Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever) bằng hệ thống baculovirus

• Tác giả: Xengphavone Khonmany
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Tố Nga
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein E2 của vi rút dịch tả lợn cổ điển (Classical Swine Fever) bằng hệ thống Baculovirus
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I1 MỞ ĐẦU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.4. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Các loại tế bào
• 2.4.2. Môi trường cho nuôi cấy tế bào
• 2.4.3. Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm dùng trong phản ứng RT-PCR
• 2.4.4. Hóa chất dùng trong điện di
• 2.4.5. Vật liệu dùng để tách dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp bằng hệ thống Baculovirus
• 2.4.6. Môi trường, sinh phẩm, máy móc, dụng cụ dùng trong phản ứng Western blot
• 2.4.7. Các vật liệu khác
• 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.5.1. Phương pháp nhân chủng vi rút DTL theo phương pháp thường quy của Viện Thú y
• 2.5.2. Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút bằng RT– PCR, xác định TCID50 của vi rút theo phương pháp thường quy của Viện Thú y
• 2.5.3. Thiết kế mồi đặc hiệu gen E2 và nhân gen và tinh sạch DNA bằng phương pháp thường quy
• 2.5.4. Tạo dòng protein mã hóa E2 bằng kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất
• 2.5.5. Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
• 2.5.6. Tạo bacmid và chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE tạo Baculovirus tái tổ hợp theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất (bac-to -bac Expression System), quy trình công nghệ của Viện Thú y Nhật Bản
• 2.5.7. Phương pháp PCR phát hiện nhanh Baculovirus tái tổ hợp mang Protein E2 trên tế bào côn trùng (theo công bố của Barbara Malitscheck et al.)
• 2.5.8. Phương pháp IPMA sử dụng tế bào côn trùng phát hiện protein E2 tái tổ hợp
• 2.5.9. Phương pháp Western Blot phát hiện protein E2 tái tổ hợp
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nhân chủng vi rút DTL, kiểm tra các đặc tính vi rút của chủng gốc
• 3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào
• 3.3. Kết quả gây nhiễm vi rút DTL trên dòng tế bào PK15a
• 3.4. Kiểm tra đặc tính chủng gốc, xác định sự có mặt của vi rút DTL bằng phản ứng RT-PCR phát hiện đoạn gene noncoding E2 của vi rút DTL phân lập trên tế bào PK15a
• 3.5. Thiết kế mồi đặc hiệu và khuếch đại protein E2 của vi rút dịch tả lợn bằng phương pháp RT-PCR
• 3.6. Tạo dòng protein mã hóa E2 trong vector tách dòng pFastBac, kiểm tra trình tự khung protein biểu hiện
• 3.7. Tạo dòng gen E2 của vi rút dịch tả lợn trong véc tơ tách dòng pFastBac1/NT- TOPO
• 3.8. Tạo Baculovirus tái tổ hợp sử dụng tế bào côn trùng
• 3.9. Kiểm tra khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp bằng phương pháp Immuno Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) trên tế bào côn trùng và Western Blot
• 3.10. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein E2 tái tổ hợp bằng hệ thống baculovirus
• 3.11. Kết quả thực hiện phương pháp Immuno - Peroxidase Monolayer Assay (IPMA) đối với mẫu huyết thanh thực địa
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein E2 Virus CSFV 55 ký tự

Bệnh dịch tả lợn cổ điển (CSFV) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi lợn, gây ra thiệt hại kinh tế to lớn do tỷ lệ lây lan và tử vong cao. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán và phòng ngừa hiệu quả là vô cùng quan trọng. Trong đó, protein E2 của virus CSFV đóng vai trò then chốt trong quá trình xâm nhập tế bào và kích thích đáp ứng miễn dịch. Nghiên cứu biểu hiện protein E2 tái tổ hợp là hướng đi đầy hứa hẹn để tạo ra các công cụ chẩn đoán và vaccine dịch tả lợn cổ điển thế hệ mới. Hệ thống baculovirus được sử dụng rộng rãi để biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào côn trùng, mang lại hiệu quả cao và chi phí hợp lý. Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển bằng hệ thống baculovirus, mở ra tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán và phòng bệnh.

1.1. Tầm quan trọng của Protein E2 trong Virus CSFV

Protein E2 là một glycoprotein cấu trúc quan trọng của virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV), đóng vai trò trung tâm trong quá trình gắn kết và xâm nhập vào tế bào vật chủ. Nó cũng là kháng nguyên chính kích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở lợn. Do đó, protein E2 là mục tiêu lý tưởng cho việc phát triển vaccine dịch tả lợn cổ điển và các xét nghiệm chẩn đoán. Nghiên cứu về cấu trúc protein E2 và chức năng protein E2 là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của virus CSFV.

1.2. Ưu điểm của Hệ Thống Baculovirus trong Biểu Hiện Protein

Hệ thống baculovirus là một hệ thống biểu hiện protein mạnh mẽ và linh hoạt, sử dụng vector baculovirus để đưa gen mục tiêu vào tế bào côn trùng. Hệ thống này có nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng biểu hiện protein với số lượng lớn, khả năng tạo ra các protein có cấu trúc phức tạp và khả năng biểu hiện protein ở tế bào eukaryote với các sửa đổi sau dịch mã phù hợp. Nuôi cấy tế bào côn trùng cũng tương đối dễ dàng và chi phí thấp, làm cho hệ thống baculovirus trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho việc biểu hiện protein quy mô lớn.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Protein E2 Virus Dịch Tả Lợn 58 ký tự

Mặc dù protein E2 là mục tiêu đầy hứa hẹn cho việc phát triển vaccine dịch tả lợn cổ điển, việc biểu hiện protein này một cách hiệu quả và ổn định vẫn còn nhiều thách thức. Protein E2 có xu hướng tạo thành các tập hợp không tan, gây khó khăn cho quá trình tinh sạch protein. Hơn nữa, protein E2 có thể bị glycosyl hóa không đồng nhất, ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch. Cần có các phương pháp tối ưu hóa để cải thiện hiệu quả biểu hiện protein, độ tan và tính ổn định của protein E2 tái tổ hợp. Việc cải tiến hệ thống baculovirus cũng là một hướng đi quan trọng để giải quyết những thách thức này.

2.1. Vấn đề về Độ Tan và Tính Ổn Định của Protein E2

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc biểu hiện protein E2 là vấn đề về độ tan và tính ổn định. Protein E2 có xu hướng tạo thành các tập hợp không tan trong tế bào côn trùng, gây khó khăn cho quá trình tinh sạch protein và giảm hiệu quả biểu hiện protein. Cần có các biện pháp để tăng độ tan và tính ổn định của protein E2, chẳng hạn như sử dụng các chất phụ gia, thay đổi điều kiện nuôi cấy tế bào côn trùng hoặc thiết kế các biến thể protein tái tổ hợp có độ tan cao hơn.

2.2. Ảnh hưởng của Glycosyl Hóa đến Hoạt Tính Sinh Học

Protein E2 là một glycoprotein, có nghĩa là nó được gắn với các phân tử đường (glycosyl hóa). Glycosyl hóa có thể ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng và hoạt tính sinh học của protein E2. Sự glycosyl hóa không đồng nhất có thể dẫn đến sự thay đổi trong khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch và khả năng gắn kết với các thụ thể trên tế bào vật chủ. Cần có các phương pháp để kiểm soát glycosyl hóa của protein E2 tái tổ hợp, chẳng hạn như sử dụng các dòng tế bào côn trùng có khả năng glycosyl hóa đồng nhất hơn hoặc loại bỏ các vị trí glycosyl hóa.

III. Phương Pháp Biểu Hiện Protein E2 Bằng Hệ Thống Baculovirus 59 ký tự

Nghiên cứu này sử dụng hệ thống baculovirus để biểu hiện protein E2 của virus dịch tả lợn cổ điển. Gen mã hóa protein E2 được khuếch đại từ chủng virus CSFV VN91 và được chèn vào vector baculovirus. Vector baculovirus tái tổ hợp được chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE, nơi protein E2 được biểu hiện. Protein tái tổ hợp được tinh sạch protein và kiểm tra hoạt tính sinh học bằng các xét nghiệm ELISA và phân tích Western blot. Kết quả cho thấy protein E2 tái tổ hợp có khả năng nhận diện kháng thể đặc hiệu kháng virus dịch tả lợn cổ điển.

3.1. Thiết Kế Mồi và Khuếch Đại Gen E2 từ Virus CSFV

Quá trình biểu hiện protein E2 bắt đầu bằng việc thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại gen mã hóa protein E2 từ chủng virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV) VN91. Mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công bố của chủng VN91. Phản ứng RT-PCR được sử dụng để khuếch đại gen E2, và sản phẩm PCR được tinh sạch để sử dụng trong các bước tiếp theo.

3.2. Tạo Vector Baculovirus Tái Tổ Hợp và Chuyển Nạp

Gen E2 đã được khuếch đại được chèn vào vector baculovirus pFastBac1/NT-TOPO. Vector baculovirus tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sử dụng hệ thống Bac-to-Bac Expression System. Vector baculovirus tái tổ hợp sau đó được chuyển nạp vào tế bào côn trùng SF21AE để tạo ra baculovirus tái tổ hợp mang gen E2.

3.3. Nuôi Cấy Tế Bào Côn Trùng và Biểu Hiện Protein E2

Tế bào côn trùng SF21AE được nuôi cấy tế bào côn trùng trong môi trường phù hợp. Sau khi tế bào đạt mật độ thích hợp, chúng được nhiễm baculovirus tái tổ hợp. Tế bào được ủ trong điều kiện thích hợp để biểu hiện protein E2. Sau một thời gian ủ, tế bào được thu hoạch và protein E2 được chiết xuất.

IV. Đánh Giá Biểu Hiện Protein E2 Tái Tổ Hợp Bằng Western Blot 57 ký tự

Để xác nhận sự biểu hiện protein E2 tái tổ hợp, phân tích Western blot đã được thực hiện. Mẫu protein từ tế bào côn trùng nhiễm baculovirus tái tổ hợp được điện di trên gel polyacrylamide và chuyển sang màng nitrocellulose. Màng được ủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng protein E2. Kết quả cho thấy một dải băng có kích thước phù hợp với protein E2, xác nhận sự biểu hiện protein E2 tái tổ hợp trong tế bào côn trùng. Phân tích Western blot là một phương pháp quan trọng để xác định sự biểu hiện protein và kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể.

4.1. Quy Trình Phân Tích Western Blot Chi Tiết

Quy trình phân tích Western blot bao gồm các bước sau: (1) Chuẩn bị mẫu protein từ tế bào côn trùng nhiễm baculovirus tái tổ hợp. (2) Điện di mẫu protein trên gel polyacrylamide để phân tách các protein dựa trên kích thước. (3) Chuyển protein từ gel sang màng nitrocellulose. (4) Chặn màng để ngăn chặn sự gắn kết không đặc hiệu của kháng thể. (5) Ủ màng với kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng protein E2. (6) Ủ màng với kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. (7) Phát hiện dải băng bằng cách sử dụng chất nền enzyme.

4.2. Kết Quả và Ý Nghĩa của Phân Tích Western Blot

Kết quả phân tích Western blot cho thấy một dải băng có kích thước phù hợp với protein E2, xác nhận sự biểu hiện protein E2 tái tổ hợp trong tế bào côn trùng. Sự hiện diện của dải băng này chứng minh rằng gen E2 đã được biểu hiện thành công trong tế bào côn trùng và protein E2 tái tổ hợp có thể được nhận diện bởi kháng thể đặc hiệu. Kết quả này là một bước quan trọng trong việc phát triển vaccine dịch tả lợn cổ điển và các xét nghiệm chẩn đoán.

V. Ứng Dụng Protein E2 Tái Tổ Hợp Trong Chẩn Đoán CSFV 55 ký tự

Protein E2 tái tổ hợp được sử dụng làm kháng nguyên trong xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus dịch tả lợn cổ điển trong huyết thanh lợn. Xét nghiệm ELISA sử dụng protein E2 tái tổ hợp cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt giữa lợn nhiễm bệnh và lợn đã được tiêm phòng. Ứng dụng của protein E2 tái tổ hợp trong chẩn đoán giúp phát hiện sớm bệnh dịch tả lợn cổ điển, từ đó có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát dịch bệnh kịp thời. Sàng lọc kháng thể bằng protein E2 tái tổ hợp là một công cụ quan trọng trong việc giám sát dịch bệnh.

5.1. Phát Triển Xét Nghiệm ELISA Dựa Trên Protein E2

Xét nghiệm ELISA dựa trên protein E2 tái tổ hợp được phát triển để phát hiện kháng thể kháng virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV) trong huyết thanh lợn. Protein E2 tái tổ hợp được gắn vào đĩa ELISA, và huyết thanh lợn được ủ trên đĩa. Nếu huyết thanh chứa kháng thể kháng CSFV, kháng thể sẽ gắn vào protein E2. Sau đó, kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme được thêm vào để phát hiện kháng thể đã gắn kết.

5.2. Đánh Giá Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu của Xét Nghiệm ELISA

Độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA dựa trên protein E2 tái tổ hợp được đánh giá bằng cách sử dụng một bộ sưu tập huyết thanh lợn đã biết tình trạng nhiễm bệnh. Kết quả cho thấy xét nghiệm ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt giữa lợn nhiễm bệnh và lợn đã được tiêm phòng. Xét nghiệm ELISA này là một công cụ chẩn đoán hữu ích cho việc phát hiện sớm bệnh dịch tả lợn cổ điển.

VI. Tiềm Năng Phát Triển Vaccine Dịch Tả Lợn Từ Protein E2 59 ký tự

Protein E2 tái tổ hợp là một ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển vaccine dịch tả lợn cổ điển thế hệ mới. Protein E2 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở lợn, và vaccine dựa trên protein E2 có thể an toàn hơn so với vaccine sống giảm độc lực truyền thống. Nghiên cứu về hiệu quả bảo vệ của vaccine dựa trên protein E2 đang được tiến hành. Việc sử dụng protein E2 tái tổ hợp trong vaccine dịch tả lợn cổ điển có thể giúp kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả và bền vững.

6.1. Đánh Giá Khả Năng Kích Thích Đáp Ứng Miễn Dịch của E2

Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của protein E2 tái tổ hợp được đánh giá bằng cách tiêm protein E2 vào lợn và theo dõi sự phát triển của kháng thể kháng virus dịch tả lợn cổ điển (CSFV). Kết quả cho thấy protein E2 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, với sự gia tăng đáng kể về nồng độ kháng thể trung hòa virus.

6.2. Nghiên Cứu Hiệu Quả Bảo Vệ của Vaccine Protein E2

Nghiên cứu về hiệu quả bảo vệ của vaccine dựa trên protein E2 đang được tiến hành bằng cách tiêm vaccine vào lợn và sau đó cho chúng tiếp xúc với virus dịch tả lợn cổ điển. Kết quả ban đầu cho thấy vaccine có khả năng bảo vệ lợn khỏi bệnh, với tỷ lệ sống sót cao hơn và giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Tuy nhiên, cần có thêm nghiên cứu để tối ưu hóa công thức vaccine và đánh giá hiệu quả bảo vệ lâu dài.