3, *4 xúc tác quá trình oxy hóa benzen và toluen trên mô hình nấm men tái tổ hợp. Kim và cộng sự phân tích đa hình vị trí -1054 C>T trên 385 đối tượng phơi nhiễm BTEX (kiểu gen C/C: 239, C/T: 127, T/T: 19). Helmig và cộng sự ghi nhận sự thay thế nucleotide tại vị trí -1053 C>T làm biến đổi tần số alen và mức biểu hiện mRNA.
  • Mức độ biểu hiện mRNA CYP2E1 làm chỉ dấu sinh học: Jiménez-Garza và cộng sự so sánh nhóm công nhân phơi nhiễm toluen và nhóm đối chứng hành chính tại Guanajuato (Mexico) qua thử nghiệm chuyển hóa chlorzoxazone (CHZ), ghi nhận hoạt tính enzym CYP2E1 suy giảm ở nhóm phơi nhiễm do cạnh tranh cơ chất. Mendoza-Cantú và cộng sự khẳng định mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 là chỉ số đánh giá mức tiếp xúc nghề nghiệp với benzen, toluen, ethylbenzen và xylen ưu việt hơn thử nghiệm CHZ vì đây là xét nghiệm an toàn, không xâm lấn và không phụ thuộc vào sản phẩm chuyển hóa tức thời. Wang và cộng sự chỉ ra công nhân phơi nhiễm VOCs có mức biểu hiện mRNA CYP2E1 (0,89 ± 0,46) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P < 0,01) so với nhóm không tiếp xúc (0,61 ± 0,35).

Các nghiên cứu tại Việt Nam

Các công trình trong nước chủ yếu tập trung vào quan trắc môi trường và đo lường các chỉ số sinh hóa cổ điển:

  • Nghiên cứu phối hợp giữa Viện Nghiên cứu Khoa học Kỹ thuật Bảo hộ Lao động, Viện Y học Lao động và Trường Đại học Y Hà Nội ghi nhận nồng độ dung môi hữu cơ tại các xưởng sản xuất sơn vượt tiêu chuẩn từ 1,7 đến 2,3 lần.
  • Hoàng Thị Minh Hiền đo đạc môi trường tại 4 cơ sở (Da giày Phúc Yên, Da giày Yên Viên, Nhựa Hưng Yên và một xưởng sơn tại Hà Nội), sử dụng nồng độ axit hippuric niệu làm chỉ số giám sát phơi nhiễm toluen, ghi nhận nồng độ dung môi vượt tiêu chuẩn cho phép từ 1,3 đến 2,3 lần.
  • Hà Lan Phương nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến thính lực công nhân, chỉ ra tỷ lệ giảm sức nghe rõ rệt dù tiếng ồn không vượt ngưỡng.
  • Nguyễn Thế Công và cộng sự khảo sát lao động nữ ngành da giày, ghi nhận nồng độ toluen vượt 1,2 đến 1,8 lần giới hạn cho phép, dẫn đến suy giảm trí nhớ và tăng thời gian phản xạ.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Cho đến thời điểm thực hiện đề tài, tại Việt Nam chưa có công trình nào đánh giá đồng thời mức tiếp xúc cá nhân với cả 4 chất trong nhóm BTEX, nồng độ BTEX trong máu, nước tiểu cùng hệ thống các chất chuyển hóa đặc hiệu (TTMA, O-cresol, mHA, MA, PGA), đồng thời liên kết các dữ liệu này với mức độ biểu hiện mRNA và các biến đổi nucleotide trên vùng promoter của gen CYP2E1.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Chuyển hóa BTEX và vai trò của enzym CYP2E1: Nhóm BTEX hấp thu chủ yếu qua đường hô hấp vào hệ tuần hoàn. Trong cơ thể, enzym cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) nằm ở lưới nội chất của tế bào gan xúc tác phản ứng oxy hóa ban đầu:
    • Benzen chuyển hóa thành phenol, hydroquinon và đào thải qua nước tiểu dưới dạng axit t,t-muconic (TTMA) hoặc axit S-phenylmercapturic.
    • Toluen chuyển hóa thành axit benzoic rồi liên hợp với glycin tạo thành axit hippuric (HA), một phần nhỏ chuyển thành O-cresol.
    • Ethylbenzen oxy hóa thành axit mandelic (MA) và axit phenylglyoxylic (PGA).
    • Xylen oxy hóa thành axit methylhippuric (mHA gồm các đồng phân ortho, meta, para).
  • Cấu trúc gen CYP2E1: Gen CYP2E1 định vị trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 10 (10q26.3), gồm 9 exon, 8 intron và vùng promoter điều hòa phiên mã. Các tác nhân hóa học như BTEX có khả năng cảm ứng làm thay đổi mức biểu hiện mRNA của gen này.
  • Công thức đánh giá giới hạn nồng độ tiếp xúc hỗn hợp (ACGIH): $$a = \frac{C_{\text{benzen}}}{m_{\text{benzen}}} + \frac{C_{\text{toluen}}}{m_{\text{toluen}}} + \frac{C_{\text{ethylbenzen}}}{m_{\text{ethylbenzen}}} + \frac{C_{\text{xylen}}}{m_{\text{xylen}}}$$ Trong đó: $C_i$ là nồng độ đo được của từng chất trong mẫu cá nhân; giá trị giới hạn nồng độ cho phép trong môi trường lao động là $m_{\text{benzen}} = 1{,}6\text{ mg/m}^3$, $m_{\text{toluen}} = 75\text{ mg/m}^3$, $m_{\text{ethylbenzen}} = 87\text{ mg/m}^3$, $m_{\text{xylen}} = 343\text{ mg/m}^3$. Hỗn hợp đạt tiêu chuẩn an toàn khi $a \le 1$.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả cắt ngang có nhóm so sánh.

Nhóm đối tượng Cỡ mẫu Tiêu chuẩn lựa chọn Quy trình lấy mẫu & Phân tích
Nhóm tiếp xúc 73 người (chọn từ 140 công nhân tại 3 nhà máy sơn) Công nhân trực tiếp sản xuất sơn tiếp xúc với BTEX; tuổi nghề $\ge 3$ năm; không mắc bệnh trước khi vào làm việc; không dùng thuốc ảnh hưởng enzym CYP2E1 (acetaminophen, isoniazid, disulfiram, chlormethiazole, chloroquine); không uống rượu bia trong 48 giờ; đồng ý tham gia. Đo mẫu cá nhân trong ca làm việc; lấy máu toàn phần và nước tiểu cuối ca ngày cuối tuần để phân tích BTEX, chất chuyển hóa, công thức máu, mRNA và DNA.
Nhóm không tiếp xúc (Đối chứng) 45 người (chọn từ 70 công nhân may tại Hải Dương) Công nhân may không tiếp xúc với dung môi hữu cơ; tuổi nghề $\ge 3$ năm; đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn sức khỏe, thuốc men và kiêng rượu bia tương tự nhóm tiếp xúc. Lấy máu toàn phần và nước tiểu cuối ca ngày cuối tuần để xét nghiệm các chỉ số sinh học, công thức máu, mRNA và DNA đối chứng.

Dụng cụ, thiết bị và kỹ thuật phân tích

  • Phân tích BTEX môi trường (mẫu cá nhân): Sử dụng bơm lấy mẫu cá nhân Gilian LFS-113DC (Mỹ) hút không khí tại vùng hô hấp với lưu lượng 0,2 L/phút qua ống than hoạt tính trong suốt ca làm việc. Mẫu được giải hấp bằng $\text{CS}_2$ và phân tích trên máy sắc ký khí khối phổ GC/MS (Agilent G3440A-GC7890A) theo tiêu chuẩn NIOSH 1501:2003.
  • Phân tích BTEX trong máu và nước tiểu: Hút 2 mL máu chống đông vào lọ thủy tinh 20 mL đóng nắp cao su kín; 2 mL nước tiểu trộn 1 g NaCl trong lọ 20 mL kín. Phân tích trên hệ thống GC/MS kết nối bộ hóa hơi mẫu tự động theo tiêu chuẩn NIOSH 8007:2013 và quy trình của Janasik.
  • Phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX trong nước tiểu:
    • TTMA: Chiết pha rắn qua cột SPE-SAX, rửa giải bằng axit acetic 10%, đo trên hệ thống LC/MS (Agilent) ở bước sóng 147/97 nm.
    • O-cresol: Thủy phân mẫu bằng HCl ở $100^\circ\text{C}$ trong 30 phút, chiết lỏng-lỏng bằng isopropyl ete, đo trên hệ thống GC/FID (Agilent) theo NIOSH 8321.
    • mHA, MA và PGA: Pha loãng mẫu với pha động TBAB/$\text{KH}_2\text{PO}_4$, lọc màng 0,2 $\mu\text{m}$, phân tích trên hệ thống HPLC đầu dò DAD ở bước sóng 225 nm theo NIOSH 8301:2003.
    • Nồng độ các chất chuyển hóa được hiệu chỉnh theo nồng độ Creatinin niệu.
  • Phân tích công thức máu: Sử dụng máy phân tích huyết học tự động Sysmex 1000i (Nhật Bản) dựa trên nguyên lý dòng chảy tế bào kết hợp laser bán dẫn.
  • Phân tích sinh học phân tử:
    • Tách chiết DNA và PCR giải trình tự promoter CYP2E1: Tách DNA từ máu ngoại vi bằng kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific). Đoạn promoter 563 bp (nucleotide 3370 đến 3933) được khuếch đại bằng phản ứng PCR (chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ 4 phút; 30 chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ 45 giây, $63^\circ\text{C}$ 60 giây, $72^\circ\text{C}$ 120 giây; $72^\circ\text{C}$ 5 phút) với cặp mồi Promoter 1F (5'-AAGCCAAGGCTTCAATTTCA-3') và Promoter 1R (5'-CATGAGTGAAGAGT-3'). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit và giải trình tự nucleotide tại FirstBASE (Singapore).
    • Tách chiết RNA và Real-time RT-qPCR: Tách RNA tổng số bằng Total RNA Purification Kit (Norgen, Canada); tổng hợp cDNA bằng First Strand cDNA Synthesis Kit. Mức biểu hiện mRNA trên exon 7 của gen CYP2E1 (sản phẩm 187 bp) được định lượng bằng Real-time PCR (hóa chất TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR, Enzynomics) trên máy StepOne (Applied Biosystems) với cặp mồi CYP2E1FL1 (5'-ACCTGCCCCATGAAGCAACC-3'), CYP2E1R1 (5'-GAAACAACTCCATGCGAGCC-3') và gen nội chuẩn $\beta$-actin (sản phẩm 184 bp, cặp mồi $\beta$-actin F/R).
  • Phân tích thống kê: Xử lý số liệu bằng các thuật toán thống kê sinh học, kiểm định sự khác biệt giữa các nhóm, phân tích hồi quy logistic đơn biến và đa biến, đánh giá hệ số tương quan Pearson/Spearman.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các khái niệm về dung môi hữu cơ và các đặc tính lý hóa của từng chất trong nhóm BTEX (benzen: nhiệt độ sôi $80{,}1^\circ\text{C}$, tỷ trọng 0,8786; toluen: nhiệt độ sôi $110{,}6^\circ\text{C}$, tỷ trọng 0,8669; ethylbenzen: nhiệt độ sôi $136^\circ\text{C}$, tỷ trọng 0,867; xylen: nhiệt độ sôi $138{,}5^\circ\text{C}$, tỷ trọng 0,864). Chương này mô tả chi tiết đường xâm nhập (chủ yếu qua hô hấp và một phần qua da), đường chuyển hóa và đào thải của BTEX qua nước tiểu.

Chương 1 trình bày cơ sở lý luận của giám sát sinh học, định nghĩa các trạng thái phơi nhiễm, thấm nhiễm và nhiễm độc nghề nghiệp, đồng thời tổng hợp các chỉ số giới hạn sinh học theo quy định quốc tế (TTMA $\le 0{,}5\text{ mg/g creatinin}$; O-cresol $\le 0{,}3\text{ mg/g creatinin}$; MA + PGA $\le 0{,}15\text{ g/g creatinin}$; mHA $\le 1{,}5\text{ g/g creatinin}$).

Chương này phân tích sâu về cấu trúc gen CYP2E1, cơ chế điều hòa biểu hiện gen thông qua vùng promoter, khái niệm đa hình đơn nucleotide (SNP) và tổng quan các nghiên cứu trong nước, quốc tế về tác động của dung môi hữu cơ đến hệ huyết học và mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chọn mẫu, tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ cho 73 đối tượng nhóm tiếp xúc và 45 đối tượng nhóm đối chứng. Chương này chi tiết hóa toàn bộ danh mục hóa chất chuẩn, sinh phẩm (kit tách chiết DNA, RNA, enzyme Taq polymerase, mồi PCR) và thiết bị phân tích (bơm lấy mẫu cá nhân Gilian LFS-113DC, GC/MS Agilent 7890A, LC/MS, HPLC đầu dò DAD, máy huyết học Sysmex 1000i, máy StepOne Real-time PCR).

Quy trình thu thập, bảo quản mẫu sinh học (máu tĩnh mạch chia 3 ống chống đông EDTA, nước tiểu bảo quản $-80^\circ\text{C}$ rã đông một lần) và các bước xử lý mẫu (chiết SPE-SAX, thủy phân axit, chiết lỏng-lỏng) được trình bày theo quy chuẩn kỹ thuật.

Chương 2 cũng nêu rõ các cặp mồi dùng trong nghiên cứu, chu trình nhiệt PCR, công thức tính giá trị giới hạn tiếp xúc hỗn hợp $a$ của ACGIH và các nguyên tắc đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Tên cặp mồi Trình tự mồi ($5' \rightarrow 3'$) Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) Kích thước sản phẩm (bp) Mục đích sử dụng
Promoter 1F
Promoter 1R		 AAGCCAAGGCTTCAATTTCA
CATGAGTGAAGAGT		 $56{,}1^\circ\text{C}$
$55{,}3^\circ\text{C}$		 563 bp Khuếch đại vùng promoter gen CYP2E1 (từ nucleotide 3370 đến 3933) để giải trình tự tìm đa hình SNP.
CYP2E1FL1
CYP2E1R1		 ACCTGCCCCATGAAGCAACC
GAAACAACTCCATGCGAGCC		 $62{,}5^\circ\text{C}$
$60{,}5^\circ\text{C}$		 187 bp Khuếch đại đoạn gen trên exon 7 của gen CYP2E1 trong phân tích Real-time RT-qPCR.
$\beta$-actin F
$\beta$-actin R		 CAACTCCATCATGAAGTGTGAC
CCACACGGAGTACTTGCGCTC		 $60{,}3^\circ\text{C}$
$65{,}2^\circ\text{C}$		 184 bp Khuếch đại gen nội chuẩn $\beta$-actin trong phân tích Real-time RT-qPCR.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và biện luận qua 8 nội dung chính:

1. Nồng độ BTEX mẫu cá nhân và giới hạn tiếp xúc hỗn hợp

Phân tích mẫu cá nhân tại 7 vị trí lao động (nguyên liệu, khuấy, nghiền cán, pha sơn, đóng hộp, kiểm tra chất lượng, kỹ thuật) tại 3 công ty sơn cho thấy sự ô nhiễm đồng thời của cả 4 chất. Kết quả tính toán theo công thức giới hạn tiếp xúc hỗn hợp cho thấy có tới 82,19% số công nhân nhóm tiếp xúc có giá trị $a > 1$ (vượt tiêu chuẩn cho phép theo quy định của ACGIH).

Chỉ tiêu phân tích Nồng độ trung bình trong môi trường Giới hạn cho phép ($m_i$) Tỷ lệ vượt tiêu chuẩn cá nhân
Benzen Đo tại các công đoạn sản xuất $1{,}6\text{ mg/m}^3$ Xuất hiện tồn dư trong môi trường xưởng sơn
Toluen Chiếm tỷ trọng cao trong pha dung môi $75\text{ mg/m}^3$ Vượt giới hạn ở các vị trí khuấy, pha sơn
Ethylbenzen Phát hiện trong thành phần xylen $87\text{ mg/m}^3$ Ghi nhận nồng độ cao ở công đoạn nghiền cán
Xylen Dung môi chính trong sản xuất sơn $343\text{ mg/m}^3$ Tỷ lệ ô nhiễm cao tại khu vực pha chế
Hỗn hợp BTEX ($a$) $a = \sum (C_i / m_i)$ $a \le 1$ 82,19% đối tượng có giá trị $a > 1$

2. Nồng độ BTEX trong máu và nước tiểu

Nồng độ trực tiếp của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen trong máu và nước tiểu của nhóm công nhân tiếp xúc đều cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng, phản ánh tình trạng dung môi hữu cơ đã vượt qua hàng rào hô hấp và thấm nhiễm vào hệ tuần hoàn.

3. Kết quả phân tích các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu

Nồng độ các chất chuyển hóa TTMA, O-cresol, mHA, MA và PGA trong nước tiểu nhóm tiếp xúc đều tăng cao rõ rệt so với nhóm chứng. Tỷ lệ đối tượng có nồng độ chất chuyển hóa vượt ngưỡng giới hạn sinh học (BEI) chiếm tỷ lệ đáng kể ở các công đoạn trực tiếp như pha sơn, khuấy và đóng hộp.

4. Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1

Kết quả định lượng Real-time RT-qPCR cho thấy mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở nhóm tiếp xúc cao gấp 10,47 lần so với nhóm không tiếp xúc, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($P < 0{,}01$).

Phân tích phân nhóm theo tuổi đời (20–30 tuổi, 31–40 tuổi, 41–50 tuổi, trên 50 tuổi) và tuổi nghề (3–10 năm, 11–20 năm, 21–30 năm, trên 30 năm) cho thấy mức biểu hiện mRNA CYP2E1 có xu hướng gia tăng theo thâm niên tiếp xúc với dung môi hữu cơ.

Mô hình hồi quy logistic đơn biến xác nhận mức độ phơi nhiễm BTEX là yếu tố tác động chính làm tăng biểu hiện phiên mã của gen CYP2E1.

5. Mối tương quan giữa nồng độ BTEX môi trường và các chỉ số sinh học

Phân tích tương quan chỉ ra mối tương quan thuận, tuyến tính giữa nồng độ từng chất (benzen, toluen, ethylbenzen, xylen) trong mẫu cá nhân với nồng độ của chúng trong máu, nước tiểu và nồng độ các chất chuyển hóa tương ứng.

Đặc biệt, giá trị tiếp xúc hỗn hợp $a$ của nhóm BTEX có mối tương quan thuận tuyến tính chặt chẽ với mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1.

6. Biến đổi nucleotide trên đoạn promoter gen CYP2E1

Giải trình tự đoạn promoter 563 bp (vị trí 3370 đến 3933) đã phát hiện các điểm đa hình nucleotide bao gồm:

  • Điểm đa hình 3739 G>C (tương ứng alen G và alen C).
  • Điểm đa hình 3620 C>T (tương ứng alen C và alen T).
  • Điểm đa hình 3519 T>G (tương ứng alen T và alen G).
  • Điểm đa hình 3468 T>A (tương ứng alen T và alen A).

Tác giả đã xác định tần số các alen, tần số kiểu gen trong quần thể nghiên cứu và phân tích mối liên quan giữa các kiểu gen đa hình này với mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở nhóm tiếp xúc.

7. Ảnh hưởng của BTEX đến các dòng tế bào máu và tình trạng thiếu máu

Phân tích công thức máu ghi nhận sự suy giảm đáng kể ở cả ba dòng tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu) ở nhóm tiếp xúc so với nhóm đối chứng. Tỷ lệ công nhân bị thiếu máu (đánh giá qua nồng độ Hemoglobin theo tiêu chuẩn WHO: $\text{Hb} < 12\text{ g/dL}$) ở nhóm tiếp xúc cao hơn nhóm chứng.

Luận án đã phân tích mối liên quan giữa tần số alen và tần số kiểu gen của các điểm đa hình promoter CYP2E1 với nguy cơ suy giảm tế bào máu và tình trạng thiếu máu do ảnh hưởng của dung môi hữu cơ.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Đánh giá đồng thời mức độ phơi nhiễm hỗn hợp BTEX: Luận án là công trình nghiên cứu tại Việt Nam thực hiện đánh giá đồng thời mức độ tiếp xúc môi trường cá nhân và mức độ thấm nhiễm sinh học của cả 4 chất trong nhóm BTEX ở người lao động ngành sản xuất sơn. Kết quả xác định có 82,19% đối tượng nghiên cứu có giá trị giới hạn tiếp xúc hỗn hợp vượt tiêu chuẩn cho phép ($a > 1$).
  2. Xác định sự cảm ứng biểu hiện gen CYP2E1 ở mức độ phân tử: Luận án chứng minh người lao động tiếp xúc nghề nghiệp với nhóm BTEX có mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 cao gấp 10,47 lần so với nhóm không tiếp xúc (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê).
  3. Thiết lập mối tương quan giữa phơi nhiễm hỗn hợp và cảm ứng phiên mã: Phát hiện mối tương quan tuyến tính giữa tổng giá trị nồng độ tiếp xúc hỗn hợp BTEX trong không khí cá nhân với mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1. Đây là cơ sở khoa học để đề xuất sử dụng chỉ số mRNA của gen CYP2E1 làm chỉ dấu sinh học mới trong giám sát người lao động tiếp xúc đồng thời với nhóm dung môi BTEX.
  4. Cung cấp dữ liệu về đa hình promoter CYP2E1 và hệ huyết học: Luận án đã giải trình tự đoạn promoter 563 bp của gen CYP2E1, xác định các điểm đa hình đơn nucleotide (3739 G>C, 3620 C>T, 3519 T>G, 3468 T>A), đồng thời phân tích mối liên quan giữa các kiểu gen biến thể với mức độ biểu hiện mRNA và tình trạng suy giảm các dòng tế bào máu.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Về mặt chính sách và quản lý y tế: Đề xuất Bộ Y tế bổ sung quy định về các chỉ số giám sát môi trường tổng hợp và chỉ số giám sát sinh học đối với người lao động phơi nhiễm đồng thời với nhóm dung môi hữu cơ BTEX; xem xét đưa chỉ số biểu hiện mRNA gen CYP2E1 vào quy trình giám sát sinh học chuyên sâu.
  • Về mặt kỹ thuật và an toàn lao động: Các cơ sở sản xuất sơn cần cải tiến hệ thống thông gió, chụp hút cục bộ tại các vị trí phát sinh hơi dung môi nồng độ cao (khuấy, nghiền cán, pha sơn, đóng hộp); trang bị đầy đủ phương tiện bảo vệ cơ quan hô hấp đạt chuẩn cho công nhân.
  • Về y tế cơ sở: Thực hiện khám sức khỏe định kỳ có xét nghiệm công thức máu toàn phần (chú trọng số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và chỉ số Hb) nhằm phát hiện sớm các biểu hiện ức chế tủy xương và thiếu máu nghề nghiệp do dung môi hữu cơ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Cỡ mẫu nghiên cứu còn giới hạn ở 73 công nhân nhóm tiếp xúc tại 3 doanh nghiệp sản xuất sơn trên địa bàn Hà Nội và 45 công nhân may đối chứng tại Hải Dương do điều kiện tuyển chọn đối tượng đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt (không dùng thuốc ảnh hưởng enzym, kiêng rượu bia, thâm niên $\ge 3$ năm).
  • Phạm vi phân tích biến đổi gen tập trung vào đoạn promoter kích thước 563 bp (từ nucleotide 3370 đến 3933) và định lượng mRNA trên vùng exon 7 của gen CYP2E1, chưa khảo sát toàn bộ chiều dài cấu trúc gen và các vùng intron khác.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô nghiên cứu trên các nhóm ngành công nghiệp khác có sử dụng dung môi hữu cơ như sản xuất da giày, in ấn, sản xuất linh kiện điện tử trên nhiều địa bàn khác nhau.
  • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế biểu sinh (epigenetics) như mức độ methyl hóa vùng promoter gen CYP2E1 và theo dõi dọc sự biến đổi biểu hiện mRNA sau khi áp dụng các biện pháp cải thiện môi trường lao động.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Cung cấp tài liệu tham khảo chuyên ngành Hóa sinh học, Sinh học phân tử, Độc chất học môi trường và Y học lao động; tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật phân tích sắc ký (GC/MS, LC/MS, HPLC) và quy trình Real-time RT-qPCR, giải trình tự gen.
  • Đối với cán bộ an toàn vệ sinh lao động và doanh nghiệp: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực chứng về mức độ ô nhiễm hơi dung môi tại từng công đoạn sản xuất sơn để thiết kế hệ thống xử lý khí thải và trang bị bảo hộ lao động phù hợp.
  • Đối với cơ quan quản lý và hoạch định chính sách: Cung cấp luận cứ khoa học để Bộ Y tế, Viện Sức khỏe Nghề nghiệp và Môi trường xây dựng, bổ sung các tiêu chuẩn vệ sinh lao động và hướng dẫn chẩn đoán bệnh nghề nghiệp do phơi nhiễm hỗn hợp dung môi hữu cơ.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ người lao động có mức tiếp xúc vượt tiêu chuẩn cho phép với nhóm BTEX trong nghiên cứu là bao nhiêu?

Theo kết quả phân tích mẫu khí cá nhân tại 7 vị trí làm việc ở 3 nhà máy sản xuất sơn, có 82,19% người lao động nhóm tiếp xúc có giá trị giới hạn tiếp xúc hỗn hợp vượt tiêu chuẩn cho phép ($a > 1$) theo công thức đánh giá phơi nhiễm hỗn hợp của Hội nghị các nhà Vệ sinh Công nghiệp Chính phủ Hoa Kỳ (ACGIH).

2. Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở nhóm công nhân tiếp xúc biến đổi như thế nào so với nhóm không tiếp xúc?

Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 (định lượng qua kỹ thuật Real-time RT-qPCR trên exon 7, chuẩn hóa theo gen nội chuẩn $\beta$-actin) ở nhóm công nhân trực tiếp sản xuất sơn cao gấp 10,47 lần so với nhóm công nhân may không tiếp xúc, sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê ($P < 0{,}01$).

3. Những sản phẩm chuyển hóa nào trong nước tiểu được phân tích để đánh giá mức độ thấm nhiễm của từng chất trong nhóm BTEX?

Nghiên cứu định lượng 5 sản phẩm chuyển hóa đặc hiệu trong nước tiểu:

  • Axit t,t-muconic (TTMA) đại diện cho quá trình chuyển hóa của Benzen (đo bằng LC/MS).
  • O-cresol đại diện cho quá trình chuyển hóa của Toluen (đo bằng GC/FID).
  • Axit mandelic (MA) và axit phenylglyoxylic (PGA) đại diện cho quá trình chuyển hóa của Ethylbenzen (đo bằng HPLC).
  • Axit methylhippuric (mHA) đại diện cho quá trình chuyển hóa của Xylen (đo bằng HPLC).

4. Tác giả đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử nào để phát hiện các biến đổi trên vùng promoter của gen CYP2E1?

Tác giả tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi bằng kit GeneJET, sử dụng cặp mồi đặc hiệu Promoter 1F và Promoter 1R để khuếch đại đoạn DNA kích thước 563 bp (từ nucleotide 3370 đến 3933) trên vùng promoter của gen CYP2E1 bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và giải trình tự nucleotide trực tiếp tại FirstBASE (Singapore) để xác định các điểm đa hình đơn nucleotide (3739 G>C, 3620 C>T, 3519 T>G, 3468 T>A).

5. Công thức đánh giá nồng độ tiếp xúc hỗn hợp của nhóm BTEX được áp dụng trong luận án như thế nào?

Luận án áp dụng công thức của ACGIH: $$a = \frac{C_{\text{benzen}}}{1{,}6} + \frac{C_{\text{toluen}}}{75} + \frac{C_{\text{ethylbenzen}}}{87} + \frac{C_{\text{xylen}}}{343}$$ Trong đó $C_i$ là nồng độ thực tế đo được tại vùng thở của công nhân ($\text{mg/m}^3$) và các mẫu số lần lượt là giới hạn tiếp xúc cho phép của từng chất theo tiêu chuẩn vệ sinh lao động. Nếu tổng giá trị $a \le 1$ là đạt tiêu chuẩn, nếu $a > 1$ là vượt giới hạn tiếp xúc cho phép.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Hiền đã xác định thực trạng phơi nhiễm và thấm nhiễm hỗn hợp dung môi hữu cơ BTEX ở người lao động tại một số cơ sở sản xuất sơn, với 82,19% đối tượng có mức tiếp xúc vượt tiêu chuẩn cho phép. Nghiên cứu đã chứng minh nhóm chất BTEX gây cảm ứng làm tăng mức biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 lên 10,47 lần ở nhóm tiếp xúc so với nhóm chứng, đồng thời mức tăng này có mối tương quan thuận tuyến tính với tổng nồng độ tiếp xúc hỗn hợp BTEX. Công trình đã xác định các điểm đa hình đơn nucleotide trên đoạn promoter 563 bp của gen CYP2E1 và làm rõ ảnh hưởng của BTEX gây suy giảm các dòng tế bào máu ngoại vi. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học thực tiễn để đề xuất sử dụng chỉ số mRNA của gen CYP2E1 làm chỉ dấu sinh học mới trong việc giám sát sức khỏe nghề nghiệp cho người lao động tiếp xúc với nhóm dung môi hữu cơ.