Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng trevesia palmata

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Hoàng Ngọc Truyền
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Thanh Hương
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng Trevesia palmata
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái quát về cây Đu đủ rừng
• 1.2. Đặc điểm phân loại
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Công dụng của cây Đu đủ rừng
• 1.5. Nano bạc, phương pháp tổng hợp và ứng dụng
• 1.5.1. Khái quát về nano bạc
• 1.5.2. Các phương pháp tổng hợp nano bạc
• 1.5.3. Vai trò của nano bạc tạo ra bằng phương pháp tổng hợp xanh trong y học
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp thu thập và định loại
• 2.4.2. Phương pháp xử lý và thu dịch chiết lá cây Đu đủ rừng
• 2.4.3. Phương pháp tổng hợp phức hệ AgNPs-TrP
• 2.4.4. Xác định tính chất lý hóa của AgNPs-TrP
• 2.4.5. Các phương pháp phân tích đặc tính sinh học chống ung thư của phức hệ AgNPs-TrP
• 2.4.6. Phân tích thống kê
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thu thập, xử lý mẫu
• 3.2. Thu thập mẫu xác định tên khoa học của cây Đu đủ rừng
• 3.3. Kết quả thu dịch chiết
• 3.4. Tổng hợp và xác định tính chất lý hóa của phức hệ AgNPs-TrP
• 3.4.1. Tổng hợp phức hệ AgNPs-TrP
• 3.4.2. Phân tích phổ UV-Vis
• 3.4.3. Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) và phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier FT-IR
• 3.4.4. Phân tích hình dạng, kích thước bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
• 3.5. Ảnh hưởng của phức hệ AgNPs-TrP lên sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45
• 3.6. Ảnh hưởng của phức hệ AgNPs-TrP lên sự sản sinh các gốc oxy hóa tự do (ROS) trong tế bào ung thư
• 3.7. Ảnh hưởng của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện các gen liên quan tới sự sản sinh các gốc tự do (ROS)
• 3.8. Ảnh hưởng của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện các gen liên quan tới sự chết tế bào theo chương trình apoptosis
• 3.8.1. Tác động của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của gen Caspase 8, Caspase khởi động apoptosis
• 3.8.2. Tác động của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của gen Caspase 3, Caspase thực thi apoptosis
• 3.8.3. Tác động của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của gen ức chế apoptosis BCL2
• 3.9. Ảnh hưởng của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của các gen liên quan tới khả năng chống oxy hóa của tế bào
• 3.9.1. Tác động của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của các enzyme xúc tác loại bỏ các gốc tự do superoxyde
• 3.9.2. Tác động của phức hệ AgNPs-TrP lên sự biểu hiện của các enzyme giải độc aldehyd
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc

Nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng đang thu hút sự chú ý của cộng đồng khoa học. Nano bạc được biết đến với khả năng kháng khuẩn và chống ung thư, mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư. Cây đu đủ rừng (Trevesia palmata) chứa nhiều hợp chất sinh học có tiềm năng trong việc hỗ trợ điều trị ung thư. Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây đu đủ rừng và nano bạc

Cây đu đủ rừng thuộc họ Nhân sâm, có nhiều hợp chất sinh học như saponin triterpenoid. Nano bạc có kích thước từ 1 đến 100 nm, mang lại nhiều lợi ích trong y học nhờ khả năng kháng khuẩn và chống ung thư.

1.2. Tác động của nano bạc lên tế bào ung thư

Nghiên cứu cho thấy nano bạc có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư thông qua cơ chế tạo ra các gốc oxy hóa tự do (ROS), dẫn đến apoptosis trong tế bào ung thư.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu nano bạc

Mặc dù nano bạc có nhiều tiềm năng trong điều trị ung thư, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc ứng dụng thực tiễn. Các vấn đề như tính an toàn, hiệu quả và khả năng tương thích sinh học của nano bạc cần được nghiên cứu kỹ lưỡng. Ngoài ra, việc tổng hợp nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng cũng cần được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng và hiệu quả điều trị.

2.1. Tính an toàn của nano bạc trong điều trị ung thư

Nghiên cứu về tính an toàn của nano bạc cho thấy rằng mặc dù có hiệu quả trong việc ức chế tế bào ung thư, nhưng cần đánh giá kỹ lưỡng về độc tính và tác dụng phụ có thể xảy ra.

2.2. Khó khăn trong việc tổng hợp nano bạc từ dịch chiết thực vật

Quá trình tổng hợp nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng có thể gặp khó khăn trong việc kiểm soát kích thước và hình dạng của hạt nano, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

III. Phương pháp tổng hợp nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng

Phương pháp tổng hợp nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng được thực hiện thông qua quy trình tổng hợp xanh. Phương pháp này không chỉ an toàn mà còn hiệu quả trong việc tạo ra các hạt nano với kích thước và hình dạng mong muốn. Việc sử dụng dịch chiết thực vật giúp giảm thiểu các phản ứng độc hại, đồng thời tối ưu hóa quá trình tổng hợp.

3.1. Quy trình tổng hợp nano bạc xanh

Quy trình tổng hợp bắt đầu bằng việc ủ muối bạc AgNO3 với dịch chiết cây đu đủ rừng, sau đó các ion bạc được khử để tạo thành nano bạc. Phương pháp này đơn giản và dễ thực hiện.

3.2. Đặc điểm của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết

Các hạt nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng có kích thước đồng đều và tính chất lý hóa ổn định, giúp nâng cao hiệu quả trong việc ức chế tế bào ung thư.

IV. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc

Kết quả nghiên cứu cho thấy nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cây đu đủ rừng có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45. Các thí nghiệm cho thấy sự gia tăng sản sinh các gốc oxy hóa tự do (ROS) và sự biểu hiện của các gen liên quan đến apoptosis, cho thấy tiềm năng điều trị của nano bạc.

4.1. Ảnh hưởng của nano bạc lên sự tăng sinh tế bào ung thư

Nghiên cứu chỉ ra rằng nano bạc có khả năng làm giảm đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45, mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

4.2. Tác động của nano bạc lên gốc oxy hóa tự do

Sự gia tăng sản sinh các gốc oxy hóa tự do (ROS) trong tế bào ung thư là một trong những cơ chế chính mà nano bạc sử dụng để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu nano bạc trong điều trị ung thư

Nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư của nano bạc từ dịch chiết cây đu đủ rừng đã mở ra nhiều triển vọng trong điều trị ung thư. Các kết quả cho thấy nano bạc không chỉ có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư mà còn có thể được phát triển thành một phương pháp điều trị hiệu quả trong tương lai. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình tổng hợp và đánh giá tính an toàn của nano bạc.

5.1. Triển vọng ứng dụng nano bạc trong y học

Với những kết quả khả quan, nano bạc có thể trở thành một lựa chọn điều trị mới trong y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo về nano bạc

Cần thực hiện thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và tính an toàn của nano bạc trong điều trị ung thư, từ đó phát triển các sản phẩm y tế mới.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu. Báo cáo của Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (IARC) ghi nhận thế giới có khoảng 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu ca tử vong do ung thư mỗi năm, trong đó châu Á chiếm tới 57,3% số ca tử vong. Tại Việt Nam, ung thư dạ dày xếp thứ 3 trong các bệnh ung thư phổ biến với hơn 17.500 ca mắc mới và tỷ lệ tử vong lên đến 86% do phần lớn bệnh nhân phát hiện ở giai đoạn muộn. Trước thực trạng các liệu pháp hóa trị và xạ trị truyền thống thường gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng cũng như tình trạng kháng thuốc, xu hướng phát triển các vật liệu y sinh kích thước nano từ nguồn dược liệu tự nhiên đang mở ra triển vọng đột phá.

Nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề điều chế vật liệu nano bạc (AgNPs) bằng phương pháp tổng hợp xanh (green synthesis) thân thiện với môi trường, tận dụng nguồn hoạt chất sinh học tự nhiên từ lá cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb.) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Mục tiêu chính của đề tài là xây dựng quy trình sinh tổng hợp phức hệ nano bạc dịch chiết Đu đủ rừng (AgNPs-TrP), xác định các đặc tính lý hóa cấu trúc và đánh giá toàn diện hoạt tính ức chế tăng sinh, cảm ứng quá trình chết theo chương trình (apoptosis) trên dòng tế bào ung thư dạ dày người MKN45 trong điều kiện in vitro.

Đề tài được tiến hành từ tháng 8/2019 đến tháng 6/2020 tại Phòng thí nghiệm Y sinh và Phòng thí nghiệm Vật lý thuộc Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, với mẫu thực vật được thu thập chuẩn hóa tại huyện Chợ Đồn, tỉnh Bắc Kạn. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc lần đầu tiên chế tạo thành công các hạt nano bạc siêu nhỏ với đường kính trung bình chỉ 7,8 nm từ loài Trevesia palmata, đạt giá trị ức chế bán tối đa IC50 ấn tượng ở mức 0,2 µg/ml trên tế bào ung thư MKN45, tạo nền tảng vững chắc cho việc phát triển các dòng thuốc điều trị ung thư thế hệ mới có nguồn gốc thực vật bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết chuyên ngành công nghệ sinh học và y sinh học hiện đại:

1. Lý thuyết tổng hợp xanh vật liệu nano: Khẳng định các hợp chất thứ cấp trong thực vật như polyphenol, flavonoid và đặc biệt là triterpenoid saponin đóng vai trò kép vừa là chất khử ion Ag+ thành Ag0, vừa là chất trợ phân tán và bọc phủ bề mặt giúp ngăn chặn hiện tượng kết tụ hạt, loại bỏ hoàn toàn hóa chất độc hại trong quá trình chế tạo.
2. Lý thuyết chết tế bào theo chương trình (Apoptosis) trong ung thư học: Tế bào ung thư sở hữu đặc tính trốn tránh apoptosis để tăng sinh vô hạn. Việc kích hoạt lại con đường apoptosis thông qua kích thích chuỗi protease Caspase (Caspase 8 khởi động và Caspase 3 thực thi) cùng với ức chế các protein chống chết tế bào như BCL2 là chiến lược cốt lõi để tiêu diệt tế bào ác tính.
3. Lý thuyết stress oxy hóa qua gốc tự do ROS (Reactive Oxygen Species): Sự tích tụ vượt ngưỡng của các dạng oxy hóa hoạt động như gốc anion superoxide và hydro peroxide sẽ gây tổn thương cấu trúc màng, đứt gãy sợi DNA và thay đổi điện thế màng ty thể, từ đó kích hoạt dòng thác tín hiệu dẫn truyền dẫn đến cái chết tế bào.

Mô hình nghiên cứu vận hành theo cơ chế: Dịch chiết lá Đu đủ rừng phản ứng với dung dịch muối bạc tạo phức hệ AgNPs-TrP -> Thâm nhập vào tế bào ung thư MKN45 -> Kích thích tăng sinh ROS nội bào -> Thay đổi biểu hiện hệ gen điều hòa oxy hóa và apoptotic -> Ức chế tăng sinh và tiêu diệt tế bào ung thư.

Các khái niệm chính bao gồm: Hạt nano bạc (AgNPs), Phức hệ AgNPs-TrP, Hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR), Nồng độ ức chế 50% tế bào (IC50), và Kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng tương đối bằng phương pháp 2^-ΔΔCt.

Phương pháp nghiên cứu

• Vật liệu và nguồn dữ liệu: Mẫu lá cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata) được thu hái thực địa tại xã Đồng Thắng, huyện Chợ Đồn, tỉnh Bắc Kạn, được định danh hình thái thực vật chuẩn xác. 100g bột lá sấy khô được chiết xuất trong 200ml nước cất tinh khiết ở nhiệt độ 90°C trong 60 phút để thu dịch chiết nguyên liệu. Dòng tế bào ung thư dạ dày người MKN45 do Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp (Inserm U1053) cung cấp.
• Quy trình tổng hợp phức hệ AgNPs-TrP: Sử dụng dung dịch muối bạc AgNO3 nồng độ 5mM phản ứng với dịch chiết lá cây ở nhiệt độ kiểm soát 100°C và 60°C trên máy khuấy từ tốc độ 600 vòng/phút.
• Phương pháp phân tích đặc tính lý hóa: Quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến UV-Vis (dải quét 250–800 nm) xác định đỉnh hấp thụ plasmon bề mặt; Nhiễu xạ tia X (XRD) trên máy Bruker D2 PHASER (dải quét góc 2θ từ 10° đến 80°) kiểm tra cấu trúc tinh thể; Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) dải 500–4.000 cm^-1 phát hiện các liên kết nhóm chức hữu cơ; Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đo lường hình thái và biểu đồ phân bố kích thước hạt.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Thử nghiệm độc tính tế bào MTT trên đĩa 96 giếng ở bước sóng 570 nm với dải nồng độ khảo sát từ 0,05 đến 2,0 µg/ml; Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang DCFH-DA (nồng độ 1 µg/ml) chụp trên kính hiển vi huỳnh quang Nikon Eclipse Ti2-U để định lượng nồng độ gốc tự do ROS; Phương pháp Realtime RT-PCR trên thiết bị qTOWER 3G với hóa chất Syber Green và hệ mồi đặc hiệu để định lượng biểu hiện của 8 gen mục tiêu (NOX4, DUOX2, Caspase 3, Caspase 8, BCL2, SOD1, SOD2, ALDH), sử dụng gen GAPDH làm chuẩn nội.
• Cỡ mẫu và xử lý thống kê: Tất cả các phép đo sinh học đều được bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần độc lập (n = 3). Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 19 và GraphPad Prism 5, áp dụng kiểm định phi tham số Mann-Whitney với ngưỡng ý nghĩa thống kê p ≤ 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tổng hợp thành công phức hệ nano bạc đơn phân tán cao: Khi bổ sung dịch chiết lá Đu đủ rừng vào dung dịch AgNO3 5mM, hỗn hợp phản ứng nhanh chóng chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu sẫm. Phổ UV-Vis ghi nhận đỉnh hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) rõ nét trong dải bước sóng 428–445 nm. Phân tích XRD xác nhận cấu trúc tinh thể lập phương tâm diện (fcc) của bạc nguyên chất với các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng tại góc 2θ là 38,25°, 44,2°, 64,4° và 77,1° tương ứng với các mặt phẳng tinh thể (111), (200), (220) và (311). Phổ FT-IR chỉ ra sự dịch chuyển của nhóm phenol O-H từ 3416 cm^-1 sang 3492 cm^-1 và nhóm liên kết peptide, chứng minh saponin và protein tự nhiên đã bao bọc hạt nano. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM khẳng định các hạt AgNPs-TrP có dạng hình cầu đồng đều, kích thước phân bố từ 4 đến 11 nm với đường kính trung bình chỉ 7,8 nm.
2. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày MKN45 ở nồng độ cực thấp: Kết quả thử nghiệm MTT sau 24 giờ xử lý cho thấy tỷ lệ sống của tế bào giảm tỷ lệ nghịch với nồng độ hạt nano. Tại nồng độ 0,2 µg/ml, tỷ lệ sống của tế bào giảm còn 40%; khi tăng nồng độ lên 0,5 µg/ml, tỷ lệ tế bào sống sụt giảm mạnh xuống dưới 10% và bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ từ 1,0 đến 2,0 µg/ml. Giá trị IC50 của phức hệ AgNPs-TrP được xác định chính xác ở mức 0,2 µg/ml. Dưới kính hiển vi, tế bào đối chứng có hình thoi bám dính tốt chuyển hoàn toàn sang dạng hình cầu co cụm, phân rã màng và bong tróc khỏi giá thể nuôi cấy.
3. Cơ chế kích hoạt bùng nổ gốc oxy hóa tự do ROS: Nhuộm huỳnh quang DCFH-DA cho thấy cường độ phát sáng xanh lục trong tế bào MKN45 tăng mạnh theo nồng độ hạt nano. Tỷ lệ tế bào biểu hiện tích tụ ROS ở nồng độ 0,2 µg/ml là 52% và tăng vọt lên 82% khi xử lý ở nồng độ 1,5 µg/ml, cao gấp nhiều lần so với nhóm đối chứng (p ≤ 0,05).
4. Điều hòa biểu hiện hệ gen apoptotic và chống oxy hóa: Phân tích Realtime RT-PCR chứng minh phức hệ AgNPs-TrP đã tác động sâu sắc đến hệ gen tế bào: kích thích tăng cường biểu hiện của các gen sinh ROS (NOX4, DUOX2), gia tăng biểu hiện của gen khởi động Caspase 8 và gen thực thi Caspase 3, đồng thời ức chế mạnh mẽ gen chống chết BCL2 và làm suy giảm hoạt tính các enzyme phòng thủ chống oxy hóa nội bào (SOD1, SOD2, ALDH).

Thảo luận kết quả

Kích thước siêu nhỏ 7,8 nm đóng vai trò then chốt quyết định hoạt tính vượt trội của phức hệ AgNPs-TrP. Các hạt nano kích thước dưới 10 nm dễ dàng thẩm thấu qua màng tế bào, giải phóng ion Ag+ nội bào và tương tác trực tiếp với ty thể. Khi so sánh với các nghiên cứu tương đồng trên thế giới, giá trị IC50 của nano bạc từ cây Đu đủ rừng (0,2 µg/ml) thể hiện hoạt tính mạnh hơn gấp 24 lần so với nano bạc tổng hợp từ cây Artemisia turcomanica trên dòng tế bào ung thư dạ dày AGS (IC50 = 4,88 µg/ml) và vượt trội hơn 100 lần so với nano bạc từ cây Artemisia marschalliana (IC50 = 21,05 µg/ml).

Sự cộng hưởng giữa hoạt chất triterpen saponin đặc hữu trong chi Trevesia cùng cấu trúc nano bạc đã tạo nên tác động kép: vừa gây độc tế bào trực tiếp, vừa khóa chặt cơ chế tự vệ chống oxy hóa của khối u. Toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm được lượng hóa chi tiết thông qua các biểu đồ đường cong sống sót MTT, phổ nhiễu xạ XRD, ảnh hiển vi huỳnh quang phân giải cao và biểu đồ cột biểu hiện gen định lượng tương đối, đem lại bằng chứng thuyết phục về một ứng viên thuốc chống ung thư tiềm năng cao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình chiết xuất và tổng hợp quy mô pilot: Đề nghị các trung tâm nghiên cứu công nghệ sinh học và vật lý y sinh tiến hành tối ưu hóa các thông số kỹ thuật (tỷ lệ phối trộn dịch chiết/muối bạc, pH, nhiệt độ phản ứng) nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp hạt nano đạt trên 85%, kiểm soát kích thước hạt dao động ổn định trong khoảng 5–10 nm trong thời gian từ 6 đến 12 tháng tới.
2. Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo: Khuyến nghị các nhóm nghiên cứu phối hợp với các bệnh viện chuyên khoa ung bướu thực hiện đánh giá hoạt tính chống ung thư trên mô hình chuột mang khối u dạ dày ngoại lai, xác định liều dung nạp tối đa (MTD), độc tính cấp và bán trường diễn với mục tiêu giảm thể tích khối u từ 40% đến 60% trong lộ trình từ 12 đến 18 tháng.
3. Phát triển hệ dẫn thuốc nano hướng đích: Đề xuất các doanh nghiệp dược phẩm đầu tư nghiên cứu gắn kết kháng thể đơn dòng đặc hiệu hoặc bao bọc phức hệ AgNPs-TrP trong màng polymer tương thích sinh học (chitosan, PEG), nhằm tăng nồng độ tích tụ tại mô đích lên 3 đến 5 lần và giảm thiểu tối đa tác động lên các tế bào lành trong thời gian 18 đến 24 tháng.
4. Quy hoạch vùng trồng và bảo tồn dược liệu Đu đủ rừng: Đề nghị Sở Khoa học & Công nghệ phối hợp với Sở Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn tỉnh Bắc Kạn và các tỉnh miền núi phía Bắc xây dựng vùng trồng chuyên canh cây Trevesia palmata đạt chuẩn GACP-WHO quy mô từ 5 đến 10 hecta trong 24 đến 36 tháng tới, vừa bảo tồn nguồn gen quý vừa tạo sinh kế nâng cao thu nhập cho đồng bào địa phương lên 30%.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Cán bộ giảng dạy, nghiên cứu sinh và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vật lý Y sinh: Luận văn cung cấp trọn vẹn quy trình thực nghiệm từ khâu xử lý mẫu thực vật, sinh tổng hợp nano kim loại, phân tích cấu trúc vật liệu (UV-Vis, XRD, FT-IR, TEM) đến các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (MTT, Realtime RT-PCR với phương pháp 2^-ΔΔCt).
2. Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu, Dược sĩ và các nhà phát triển thuốc mới: Tiếp cận dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về cơ chế kích hoạt apoptosis qua con đường tích tụ ROS và caspase trên dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 với chỉ số IC50 đạt 0,2 µg/ml, làm cơ sở khoa học để thiết kế các phác đồ điều trị phối hợp mới.
3. Các công ty Dược phẩm, Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm Y sinh: Khai thác quy trình công nghệ tổng hợp xanh thân thiện môi trường, chi phí thấp từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước nhằm định hướng sản xuất các dạng thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ điều trị ung thư.
4. Cơ quan quản lý Dược liệu và Phát triển Nông nghiệp miền núi: Tham khảo tài liệu để đánh giá giá trị dược lý chuyên sâu của cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata), phục vụ xây dựng đề án quy hoạch, bảo tồn nguồn tài nguyên cây thuốc quý bản địa tại các vùng núi phía Bắc Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Phương pháp tổng hợp xanh nano bạc từ Đu đủ rừng có ưu điểm gì vượt trội so với phương pháp hóa học?

Tổng hợp xanh sử dụng dịch chiết lá Đu đủ rừng hoàn toàn không dùng các hóa chất khử độc hại như NaBH4 hay hydrazin. Các hoạt chất saponin và protein tự nhiên vừa đóng vai trò chất khử vừa tạo lớp màng bao sinh học bọc quanh hạt, giúp các hạt nano có kích thước trung bình 7,8 nm đạt độ phân tán cao, không kết tụ và an toàn cho tế bào sống.

Cơ chế chính giúp phức hệ AgNPs-TrP tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày MKN45 là gì?

Phức hệ AgNPs-TrP thâm nhập vào tế bào ung thư và kích thích tạo ra lượng lớn các gốc oxy hóa tự do ROS (đạt tỷ lệ 82% tế bào tích tụ ở nồng độ 1,5 µg/ml). Lượng ROS này làm tổn thương ty thể, kích hoạt các gen protease apoptotic Caspase 8 và Caspase 3, đồng thời ức chế gen chống chết BCL2, dẫn tới cái chết tế bào theo chương trình.

Giá trị IC50 đạt 0,2 µg/ml của phức hệ nano bạc trong nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn như thế nào?

Chỉ số IC50 = 0,2 µg/ml chứng minh hoạt tính độc tế bào cực kỳ mạnh ở nồng độ rất thấp. So với nhiều nghiên cứu nano bạc thảo dược trước đây (thường có IC50 dao động từ 4,88 đến 21,05 µg/ml), phức hệ AgNPs-TrP có hoạt lực cao hơn gấp hàng chục lần, giúp giảm thiểu đáng kể liều lượng sử dụng khi phát triển thành thuốc.

Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata) chứa những thành phần hóa học nào tạo nên hoạt tính sinh học?

Lá và thân cây Đu đủ rừng rất giàu các hợp chất triterpenoid saponin (chủ yếu có khung aglycon là acid oleanolic, dẫn chất lupane và ursane), cùng các hợp chất polyphenol và flavonoid. Các hoạt chất này sở hữu tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng viêm và có khả năng gây độc tế bào chọn lọc trên nhiều dòng tế bào ác tính.

Kỹ thuật Realtime RT-PCR trong đề tài đã chứng minh điều gì về mức độ phân tử?

Kỹ thuật Realtime RT-PCR qua 40 chu kỳ khuếch đại đã định lượng chính xác sự thay đổi phiên mã: phức hệ AgNPs-TrP làm tăng biểu hiện các gen sản sinh ROS (NOX4, DUOX2) và gen chết theo chương trình (Caspase 3, Caspase 8), đồng thời làm suy giảm biểu hiện của gen BCL2 cùng hệ enzyme phòng vệ SOD1, SOD2, ALDH.

Kết luận

• Tổng hợp xanh thành công vật liệu nano y sinh: Lần đầu tiên chế tạo thành công phức hệ nano bạc AgNPs-TrP từ dịch chiết lá cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata) với cấu trúc tinh thể lập phương tâm diện và kích thước hạt siêu nhỏ trung bình 7,8 nm.
• Hoạt tính ức chế ung thư dạ dày vượt bậc: Xác lập giá trị IC50 đạt 0,2 µg/ml trên dòng tế bào MKN45, làm giảm tỷ lệ sống tế bào xuống dưới 10% tại nồng độ 0,5 µg/ml và ức chế hoàn toàn ở nồng độ trên 1,0 µg/ml.
• Làm sáng tỏ cơ chế tác động ở mức độ tế bào và phân tử: Chứng minh con đường tiêu diệt tế bào ung thư thông qua bùng nổ stress oxy hóa ROS (tăng lên 82%), kích hoạt dòng thác tín hiệu Caspase 8 / Caspase 3 và ức chế gen bảo vệ BCL2.
• Lộ trình nghiên cứu phát triển tiếp theo: Đặt mục tiêu triển khai các thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm và tối ưu hóa hệ dẫn thuốc hướng đích trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới.
• Kêu gọi hợp tác và chuyển giao: Kính mời các đơn vị nghiên cứu, viện dược liệu và doanh nghiệp dược phẩm tiếp cận toàn văn công trình để cùng phối hợp khai thác, chuyển giao công nghệ và phát triển nguồn dược liệu quý Việt Nam thành các sản phẩm y sinh giá trị cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát về cây Đu đủ rừng 1. Đặc điểm phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan được ghi trong cuốn Flowering plants [94], cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb.) thuộc chi Trevesia Vis., một chi nằm trong họ Nhân sâm (Araliaceae).

Vị trí phân loại của chi Trevesia Vis. trong hệ thống phân loại thực vật chính thức cụ thể được tóm tắt như sau: Ngành Ngọc lan - Magnoliophyta Lớp Ngọc lan - Magnoliopsida Phân lớp Sổ - Dilleniidae Bộ Nhân sâm (Hoa tán) - Apiales Họ Nhân sâm (Ngũ gia bì) - Araliaceae Chi Trevesia Vis. Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb.) còn gọi là Thông thảo gai, Thầu dầu núi, Thích thông thảo, Nhật phiến, Thôi hoang [2], [3] thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Cây nhỡ cao 7-8 m hay hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp [23], hoặc cao 9 m, thân to 10 cm, có gai [3], [8] lá đơn, phiến lá phân thùy chân vịt xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5-9 thùy nhọn có răng, gân nổi ở 2 mặt, mép lá có răng cưa thô; cuống lá dài và có gai.

Lá non phủ lông mềm màu nâu nhạt, lá già nhẵn. Hoa mọc thành tán, tụ thành chùy ở nách, hoa to khoảng 1cm, màu trắng, quả dài 13-18 mm, có khía, hạt dẹt [2]. Cây mọc ở chỗ ẩm, dọc theo các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi. Ra hoa từ tháng 5 đến tháng 6, có quả từ tháng 7 đến tháng 9 [2], [7].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Phân bố: Cây Đu đủ rừng phân bố tại Sơn La (Mộc Châu), Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang (Phó Bảng), Lạng Sơn (Hữu Lũng), Hà Tây (Ba Vì), Quảng Trị, Kon Tum (Đắc Glay, Đắc Choong, Đắc Kit, Đắc Long, Đắc môn, Đắc Pết, Gia Lai (Chư Pả, Mang Jang, Chư Ta Mốc), Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng (Lạc Dương, Langbiang, Tra Nung, Kơ Nớ). Ở Ấn Độ, Bangladet, Trung Quốc [2], [8]. Thành phần hóa học Cho đến nay những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Trevesia, kể cả trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế. Năm 1997 từ phân đoạn n-BuOH của dịch chiết MeOH hoa và lá loài T.

sundaica Nunziatina de Tommasi và cộng sự đã phân lập được 6 saponin triterpenoid mới (1-6) cùng với 4 saponin triterpenoid đã biết (Hình 1. Năm 2000 cũng từ phân đoạn n-BuOH của dịch chiết EtOH lá loài T. palmata, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 8 saponin triterpenoid, trong đó có 6 chất mới (7-12) [30]. Phần lớn các saponin này là các bisdesmoside, chỉ có 3 saponin monodesmoside nhưng tất cả đều có phần aglycon là acid oleanolic hoặc dẫn chất của acid này.

Cấu trúc aglycon của các saponin phân lập từ hai loài Trevesia palmata (Roxb. và Trevesia sundaica Miq [31] LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 Bora Kim và cộng sự năm 2018 đã phân lập năm hợp chất chống nấm từ chiết xuất methanol của T. palmata: hai glycosides triterpene mới (TPGs), TPG1 và TPG5 cùng với ba TPGs được biết đến (TPG2 [macranthoside A], TPG3 [α- hederin], và TPG4 [ilekudinoside D]) [53]. Năm 2019, Phạm Hải Yến và cộng sự đã tìm ra ba saponin triterpene mới bao gồm hai loại lupane và một loại ursane đã được phân lập từ các lá của Trevesia palmata [103].

Công dụng của cây Đu đủ rừng Bộ phận dùng: Lõi thân (tủy cây), lá - Folium et Medulla Rsdix Trevesiae burkii [2]. Tính vị, tác dụng: Vị hơi đắng, tính bình, lõi thân lợi niệu, lá và rễ cường cân tráng cốt [2]. Trong y học cổ truyền thì người ta đã sử dụng các thành phần của cây Đu đủ rừng để chữa một số bệnh như sau: Lõi thân dùng chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp và làm thuốc hạ nhiệt, làm phổi bớt nóng, lá dùng nấu xông chữa tê liệt bại người và giã đắp chữa gãy xương [7], [91]. Ở Trung Quốc, lõi thân dùng điều trị tiểu tiện bất lợi, lá và rễ dùng trị đòn ngã tổn thương và đau eo lưng [1],[2].

Hiện nay, trên thế giới có rất ít nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. Năm 2000, Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Italia) đã chứng minh dịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ rừng và một số saponin phân lập được đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào J774, HEK-293c, WEHI- 164d [30]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hasanur Rahman và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và giảm đau của dịch chiết từ lá loài T.

Kết quả cho thấy ở mức liều lượng 100, 200 và 400mg/kg thể trọng đã làm giảm đường huyết của động vật thực nghiệm 17,9; 28,1 và 47,4% so với đối chứng; đối với tác dụng giảm đau, ở mức liều lượng 50, 100, 200 và 400 mg mỗi kg trọng lượng cơ thể giảm số lượng bụng co thắt lần lượt bằng 33,3; 40,7; 48,1 và 55,6% [82]. Mohammed Aktar Sayeed và cộng sự nghiên cứu về tác dụng của dịch chiết methanol từ lá loài T.palmata trong điều trị tan huyết khối và chống viêm khớp. Kết quả cho thấy dịch chiết n-hexane và ethyl acetate có tác dụng tốt trên thử nghiệm in vitro hoạt tính tan huyết khối trong khi đó dịch chiết methanol có tác dụng kháng viêm mạnh [89]. Năm 2018, Bora Kim và cộng sự đã chiết xuất từ T.palmata được các hoạt chất TPGs bằng cách chiết methanol, cho thấy các hoạt chất TPG 1, TPG 2, TPG 3 và TPG 5 có tác dụng kháng nấm mạnh ở thực vật khi khảo sát hoạt động này trên các loại nấm cà, lúa mì lúa mạch và hồ tiêu [53].

Nano bạc, phương pháp tổng hợp và ứng dụng 1. Khái quát về nano bạc Nano bạc là tập hợp của các nguyên tử bạc có kích thước từ 1 tới 100 nm thường được chế tạo ở dạng bột và dạng keo. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối nhờ khả năng giải phóng nhiều hơn các ion Ag+. Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt.

Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt. Nano bạc mang đầy đủ tính chất của bạc khối như dẫn điện, dẫn nhiệt, khả năng xúc tác, tính điện quang, khả năng diệt khuẩn. Ngoài ra, bạc nano có nhiều tính chất khác biệt so với bạc kim loại nhờ các đặc tính của nano như diện tích bề LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 mặt lớn, khả năng phân tán tốt trong các dung môi mà điển hình là khả năng diệt khuẩn [57]. Các phương pháp tổng hợp nano bạc Các phương pháp tổng hợp nano kim loại chủ yếu được chia thành các cách tiếp cận từ trên xuống (topdown) và từ dưới lên (bottom up).

Cách tiếp cận từ trên xuống vật liệu khối sẽ phân tách thành các hạt mịn để tạo ra các cấu trúc nano cần thiết, trong khi phương pháp từ dưới lên lắp ráp các nguyên tử và phân tử đơn lẻ thành các cấu trúc nano lớn hơn để tạo ra các vật liệu có kích thước nano [47]. Ngày nay, các phương pháp tổng hợp được phân loại thành tổng hợp xanh, vật lý và hóa học (Hình 1. Các tổng hợp vật lý và hóa học có xu hướng tốn nhiều công sức và phức tạp hơn so với tổng hợp sinh học thể hiện các tính chất hấp dẫn, như năng suất cao, độ hòa tan và tính ổn định [107]. Phương pháp vật lý: Sự tổng hợp vật lý của AgNPs bao gồm phương pháp ngưng tụ bay hơi và kỹ thuật cắt đốt bằng laser [47].

Cả hai phương pháp đều có thể tổng hợp một lượng lớn AgNPs với độ tinh khiết cao mà không sử dụng các hóa chất giải phóng các chất độc hại và gây nguy hiểm cho sức khỏe và môi trường của con người. Nhưng cả hai phương pháp đều tiêu thụ năng lượng lớn hơn và đòi hỏi thời gian tổng hợp và thiết bị phức tạp tương đối dài, làm tăng chi phí vận hành [58]. Phương pháp hóa học/quang hóa: Phương pháp tổng hợp hóa học đã được áp dụng phổ biến trong quá trình tổng hợp nano kim loại dưới dạng phân tán keo trong dung dịch nước hoặc dung môi hữu cơ bằng cách khử muối kim loại của chúng. Các loại muối kim loại khác nhau được sử dụng để chế tạo các ống nano kim loại tương ứng, như vàng, bạc, sắt, oxyt kẽm, đồng, palladi, bạch kim,.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các phương pháp tổng hợp AgNPs [44] Phương pháp tổng hợp hóa học có thể được chia thành các phương pháp khử hóa học, điện hóa, hỗ trợ chiếu xạ và phương pháp nhiệt phân. Loại chất khử và chất ổn định là yếu tố chính trong việc tổng hợp các hạt nano kim loại bằng phương pháp này. Quan trọng hơn, vì các chất ổn định và chất khử này thường độc hại, nên việc sử dụng các loại chất này cần được xem xét về tính an toàn và hiệu quả của phương pháp.

Đây là nhược điểm của phương pháp tổng hợp hóa học [47]. Phương pháp tổng hợp xanh: Cách tiếp cận tổng hợp xanh hay còn gọi là tổng hợp sinh học sử dụng chiết xuất thực vật được kỳ vọng như là một phương pháp thay thế cho tổng hợp hóa học cho các hạt nano kim loại bởi nó vì giảm các phản ứng độc hại. Các bộ phận khác nhau của thực vật đang được sử dụng để tổng hợp các hạt nano bạc tối ưu hóa. Kích thước và hình dạng mong muốn có thể thu được bằng cách tối ưu hóa loại dung môi và thời gian.

Tổng hợp xanh các hạt nano bạc là một phương pháp đơn giản và dễ thực hiện bao gồm các liên kết của ion kim loại với một vật liệu thực vật. Quy trình chung cho tổng hợp bắt đầu bằng cách ủ muối bạc AgNO3 và LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 tác nhân chiết xuất thực vật gây giảm ion bạc để tạo AG+0 tiếp theo là các phản ứng khử dẫn đến sự hình thành các hạt nano bạc [44]. Vai trò của nano bạc tạo ra bằng phương pháp tổng hợp xanh trong y học Do khả năng tương thích sinh học, khả năng mở rộng và khả năng ứng dụng cao, các hạt nano bạc chiết xuất từ thực vật đã cho thấy các đặc tính chống oxy hóa và chống ung thư vượt trội bên cạnh các hoạt động kháng khuẩn cao chống lại các mầm bệnh phân lập trên lâm sàng bao gồm các mầm bệnh đa kháng thuốc và nấm men. Do đó, công nghệ nano thực vật đã mở ra những con đường mới trong việc điều trị hoặc kiểm soát các căn bệnh nguy hiểm đặc biệt là ung thư.