MỞ ĐẦU Tại Việt Nam, ngành Thủy sản đã và đang góp phần quan trọng vào sự tăng trưởng của nền kinh tế. Hoạt động nuôi trồng thủy sản liên tục có những bước phát triển mạnh, sản lượng tăng trung bình đạt 12,77% qua các năm. Năm 2019, tổng sản lượng khai thác và nuôi trồng đạt khoảng 8,15 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu ước đạt 8,6 tỷ USD. Theo định hướng phát triển đến năm 2030, tổng sản lượng thủy sản đạt khoảng 9,0 triệu tấn, trong đó sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm đến khoảng 70% và sản lượng khai thác chiếm khoảng 30% [1].
Tuy nhiên, hiện nay nghề nuôi tôm của chúng ta đang đương đầu với nhiều loại bệnh khác nhau: bệnh phát sáng, bệnh đầu vàng, bệnh còi tôm (EMS), hay bệnh hoại tử gan tụy… nguyên nhân phần lớn là do vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Vibrio gây ra. Chính vì vậy, thuốc kháng sinh thường được sử dụng rộng rãi để ngừa bệnh cho vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, có đến 80% kháng sinh sử dụng được bài tiết qua nước tiểu hoặc phân của vật nuôi mà không bị phân hủy hoàn toàn. Theo số liệu báo cáo, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản là một trong những nguyên nhân cho việc tồn dư kháng sinh trong môi trường.
Các nghiên cứu từ Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia và Thái Lan đã báo cáo dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản và nước nuôi trồng thủy sản. Trong đó, Chloramphenicol được ghi nhận ở cá từ Bangladesh (~ 5ng/L), tôm từ Ấn Độ (~ 32ng/L) và Indonesia (~ 45ng/L), v. Do đó, việc lạm dụng kháng sinh có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh (ARB) và gen kháng kháng sinh (ARGs) trong môi trường nuôi trồng thủy sản [3]. Trên thế giới, thực phẩm bổ sung dưới dạng synbiotic là một dòng sản phẩm đã và đang được trọng tâm nghiên cứu trên đối tượng động vật thủy sản.
Tại Việt Nam, cho đến nay các nghiên cứu về thực phẩm hỗ trợ chuyển hóa thức ăn đối với động vật thủy sản chủ yếu ở dạng probiotic, ở dạng prebiotic riêng lẻ đã xuất hiện trong báo cáo tại Việt Nam. Nhưng chưa có nhiều báo cáo cho thấy sự phối hợp giữa các prebiotic với nhau hoặc sản phẩm 2 trong 1 của prebiotic và probiotic thành synbiotic trên tôm, cá nuôi. Đề tài nghiên cứu tạo sản phẩm synbiotic với sự kết hợp trực tiếp của probiotic và prebiotic trong khô đậu nành thông qua quá trình lên men, dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm, từ đó cân bằng hệ vi sinh đường ruột, kích thích 2 để làm tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường sự chuyển hóa thức ăn từ đó làm tăng sản lượng tôm. Những chủng vi sinh vật có lợi sử dụng trong đề tài có khả năng sinh các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, protease, khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus và còn là những chủng tạo màng sinh học (biofilm) rất tốt.
Đây là cơ sở để các chủng probiotic này có khả năng bám dính trên các giá thể tốt và cũng có thể tồn tại lâu dài trên thành ruột của tôm hay động vật chủ khác. Prebiotic-chất sơ thực phẩm, được chúng tôi lựa chọn là khô đậu nành, một loại phụ phẩm nông nghiệp chứa nhiều dinh dưỡng sau khi sản xuất dầu. Các Oligosaccharride - là thành phần có mặt trong chất sơ thực phẩm và một số chất ức chế dinh dưỡng như ức chế tripsine (trypsine inhibitor) chứa trong khô dầu đậu nành sẽ được chuyển hóa thành các axit béo mạch ngắn và loại được chất ức chế dinh dưỡng này nhờ trong quá trình lên men bởi các chủng probiotic. Hiện nay việc sử dụng probiotic trong NTTS thường theo hai hướng: phối trộn vào thức ăn cho tôm, cá ăn hoặc bổ sung trực tiếp vào môi trường nước ao nuôi.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của probiotic trong xử lý môi trường ao nuôi. Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung vào sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cải thiện sức khỏe tôm thông qua kích thích quá trình trao đổi chất, tăng cường hệ thống miễn dịch của tôm, cá và ứng dụng chất bổ trợ prebiotic hay còn gọi là chất xơ hòa tan để kích thích sự phát triển nhóm lợi khuẩn này còn chưa nhiều. Đây là vấn đề cực kỳ quan trọng trong điều kiện thâm canh và siêu thâm canh hóa hiện nay ở nước ta. Trước yêu cầu của thực tiễn, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)”.
Mục đích nghiên cứu: Tạo được chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng, giúp nâng cao tăng trưởng và tăng cường miễn dịch cho tôm. Nội dung nghiên cứu : - Nội dung 1. Sàng lọc các vi sinh vật probiotic 3 + Chọn các chủng vi sinh vật sinh các enzyme cellulose, protease, amylase; có khả năng tạo màng sinh học, kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. + Phân loại của vi khuẩn probiotic tuyển chọn bằng kit sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử sử dụng gen 16S rRNA.
Xác định được khả năng sử dụng khô đậu nành (như prebiotic) cho sinh trưởng của các chủng probiotic lựa chọn - Nội dung 3. Tối ưu hóa một số điều kiện cho quá trình lên men xốp tạo chế phẩn dưới dạng synbiotic Những đóng góp của luận văn: Khô đậu nành không chỉ đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng mà còn là một cơ chất prebiotic hỗ trợ sinh trưởng của probiotic trong chế phẩm synbiotic nghiên cứu. Khả năng loại được chất ức chế trypsin trong khô đậu nành sau quá trình lên men xốp của probiotic đã được kiểm chứng trong nội dung đề tài. Chế phẩm synbiotics nghiên cứu dung để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm là một đề tài hoàn toàn mới.
Kết quả của đề tài là cơ sở để phát triển chế phẩm sinh học synbiotic ứng dụng trong NTTS tại Việt Nam. 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU PROBIOTIC Định nghĩa về probiotic Lịch sử nghiên cứu về probiotic có từ thời cổ đại. Tuy nhiên, các bằng chứng khoa học đầu tiên về probiotic được ghi nhận bởi Metchnikoff từ đầu thế kỷ 20. Thức ăn được lên men mang lại hiệu quả đáng kể trong điều trị và dự phòng tiêu chảy cấp cho trẻ em các nước trên thế giới mặc dù chưa có được các hiểu biết về một loại lợi khuẩn cụ thể nào.
Các lợi khuẩn mang lại các cải thiện về điều trị và phòng bệnh ngày nay được gọi tên là các probiotic. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic tuy nhiên định nghĩa hay được sử dụng nhất trong các nghiên cứu lâm sàng về probiotic hiện nay là của Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp và Tổ chức Y tế thế giới (FAO/WHO năm 2002). Theo định nghĩa này, Probiotic là "vi sinh vật sống khi đưa một lượng cần thiết đầy đủ vào cơ thể đem lại hiệu quả có lợi cho cơ thể”. Ban đầu probiotic được lựa chọn với tiêu chí là tạo một môi trường tốt cho sự lên men thực phẩm, nhưng ngày nay với những hiểu biết của khoa học hiện tại, tiêu chí lựa chọn probiotic có nhiều thay đổi.
Một số nhóm vi sinh vật probiotic Vi khuẩn lactic: Chi Lactobacillus Các vi khuẩn thuộc Chi Lactobacillus là các vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, tế bào hình que (rod) hoặc que ngắn (cocco-bacili). Về phân loại, Chi Lactobacillus thuộc Ngành Firmicutes, Lớp Bacili, Bộ Lactobacillales, Họ Lactobacillaceae. Họ vi khuẩn này cũng bao gồm các chi có quan hệ gần gũi với Paralactobacillus và Pediococcus. Chúng là những vi sinh vật hiếu khí và cần môi trường giàu dinh dưỡng để sinh trưởng.
Trong quá trình lên men, nhóm vi khuẩn này chuyển đổi một số loại đường thành acid lactic. Tính năng đặc trưng của nhóm chế phẩm sinh học này là sinh các chất kháng khuẩn và sự hình thành màng sinh học để bảo vệ màng nhầy ruột. Sản xuất các chất ức chế như acid béo mạch ngắn làm giảm pH. Loại trừ các vi sinh vật gây bệnh hoặc ngăn chặn chúng dính vào màng nhầy ruột.
Chịu ảnh hưởng của các điều kiện lý hóa trong ruột như pH và thế oxy hóa khử, qua đó hạn chế điều kiện tăng trưởng của vi sinh vật có hại. Ảnh hưởng trên sự chuyển hóa của các acid mật và do đó thúc 5 đẩy sự hấp thụ chất béo, tác dụng trên biểu mô ruột, cải thiện khả năng hấp thụ [4]. Do vậy, thực phẩm chứa Lactobacillus có thể hỗ trợ trong ngành y dược, cụ thể nó có thể hỗ trợ trong điều trị di ngoài cấp [5]. Vi khuẩn Gram dương sinh bào tử: Chi Bacillus Chi Bacillus được phân vào ít nhất 8 nhóm loài trong cây phát sinh loài của Ngành Firmicutes.
Thành viên của chi Bacillus đều là các vi khuẩn dị dưỡng, có tế bào hình que, hiếu khí, sản sinh acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác (CO2, diacetyl, bacteriocin). Đặc điểm nổi bật nhất của chúng là khả năng sinh nội bào tử (endospore), và đây cũng là một đặc điểm quan trọng của một chủng Probiotic. Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus được tìm thấy phổ biến trong đất. Các enzyme mà vi khuẩn nhóm này sinh ra có khả năng chống lại các yếu tố bất lợi bên ngoài.
Rengpipat và cộng sự (2000) chỉ ra rằng việc sử dụng các sản phẩm chứa vi khuẩn Bacillus sp. sẽ kích hoạt hệ miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể ở tôm sú (Penaeus monodo). Trong điều kiện môi trường thích hợp, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sẽ phát triển nhanh với số lượng rất lớn, đồng thời cạnh tranh với các vi sinh vật khác và động vật nguyên sinh về nguồn thức ăn nên phần nào ngăn cản được sự phát triển của Vibrio và các vi sinh vật có hại, từ đó giảm được các tác nhân gây bệnh. Bacillus subtilis có khả năng sinh nhiều enzyme nhưng quan trọng nhất là sinh enzyme amylase và protease là hai loại enzyme tiêu hóa.
Vi khuẩn này thường tồn tại trong sản phẩm dưới dạng bào tử, nhờ vậy khi uống vào dạ dày nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Trong môi trường ruột bào tử “nảy mầm” và phát triển thành thể sinh dưỡng giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ tiêu hóa nhất là sau khi sử dụng chất kháng sinh kéo dài [7]. Nấm men: Chi Saccharomyces Nấm men là các vi sinh vật đơn bào có nhân điển hình. Chi Saccharomyces được xếp trong Lĩnh giới Eukaryota, Giới Nấm (fungi), Ngành Ascomycota, Phân ngành Saccharomycotina, Lớp Saccharomycetes, Bộ Saccharomycetales, Họ Saccharomycetaceae.
Tế bào của nấm men S. cerevisiae sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi đa phương và được chuyển trực tiếp đến túi bào tử, có chứa bào tử túi.