MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt đới của Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ, đáp ứng nhu cầu lương thực cho 800 triệu người (Paul et al. Củ sắn có hàm lượng chất khô chiếm 30 - 60% (FAO, 2013) trong đó 80% là tinh bột, được sử dụng chủ yếu làm lương thực, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp tinh bột, đường, nhiên liệu sinh học (Abraham, 1996). Sản phẩm từ sắn đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị ở nước ta, đạt kim ngạch xuất khẩu 1,32 tỷ USD trong năm 2015.
Trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT) đã xếp cây sắn cùng với lúa và ngô được ưu tiên phát triển, do vậy, diện tích trồng sắn đến nay đã đạt hơn 570 nghìn ha, tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam chỉ đạt 19,15 tấn ha ở mức trung bình của thế giới (Bộ NN và PTNT, 2016). Để phát triển cây sắn bền vững, cần thiết phải cải tạo giống sắn nhằm không chỉ thu được lợi nhuận cao mà còn duy trì được độ phì nhiêu của đất. Hiện nay, trong công tác chọn tạo giống cây trồng, công nghệ gen có ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô, tế bào đã trở thành công cụ hiệu quả để cải biến di truyền của những cây có hạn chế trong sinh sản hữu tính và được nhân giống vô tính là chủ yếu như cây sắn. Trên thế giới, nghiên cứu tạo cây sắn chuyển gen đã được bắt đầu từ thập kỷ 90 của thế kỷ trước và đến nay đã có nhiều thành tựu (Beeching, 2013), đặc biệt trong hướng cải tiến chất lượng củ như giảm hàm lượng cyanogen (Fregene, 2002; Taylor et al., 2004), giảm tỷ lệ amylose trong tinh bột (Fregene, 2002), tăng hàm lượng protein, β-caroten (Morillo et al., 2012; Ovalle et al., 2016), sắt, vitamin (Fregene, 2002; Taylor et al., 2004; Sayre et al., 2011; Li et al., 2015; Narayanan et al., 2016), tăng tinh bột (Ihemere et al., 2006)… Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tác động vào các gen tham gia quá trình tổng hợp thủy phân tinh bột để tăng khả năng tích lũy tinh bột ở cơ quan dự trữ hướng đến nâng cao năng suất cây có củ nói chung và cây sắn nói riêng là hướng nghiên cứu đúng đắn và đang thu hút 2 được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu.
Trong sinh tổng hợp tinh bột, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzim điều hoà quá trình tổng hợp tinh bột ở bước chuyển glucose-1-phosphate thành ADP-glucose, nguyên liệu để tạo thành tinh bột (Buchanan et al. Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra AGPase là sản phẩm đơn gen của gen glgC của vi khuẩn E.coli, có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thực vật (Iglesias et al. coli mang đột biến điểm G336D thay thế glycin ở vị trí 336 bằng axit aspartic có thể hoạt động hiệu quả mà không cần chất hoạt hóa fructose-1,6-bis phosphate, có ái lực cao hơn với cơ chất (ATP và Glucose-1-phosphate) và giảm ái lực với chất ức chế AMP (Ihemere et al. Vì vậy, nuôi cấy mô tái sinh cây sắn, tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa AGPase với mã di truyền phù hợp với thực vật nhưng có ưu điểm của AGPase ở vi khuẩn và mang đột biến mong muốn, đánh giá sự biểu hiện của gen tổng hợp trên cây mô hình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chuyển gen tổng hợp nhân tạo vào cây sắn góp phần tạo tiền đề cho cải biến năng suất và chất lượng một số giống sắn đang được trồng phổ biến ở nước ta.
Với những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thiết ế v chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo v o cây sắn (Manihot esculenta Crantz)‖. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế và đánh giá hoạt động trên cây mô hình của vector mang gen mã hóa AGPase đã được tối ưu khả năng biểu hiện trong thực vật (AGPopt) và triển khai chuyển gen AGPopt vào cây sắn thông qua qui trình tái sinh và chuyển gen vào giống sắn đang được canh tác tại Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu Về sinh lý học thực vật nghiên cứu hoàn thiện các điều kiện nuôi cấy mô tế bào, điều kiện tạo phôi soma và tái sinh cây từ phôi soma phục việc chuyển gen ở cây sắn. 3 Về sinh học phân tử tập trung khai thác nguồn dữ liệu gen liên quan đến AGPase, đề xuất tối ưu hóa mã di truyền cho phù hợp với thực vật và bổ sung đột biến vào trình tự gen nhân tạo để gia tăng hiệu quả sinh tổng hợp tinh bột.
Về kỹ thuật di truyền tập trung thiết kế vector chuyển gen mang gen tổng hợp nhân tạo, tiến hành kiểm tra hoạt động của vector và gen chuyển trên đối tượng thuốc lá mô hình, đồng thời hoàn thiện qui trình chuyển gen và tiến hành chuyển gen ở cây sắn. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây sắn thông qua phương pháp tạo phôi soma. (2) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chuyển gen gus vào cây sắn thông qua vi khuẩn A. (3) Nghiên cứu thiết kế cấu trúc, vector mang gen AGPopt và đánh giá sự biểu hiện của gen AGPopt trên cây thuốc lá.
(4) Nghiên cứu chuyển gen AGPopt vào cây sắn. Đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên quy trình nuôi cấy mô, tái sinh qua phôi soma trên cây sắn ở Việt Nam được nghiên cứu hoàn thiện. Gen mã hóa AGPase ở vi khuẩn E. coli có hoạt tính xúc tác tạo nguyên liệu cho tổng hợp tinh bột được cải biến phù hợp biểu hiện trong hệ thống thực vật, tạo đột biến (AGPopt) nâng cao hoạt tính enzim và được chuyển vào vector biểu hiện thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen.
Quy trình chuyển gen chỉ thị gus đã được xây dựng thành công trên cây sắn KM94 thông qua vi khuẩn A. Bước đầu xác định sự có mặt của gen nhân tạo AGPopt mã hóa AGPase trong cây sắn KM94. Ý nghĩa hoa học v thực tiễn Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma của một số giống sắn hiện đang được canh tác ở Việt Nam. 4 Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh các giống sắn mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công tác chuyển gen.
Quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn thông qua A. tumefaciens là cơ sở khoa học để cải tiến giống sắn; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng. Kết quả biến đổi, tổng hợp nhân tạo gen mã hóa AGPase (AGPopt), thiết kế vector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá là cơ sở khoa học cho việc tạo ra các giống sắn cao sản. Bước đầu xác định được sự có mặt của gen AGPopt trong cây sắn chuyển gen, là cơ sở cho các xác định tiếp theo về biểu hiện của gen AGPopt trong cây sắn.
5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Giới thiệu chung về cây sắn 1. Đặc điểm thực vật học Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (ITIS, 2012), thuộc loài Manihot esculenta, chi Manihot, tông Manihoteae, phân họ Crotonoideae, họ Euphorbiaceae, bộ Malpighiales (tên khác: khoai mì, cassava, tapioca. Trong chi Manihot có khoảng 98 loài nhưng chỉ có Manihot esculenta Crantz là loài đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp (OECD, 2014).
Cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây khoảng 5. Trung tâm phát sinh cây sắn được giả thiết tại vùng Đông Bắc của Brazil thuộc lưu vực sông Amazon (OECD, 2014). Theo Hoàng Kim và Phạm Văn Biên (1995), cây sắn được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVIII, hiện chưa có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên. Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (OECD, 2014).
Sắn có 98 loài hoang dại nhưng được chia thành hai nhóm chính: sắn ngọt và sắn đắng (OECD, 2014). Sắn là cây đa bội thể phức tạp, dị hợp, bộ nhiễm sắc thể 2n = 36, thể tam bội và tứ bội có số nhiễm sắc thể tương ứng 54 và 72 (OECD, 2014). Sắn có khả năng chịu đựng trong điều kiện sống bất lợi như khí hậu khô hạn, đất giàu hay nghèo dinh dưỡng, đòi hỏi tối thiểu lượng phân bón, thuốc trừ sâu và nước. Cây sắn là thực vật trung gian giữa C3 và C4 (Saithong et al., 2013; Zhang et al.
Nhiệt độ tối ưu cho quang hợp của các cây trồng trên đồng ruộng là 35 oC nhưng phạm vi quang hợp tối ưu từ 25 đến 45oC (El-Sharkawy et al. Vì vậy, cây sắn thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới. Thân cây sắn có tính chất thân gỗ, có thể mọc cao từ 2 - 4 m, là bộ phận chính để làm giống trong sản xuất. Tại mỗi mắt là một điểm sinh trưởng của chồi nách, tại đây sẽ phát triển thành cành bên hoặc thân cây mới sau khi trồng.
Số lượng thùy của 6 lá trưởng thành tương đối ổn định đối với một giống sắn. Sắn có hoa đơn tính, cả hoa cái và hoa đực cùng nằm trên một chùm hoa, sau khi hoa cái được thụ phấn, bầu nhụy cái phát triển thành quả (OECD, 2014). Rễ củ được hình thành do sự phân hóa hình thành của rễ con và sự phình to của rễ (phần rễ mọc ngang). Củ có thể dài tới 1m (trung bình từ 30 - 60cm), đường kính củ có thể lên đến 14cm (trung bình từ 3 - 7cm).
3 tuần sau khi trồng đã thấy xuất hiện tầng thứ cấp thể hiện sự phân hóa hình thành củ sắn. Tốc độ lớn của củ chia thành 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: 2 - 3 tháng đầu sau khi hình thành củ, tốc độ lớn của củ chậm. Giai đoạn 2: Từ tháng thứ 6 - 8 tốc độ lớn của củ rất nhanh. Giai đoạn 3: Sau giai đoạn 2 đến thu hoạch, tốc độ lớn của củ giảm dần (OECD, 2014) Dinh dưỡng, độc tố: Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khô 20%; trong đó tinh bột chiếm 80%; chất protein, béo, xơ, tro trong 100 g được tương ứng là 0,8 - 2,5 g, 0,2 - 0,3 g, 1,1 - 1,7 g, 0,6 - 0,9 g; chất muối khoáng và vitamin trong 100 g củ sắn là 18,8 - 22,5 mg Ca, 22,5 - 25,4 mg P, 0,02 mg B1, 0,02 mg B2, 0,5 mg PP.
Trong củ sắn, hàm lượng các acid amin không đươc cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu các acid amin chứa lưu huỳnh.