Chương 1. Vi khuẩn lactic 1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) có thể được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram dương, gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat [26]. Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa bị chua các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobacteriaceae (ngày nay gọi là Lactobacterium).
Lister lần đầu tiên phân lập được một loài vi khuẩn đặt tên là Bacterium lactis (hay còn gọi là Lactococcus lactis) và ngành công nghiệp lên men nhờ VK lactic đã được hình thành từ năm 1881. Những nghiên cứu quan trọng trong sự phân loại VK lactic đã cho thấy có nét tương tự giữa VK lactic từ sữa chua và VK lactic trong các sản phẩm chứa acid lactic khác như rượu vang, các sản phẩm muối chua và các loại VK lactic có ích trong đường ruột [60]. LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [26]. Có 2 cách chính để phân loại LAB.
Cách phân loại thứ nhất dựa trên hình thái, chia LAB làm 2 nhóm chính là trực khuẩn và cầu khuẩn. Cách phân loại thứ 2 dựa trên kiểu lên men lactic, chia LAB làm 2 nhóm chính là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình (homofermentative LAB) và nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentative LAB) [26]. Lên men đồng hình Trong lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu là acid lactic, chiếm khoảng 90 - 98%, các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ. Quá trình phân giải glucose, acid lactic được tạo ra theo con đường EMP (con đường Embden - Mayerhoff - Parnas) [5].
Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình là các chi Streptococcus và Lactococcus [30]. Lên men dị hình: Trong lên men dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành, bên cạnh Khoá luận Kinh tế 3 acid lactic còn có một lượng đáng kể các sản phẩm khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol, CO2 [26] [30] [52]. Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình là chi Leuconostoc và một số loài thuộc chi Lactobacillus như các loài L. kefir… [5] [30] Vi khuẩn lactic có thể tồn tại ở dạng các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi.
Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá đa dạng: có thể là hình cầu hoặc hình que, đường kính các loại cầu khuẩn lactic thường từ 0,5 - 1,5µm, trực khuẩn 1 - 8µm. LAB hầu hết không di động, catalase âm tính, tỉ lệ G+C thấp dưới 50% [52]. LAB là các vi khuẩn ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài dao động từ 28 đến 45oC [5]. Nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp từ 4,5 - 6,8; pH tối ưu của chúng là từ 3,5 - 5.
LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn. Nguồn carbon là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh bột như L. LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, rau quả…), thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [52]. LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men.
Các vi khuẩn lactic sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra acid lactic và các loại acid hữu cơ khác làm giảm pH, chống lại hiện tượng thối rữa rau quả, thịt cá, sữa; đồng thời làm tăng hương vị, tăng thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn [26]. Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với rất nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [52] 1. Loài Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus, Khoá luận Kinh tế 4 là chi lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [24].
acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9µm, dài 1,5 - 6,0µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC [2] [12] [51]. acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật, 8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [8]. acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng như tổng hợp các vitamin.
Ngoài ra, chúng có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin [8]. acidophilus ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi khuẩn gây bệnh [8] [12]. Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh. acidophilus còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất định đến sự lão hóa [8] [12].
acidophilus tạo ra môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh vật lên men đường ruột và ngược lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm. acidophilus cũng có tác dụng hoạt hóa đại thực bào nhưng mức độ yếu hơn Bifidobacterium bifidum [38]. Tuy nhiên, khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men (trong bảo quản), nồng độ oxy hòa tan (oxy khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ (trong bảo quản), độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô.
Trong đó, nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự sống sót của L. Do đó, sau thời gian bảo quản, lượng L. acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [32]. acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu hóa như Antibio, Lacbio pro, Kidlac… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa Khoá luận Kinh tế 5 do dùng kháng sinh dài ngày, hoặc các trường hợp tiêu chảy, đầy bụng, khó tiêu, trẻ kém ăn, chậm lớn.1: Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.
Tổng quan về vi nang hóa probiotic 1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic a. Khái niệm Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6].
Đặc điểm Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp thành bảo vệ vững chắc. Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng. [32] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian… Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào. Vi nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [59].
Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang là một đặc điểm quan trọng. Màng phải có độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết. Kích thước hạt vi nang Khoá luận Kinh tế 6 cũng là đặc điểm cần lưu ý. Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau.
Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó. Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ dàng hơn. Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt… [6] [32]. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa a.
Ưu điểm Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng lớn tế bào sống. Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt. Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các chất ức chế trong môi trường lên men. Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [16] [59].
Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại. Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [16] [59]. Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau. Vi nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [6] [59].