Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong sản xuất nông nghiệp, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã và đang gây ra nhiều hệ lụy tiêu cực đối với môi trường sinh thái, làm gia tăng hiện tượng kháng thuốc ở côn trùng gây hại và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Nhằm đáp ứng nhu cầu phát triển nông nghiệp sạch và bền vững, các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng sinh protein tinh thể độc (Cry, Cyt) tiêu diệt chọn lọc côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Cánh cứng (Coleoptera) và Hai cánh (Diptera) mà không gây độc hại cho sinh vật không đích.

Bên cạnh protein tinh thể độc, vi khuẩn B. thuringiensis trong quá trình sinh trưởng còn sản sinh hệ enzym ngoại bào, đặc biệt là enzym thủy phân chitin (chitinase - EC 3.2.1.14). Màng peritrophic bao bọc ruột giữa của côn trùng có thành phần cấu tạo cơ bản là mạng lưới sợi chitin liên kết với protein, đóng vai trò như một hàng rào cơ học bảo vệ đường tiêu hóa. Khi có sự hiện diện của endochitinase, enzym này thủy phân ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-(1,4)-glucoside trong mạch chitin, làm suy yếu và gây thủng màng peritrophic, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho độc tố tinh thể Cry dễ dàng tiếp cận các thụ thể đặc hiệu trên biểu mô ruột, làm gia tăng độc lực diệt sâu hại. Đồng thời, chitinase còn có khả năng phân hủy vách tế bào nấm chứa chitin, ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài nấm gây bệnh thực vật nguy hiểm.

Mặc dù tiềm năng ứng dụng của chitinase từ Bt là rất lớn, các nghiên cứu tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung vào việc khảo sát hoạt tính chitinase tự nhiên hoặc tối ưu hóa môi trường lên men ở một số vi sinh vật bản địa, hiệu suất sinh enzym từ các chủng hoang dại còn thấp và quá trình biểu hiện chịu nhiều biến động của môi trường. Khoảng trống nghiên cứu đặt ra là cần tuyển chọn chủng B. thuringiensis bản địa có hoạt tính phân giải chitin cao, thực hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa endochitinase (chiA), ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu hiện gen này trong vật chủ Escherichia coli, tối ưu hóa điều kiện biểu hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), tinh sạch và xác định đặc tính hóa lý của enzym tái tổ hợp (rChiA), đồng thời đánh giá khả năng bảo vệ kép (dual control) vừa kháng nấm gây bệnh cây trồng vừa tăng cường hoạt lực diệt sâu hại khi phối hợp với protein tinh thể Cry. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài luận án "Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

  • Mục tiêu chung: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong Escherichia coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn.
    2. Biểu hiện và tinh sạch chitinase tái tổ hợp trong E. coli, tối ưu điều kiện biểu hiện và nghiên cứu tính chất hóa lý của enzym tái tổ hợp.
    3. Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật.

Nội dung nghiên cứu

  1. Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao.
  2. Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng B. thuringiensis tuyển chọn.
  3. Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập từ chủng B. thuringiensis tuyển chọn.
  4. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase từ chủng B. thuringiensis tuyển chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp.
  5. Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp.
  6. Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh thể Cry.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ đất thuộc 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam; chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 mang gen chiA; vector tách dòng pGEM-T Easy; vector biểu hiện pET28b(+); chủng tế bào chủ Escherichia coli DH5$\alpha$ và E. coli BL21(DE3); enzym endochitinase tái tổ hợp (rChiA); các loài nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Mucor sp.) và sâu hại bộ Cánh vảy (sâu tơ, sâu khoang - Spodoptera litura).
  • Phạm vi nghiên cứu: Luận án được thực hiện tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Phòng Công nghệ sinh học Vi sinh, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành và bảo vệ năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Tác dụng tương hỗ giữa chitinase và chế phẩm B. thuringiensis đã được ghi nhận từ những năm 1970 qua các nghiên cứu của Smirnoff (1973) và Morris (1976) trên ấu trùng Choristoneura fumiferana gây hại cây thông; Dubois (1977) trên bướm đêm Lymantria dispar; Gunner và cộng sự ghi nhận hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng 5 lần khi có sự tương trợ của chitinase vi khuẩn. Regev và cộng sự chứng minh hỗn hợp độc tố Bt tái tổ hợp nồng độ thấp kết hợp với endochitinase từ Serratia marcescens làm tăng độc tính với Spodoptera littoralis, đồng thời tăng hiệu quả của Cry1Ac chống Helicoverpa armigera và Cry1C chống Spodoptera littoralis. Wiwat và cộng sự chứng minh độc tính của hỗn hợp bào tử và tinh thể từ B. thuringiensis serovar kurstaki HD-1 đối với sâu bướm tăng rõ rệt khi bổ sung chitinase, gây tổn thương và phân hủy tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng.

Các nghiên cứu ứng dụng và biến nạp gen chitinase tiếp tục được phát triển:

  • Liu và cộng sự (2002) chứng minh chitinase từ Bt. pakistani làm tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua của chủng Bt DL5789 lên 2,35 lần.
  • Lertcanawanichakul và cộng sự (2003) chuyển gen chitinase vào Bt. aizawai, giúp hoạt tính chitinase tăng gấp 15 lần.
  • Arora và cộng sự (2003) biểu hiện gen chitinase từ chủng Bt HD-1 trong E. coli, phối hợp với protein Vip của Bt để kháng ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura.
  • Reyes-Ramirez và cộng sự (2004) chứng minh chitinase từ Bt. israelensis ức chế 100% nấm Sclerotium rolfsii, ức chế 55 - 82% các loài Aspergillus flavus, Nigrospora sp., A. niger, Fusarium sp., A. candidus, Absidia sp., Helminthosporium sp., giúp tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương nhiễm nấm từ 25% lên 90% ở nồng độ 0,8 U/mg protein.
  • Driss và cộng sự (2005) xác định gen chi255 từ Bt. kurstaki thuộc lớp chitobiosidase có hoạt tính kháng nấm cao.
  • Kamil và cộng sự (2007) phân lập chủng Bt MS4 sinh chitinase cao kháng mạnh Sclerotium rolfsii.
  • Usharani (2011) phân lập gen exochitinase kích thước 1129 bp mã hóa 360 amino acid kháng 4 loại nấm gây bệnh thực vật.
  • Gomaa (2012) khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ Bt và B. licheniformis, xác định nguồn nitơ casein cho hiệu quả cao.
  • Kuzu và cộng sự (2012) phân lập B. kurstaki HBK-51 sinh chitinase chịu nhiệt và kiềm (ở 110°C còn 96% hoạt tính, ở pH 9 - 12 còn 98% hoạt tính).
  • Ni và cộng sự (2015) phân lập gen chiA từ B. thuringiensis YBT-9602, đột biến điểm ChiW50A giúp tăng 60% hoạt tính thủy phân chitin và nâng cao khả năng cộng hưởng diệt ấu trùng Helicoverpa armigera, Caenorhabditis elegans.
  • de la Fuente-Salcido và cộng sự (2016) tạo dòng và biểu hiện gen chiA từ B. tenebrionis DSM-2803 trong E. coli, tinh sạch protein tái tổ hợp gắn 6-His bằng sắc ký ái lực và chứng minh khả năng ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides.
  • Các nghiên cứu tách dòng và biểu hiện chitinase từ vi sinh vật khác trong E. coli: Tsujibo và cộng sự (1993) với Alteromonas sp. O-7 (gen dài 3394 bp mã hóa protein 820 amino acid, 87 kDa); Lan và cộng sự (2006) với Aeromonas hydrophila SUWA-9 (chiA mã hóa 865 amino acid, 91,6 kDa); Yang và cộng sự với chi18 từ B. subtilis CHU26 chuyển vào E. coli ức chế >90% nấm Rhizoctonia solani trên cây củ cải (Raphanus sativus); Lobo và cộng sự (2013) với chitinase từ Chromobacterium violaceum ATCC 12472 (43,8 kDa); Castañeda-Ramírez và cộng sự (2013) biểu hiện chiA74 của Bt trong E. coli K12 đạt hoạt tính tăng xấp xỉ 500%; Mehtap và cộng sự (2015) biểu hiện chiA, chiB, chiC từ S. marcescens.

Tình hình nghiên cứu trong nước và vị trí của luận án

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về chitinase và chitosanase đã được tiến hành trên nhiều đối tượng:

  • Nguyễn Thị Ngọc Liên và cộng sự (2012, 2013) nghiên cứu endochitosanase tái tổ hợp, biểu hiện gen csn mã hóa chitosanase của B. cereus HN90 trong nấm men (dòng L6 đạt hoạt tính 322,4 U/ml) để sản xuất chitooligosaccharide.
  • Nguyễn Ngọc Mai và Vũ Văn Hạnh (2013), Nguyễn Hồng Minh và cộng sự tối ưu hóa sinh chitinase từ chủng nấm đột biến Lecanicillium lecanii đạt 1,611 U/ml.
  • Nguyễn Hữu Quân và cộng sự (2015) tinh sạch chitinase từ L. lecanii 43H (33 kDa, hoạt tính riêng 167,5 U/mg) và biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men.
  • Đinh Minh Hiệp (2012) nghiên cứu hệ enzym chitinase và $\beta$-glucanase từ Trichoderma spp. trong kiểm soát sinh học nấm bệnh.
  • Hà Hồng Hạnh và cộng sự (2013) phân lập gen chitinase thiết kế vector biểu hiện ở thực vật.
  • Quách Ngọc Tùng và cộng sự (2012, 2013) tối ưu hóa môi trường sinh chitinase của B. licheniformis DS23 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (đạt 110,3 U/ml) và biểu hiện gen chi của B. licheniformis KNUC213 trong E. coli (60 kDa, hoạt tính tăng 9,5 lần).
  • Vũ Thị Thanh và cộng sự (2013) nghiên cứu sinh chitinase từ nấm Penicillium sp. M4 trên môi trường lên men rắn đạt 8,02 U/ml.

Vị trí lựa chọn của luận án: Luận án tập trung khai thác nguồn gen bản địa của vi khuẩn B. thuringiensis tại Việt Nam, đi từ phân lập, định danh huyết thanh tiêm mao H, sàng lọc gen chiA, tách dòng và biểu hiện gen chiA từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 trong hệ thống E. coli pET28b(+), tối ưu hóa lên men tái tổ hợp bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA, giải mã cấu trúc phân tử - động học enzym và kiểm chứng thực nghiệm khả năng "bảo vệ kép" (Dual control): vừa ức chế các chủng nấm bệnh thực vật (F. oxysporum, R. solani), vừa phối hợp hiệp đồng nâng cao hiệu lực diệt sâu hại bộ Cánh vảy với protein tinh thể Cry.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và phân loại enzym

  • Bản chất của chitin: Chitin là polymer sinh học mạch thẳng cấu tạo từ các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) liên kết với nhau qua liên kết $\beta$-(1,4)-glycoside; công thức phân tử $(C_8H_{13}O_5N)_n$, khối lượng phân tử $(203,09)_n$ (gồm C: 47,29%; H: 6,4%; O: 39,4%; N: 6,91%). Chitin tồn tại ở 3 dạng đồng hình: $\alpha$-chitin (các chuỗi sắp xếp đối song song ngược chiều, bền vững nhất, phổ biến ở vỏ giáp xác, côn trùng và vách tế bào nấm), $\beta$-chitin (các chuỗi song song cùng chiều, có ở mực) và $\gamma$-chitin (cấu trúc xen kẽ hai chuỗi xuôi với hai chuỗi ngược).
  • Phân loại Chitinase (EC 3.2.1.14): Thuộc phân lớp hydrolase (EC 3), tổ 2 (thủy phân liên kết glycoside), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và S-glycoside).
    • Theo cơ chế phân cắt:
      1. Endochitinase (EC 3.2.1.14): Phân cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-(1,4) bên trong nội mạch chitin và chitodextrin, giải phóng các oligomer mạch ngắn như diacetyl-chitobiose $(GlcNAc)_2$, triacetyl-chitotriose $(GlcNAc)_3$, tetraacetyl-chitotetraose $(GlcNAc)_4$.
      2. Exochitinase: Gồm Chitobiosidase (EC 3.2.1.29) cắt tuần tự từ đầu không khử giải phóng $(GlcNAc)_2$; và N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.52) phân cắt các chitooligomer thành monomer N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc).
    • Theo cấu trúc phân tử: Chia thành 3 họ glycosyl hydrolase: họ GH18 (cấu trúc nếp gấp $(\alpha/\beta)_8$ barrel, cơ chế giữ nguyên cấu hình, bị ức chế bởi allosamidin), họ GH19 (cấu trúc hình cầu giàu chuỗi xoắn $\alpha$, cơ chế đảo cấu hình, không bị ức chế bởi allosamidin), và họ GH20 ($\beta$-N-acetylhexosaminidase).
  • Cấu trúc không gian của protein ChiA: Endochitinase ChiA từ vi khuẩn Bt gồm 3 domain chức năng chính:
    1. Vùng xúc tác (Catalytic domain): Chứa motif bảo tồn đặc trưng họ GH18 tại vị trí amino acid 203 - 211 (Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu) cùng các gốc amino acid thơm bảo tồn Trp171, Phe177, Trp210 giữ vai trò xúc tác thủy phân.
    2. Vùng tương tự fibronectin (Fibronectin-like domain - FLD): Đóng vai trò liên kết cấu trúc và hỗ trợ tiếp cận cơ chất.
    3. Vùng gắn cơ chất chitin (Chitin-binding domain - CBD): Nằm ở đầu C (vị trí amino acid 587 - 629) chứa các gốc thơm bảo tồn Trp591, Tyr595, Trp626 chịu trách nhiệm gắn kết đặc hiệu với sợi chitin.
+-------------------------------------------------------------------------------+
|                           CẤU TRÚC MIỀN PROTEIN ChiA                          |
| [Đầu N] ===> | Miền Xúc tác (Catalytic) | ===> | Miền FLD | ===> | Miền CBD (Đầu C) | |
|               (Phe203 - Glu211; GH18)            (Liên kết)      (Trp591, Tyr595, Trp626)
+-------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp vi sinh vật học, sinh học phân tử, hóa sinh enzym, tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm và thử nghiệm hoạt tính sinh học:

  1. Phương pháp vi sinh vật học:

    • Thu thập mẫu đất tại 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam, xử lý sốc nhiệt để loại tạp khuẩn và phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis trên môi trường thạch MPA/LB.
    • Nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue để quan sát dưới kính hiển vi hình thái bào tử (hình oval, bắt màu xanh nhạt) và tinh thể protein độc (hình lưỡng tháp, lập phương hoặc hình cầu, bắt màu xanh đậm).
    • Phân loại dưới loài (serovar) theo phương pháp de Barjac và Bonnefoi (1962) dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên tiêm mao H với các kháng thể chuẩn đặc hiệu.
    • Sàng lọc khả năng sinh chitinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa chitin dạng keo (colloidal chitin 1%), đánh giá thông qua đường kính vòng phân giải ($D - d$, mm).

  2. Phương pháp sinh học phân tử:

    • Tách chiết DNA tổng số của các chủng Bt được tuyển chọn.
    • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen mã hóa endochitinase (chiA) bằng kỹ thuật PCR.
    • Tách dòng đoạn gen chiA vào vector pGEM-T Easy, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5$\alpha$, sàng lọc khuẩn lạc trắng/xanh trên môi trường chọn lọc chứa ampicillin, IPTG và X-gal.
    • Tách chiết plasmid tái tổ hợp, cắt kiểm tra bằng enzym cắt hạn chế, giải trình tự nucleotide và phân tích mức độ tương đồng trình tự nucleotide/amino acid với ngân hàng dữ liệu GenBank (NCBI) bằng phần mềm BLAST.
    • Cắt đoạn gen chiA và vector biểu hiện pET28b(+) bằng hai enzym cắt hạn chế EcoRI và XhoI, tiến hành nối ghép bằng T4 DNA ligase để tạo vector biểu hiện tái tổ hợp pET28b/chiA (mang đuôi 6-Histidine ở đầu C), biến nạp vào chủng chủ E. coli BL21(DE3).

  3. Phương pháp hóa sinh và tinh sạch protein:

    • Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp rChiA bằng IPTG hoặc lactose.
    • Phá vỡ tế bào bằng phương pháp siêu âm, thu dịch chiết tế bào.
    • Kiểm tra sự biểu hiện protein bằng điện di gel polyacrylamide có chứa sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE 10 - 12%) và phân tích Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag.
    • Kiểm tra hoạt tính enzym tại chỗ trên gel SDS-PAGE bằng kỹ thuật Zymogram có bổ sung cơ chất glycol chitin hoặc chitin dạng keo.
    • Tinh sạch enzym rChiA mang đuôi 6xHis qua cột sắc ký ái lực kim loại Ni-NTA (HiTrap IMAC), rửa giải bằng đệm chứa imidazole ở gradient nồng độ thích hợp.
    • Định lượng protein tổng số theo phương pháp Bradford (sử dụng đường chuẩn BSA).
    • Xác định hoạt độ enzym chitinase bằng phương pháp DNS (Miller, 1959) đo lượng đường khử N-acetylglucosamine giải phóng ở bước sóng 540 nm (1 đơn vị hoạt độ U được định nghĩa là lượng enzym xúc tác giải phóng 1 $\mu\text{mol}$ GlcNAc trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn).
    • Phân tích sản phẩm thủy phân chitin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).

  4. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men:

    • Khảo sát các yếu tố đơn lẻ ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện: nồng độ chất cảm ứng (IPTG, lactose), mật độ tế bào khi cảm ứng ($OD_{600}$), nhiệt độ sau cảm ứng (20 - 37°C), thời gian cảm ứng (1 - 10 giờ).
    • Áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) theo mô hình thực nghiệm Box-Behnken Design (BBD) gồm 20 thí nghiệm để đánh giá tương tác giữa 3 yếu tố ảnh hưởng chính và xây dựng phương trình hồi quy bậc 2 dự đoán hoạt độ enzym.

  5. Phương pháp nghiên cứu đặc tính hóa lý của enzym tái tổ hợp rChiA:

    • Xác định nhiệt độ tối ưu ($T_{opt}$) và độ bền nhiệt (ủ enzym ở các nhiệt độ khác nhau trước khi đo hoạt tính).
    • Xác định pH tối ưu ($pH_{opt}$) và độ bền pH (sử dụng các hệ đệm có dải pH từ 3,0 đến 11,0).
    • Đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại ($Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Co^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Ba^{2+}$) và chất tạo phức EDTA ở nồng độ 1 mM và 10 mM.
    • Đánh giá ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt / chất tẩy rửa (SDS, Tween 20, Tween 80, Triton X-100) và các dung môi hữu cơ (ethanol, methanol, acetone, DMSO, isopropanol).
    • Xác định các thông số động học enzym ($K_m$, $V_{max}$) đối với cơ chất chitin dạng keo và cơ chất huỳnh quang 4-MU-$(GlcNAc)_3$ bằng đồ thị Lineweaver-Burk.

  6. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học:

    • Khả năng kháng nấm: Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng sợi nấm của các loài Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Mucor sp. trên đĩa thạch PDA bằng phương pháp đối kháng đĩa thạch và xử lý dịch enzym rChiA (so sánh với đối chứng sử dụng enzym đã bất hoạt nhiệt). Quan sát sự biến dạng, đứt gãy sợi nấm dưới kính hiển vi.
    • Tác dụng tăng cường diệt sâu: Thử nghiệm sinh học đường tiêu hóa trên ấu trùng sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu khoang (Spodoptera litura) tuổi 2 - 3 bằng phương pháp nhúng lá thức ăn trong dung dịch chứa hỗn hợp protein tinh thể Cry và rChiA ở các tỷ lệ nồng độ khác nhau. Theo dõi tỷ lệ sâu chết sau 24, 48 và 72 giờ để xác định giá trị $LC_{50}$ (nồng độ gây chết 50% cá thể thử nghiệm).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các cơ sở lý luận và thành tựu nghiên cứu thực tiễn liên quan đến đề tài:

  • Trình bày đặc điểm phân loại học, hình thái, chu trình sinh trưởng và cơ chế tổng hợp protein tinh thể độc (Cry, Cyt) của vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
  • Tổng kết cấu trúc phân tử, dạng tồn tại tự nhiên của cơ chất chitin ($\alpha$, $\beta$, $\gamma$) và phân loại enzym chitinase theo phân loại quốc tế IUBMB, theo cơ chế phân cắt (endochitinase, chitobiosidase, N-acetylglucosaminidase) và theo cấu trúc phân tử (họ GH18, GH19, GH20).
  • Phân tích chi tiết mô hình cấu trúc 3 vùng (catalytic domain, fibronectin-like domain, chitin-binding domain) của endochitinase họ 18, các amino acid bảo tồn tại tâm xúc tác và vùng gắn cơ chất.
  • Tổng hợp các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym tự nhiên và enzym tái tổ hợp (nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ, chất cảm ứng IPTG/lactose).
  • Khái quát hệ thống biểu hiện E. coli, các ưu điểm và hạn chế của vector dòng pET (promoter T7, His-tag), cơ chế điều hòa biểu hiện gen ngoại lai.
  • Tổng kết các ứng dụng đa dạng của chitinase trong nông nghiệp (phòng trừ nấm bệnh, nâng cao hiệu lực chế phẩm diệt sâu Bt), bảo vệ môi trường (xử lý phế phụ phẩm vỏ tôm cua), y dược (sản xuất oligomer chức năng, hỗ trợ chẩn đoán nhiễm nấm) và công nghệ sinh học (tạo tế bào trần).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa:

  • Vật liệu: Các chủng Bt phân lập từ các mẫu đất Việt Nam; chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1; chủng E. coli DH5$\alpha$, E. coli BL21(DE3); vector pGEM-T Easy (Promega), vector pET28b(+) (Novagen); các chủng nấm kiểm định (F. oxysporum, R. solani, F. solani, Mucor sp.); sâu thí nghiệm (sâu tơ, sâu khoang).
  • Môi trường nuôi cấy: Môi trường Luria-Bertani (LB), môi trường thạch MPA, môi trường khoai tây đường PDA, môi trường cơ sở MTCS bổ sung chitin dạng keo (colloidal chitin).
  • Hóa chất và enzym: Enzym giới hạn (EcoRI, XhoI), T4 DNA ligase, Taq DNA polymerase, hóa chất nhuộm SDS-PAGE, cơ chất huỳnh quang 4-MU-$(GlcNAc)_3$, thuốc thử DNS, IPTG, X-gal, kanamycin, ampicillin.
  • Quy trình chuẩn bị: Phương pháp điều chế chitin dạng keo từ vỏ tôm; quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR; phương pháp biến nạp tế bào khả biến bằng sốc nhiệt; kỹ thuật tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực HisTrap HP (Ni-NTA); quy trình tối ưu hóa biểu hiện 3 yếu tố 20 nghiệm thức theo mô hình Box-Behnken (RSM); quy trình thử nghiệm độc lực sinh học trên ấu trùng sâu hại và đo đường kính vòng ức chế nấm.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 6 nội dung nghiên cứu chính:

  1. Phân lập và tuyển chọn chủng B. thuringiensis sinh chitinase:

    • Phân lập được 36 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất thu thập tại 7 vùng địa lý sinh thái Việt Nam.
    • Quan sát hình thái dưới kính hiển vi: tế bào hình que, Gram dương, sinh bào tử hình oval và tinh thể protein độc có hình dạng khác nhau (hình lưỡng tháp, hình khối lập phương, hình cầu).
    • Phân loại bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh tiêm mao H (phương pháp de Barjac và Bonnefoi) xác định được các chủng thuộc thứ loài kurstaki (Btk).
    • Sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin dạng keo trên đĩa thạch: xác định được 11 chủng có đường kính vòng phân giải lớn ($\ge 25\text{ mm}$); trong đó chủng ký hiệu B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 (phân lập tại Hà Nội) biểu hiện hoạt tính phân giải chitin mạnh nhất và mang gen chiA.

  2. Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp chitinase của chủng tuyển chọn:

    • Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, nhiệt độ (tối ưu ở 30°C), pH môi trường (tối ưu ở pH 7,0), nguồn carbon (chitin dạng keo 1% là cơ chất cảm ứng tối ưu) và nguồn nitơ hữu cơ (cao nấm men và peptone) đến khả năng tích lũy chitinase ngoại bào của chủng MSS1.1.

  3. Tách dòng và giải trình tự gen chiA:

    • Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại thành công đoạn gen chiA từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1.
    • Tách dòng đoạn gen vào vector pGEM-T Easy; giải trình tự nucleotide và phân tích tin sinh học.
    • So sánh trình tự nucleotide và amino acid suy diễn với các trình tự trên GenBank (mã số EF581163 và ABQ65137.2) xác định các vị trí sai khác đặc thù của chủng MSS1.1.
    • Phân tích cấu trúc phân tử xác định protein ChiA thuộc họ glycosyl hydrolase 18 (GH18), có cấu trúc 3 miền điển hình: Miền xúc tác chứa motif Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu (aa 203 - 211) và các gốc bảo tồn Trp171, Phe177, Trp210; miền Fibronectin-like (FLD); và miền gắn chitin (CBD, aa 587 - 629) chứa Trp591, Tyr595, Trp626.

  4. Biểu hiện gen chiA trong E. coli và tối ưu hóa điều kiện lên men:

    • Thiết kế thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pET28b/chiA mang gen chiA liên kết với đoạn mã hóa đuôi 6xHis ở đầu C; biến nạp thành công vào chủng chủ E. coli BL21(DE3).
    • Phân tích SDS-PAGE và Western blot xác nhận protein tái tổ hợp rChiA được biểu hiện ở dạng hòa tan với khối lượng phân tử khoảng 74 kDa. Kiểm tra hoạt tính bằng Zymogram trên gel cho thấy vạch protein phân giải cơ chất rõ nét.
    • Khảo sát các yếu tố đơn lẻ ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện: nồng độ chất cảm ứng IPTG (tối ưu ở 0,6 - 0,8 mM), chất cảm ứng thay thế lactose (nồng độ tối ưu 4 - 6 g/l), mật độ tế bào cảm ứng ($OD_{600} \approx 0,6 - 0,8$), thời gian cảm ứng (4 - 6 giờ) và nhiệt độ cảm ứng (25 - 30°C).
    • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) theo mô hình Box-Behnken Design gồm 20 thí nghiệm với 3 biến số chính. Kết quả phân tích phương sai hồi quy (ANOVA) cho thấy mô hình có ý nghĩa thống kê cao ($R^2 > 0,95$), kiểm định thực nghiệm xác nhận sự tương thích chặt chẽ giữa giá trị dự đoán từ mô hình và kết quả thực tế.

  5. Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính hóa lý của enzym tái tổ hợp rChiA:

    • Tinh sạch enzym rChiA bằng sắc ký ái lực Ni-NTA trên cột HisTrap, thu được enzym có độ sạch cao (thể hiện một băng đồng nhất trên SDS-PAGE ở kích thước ~74 kDa).
    • Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu của rChiA là 45 - 50°C; enzym bền nhiệt ở dải nhiệt độ dưới 45°C.
    • pH: pH tối ưu của rChiA là 6,0 - 7,0; enzym bền trong dải pH từ 5,0 đến 8,0.
    • Ảnh hưởng của ion kim loại và hóa chất: Hoạt tính rChiA được kích hoạt bởi các ion $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Co^{2+}$; bị ức chế mạnh bởi các ion $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Ba^{2+}$ và chất tạo phức EDTA. Các chất hoạt động bề mặt Tween 20, Tween 80 ở nồng độ thấp ít ảnh hưởng, trong khi SDS làm giảm mạnh hoạt tính enzym. Enzym duy trì độ bền tương đối tốt trong một số dung môi hữu cơ phân cực ở nồng độ thấp.
    • Động học enzym: Xác định các thông số $K_m$ và $V_{max}$ trên cơ chất chitin dạng keo và cơ chất huỳnh quang 4-MU-$(GlcNAc)_3$ thông qua đồ thị Lineweaver-Burk.
    • Sản phẩm thủy phân: Phân tích TLC khẳng định rChiA là một endochitinase, thủy phân chitin giải phóng chủ yếu là diacetyl-chitobiose $(GlcNAc)_2$ và các chitooligosaccharide ngắn, sau đó chuyển hóa dần thành GlcNAc.
Thông số nghiên cứu của enzym tái tổ hợp rChiA Giá trị / Đặc tính xác định
Khối lượng phân tử (SDS-PAGE & Western blot) $\approx 74\text{ kDa}$
Họ cấu trúc enzym Glycosyl hydrolase họ 18 (GH18)
Nhiệt độ tối ưu ($T_{opt}$) $45 - 50^\circ\text{C}$
Độ bền nhiệt Bền ở nhiệt độ $< 45^\circ\text{C}$ (duy trì $>80%$ hoạt tính sau 1 giờ)
pH tối ưu ($pH_{opt}$) $6,0 - 7,0$ (tính chất enzym trung tính)
Độ bền pH Bền trong khoảng $\text{pH } 5,0 - 8,0$
Tác nhân kích hoạt hoạt tính $\text{Ca}^{2+}$, $\text{Mg}^{2+}$, $\text{Mn}^{2+}$, $\text{Co}^{2+}$
Tác nhân ức chế hoạt tính $\text{Zn}^{2+}$, $\text{Cu}^{2+}$, $\text{Fe}^{2+}$, $\text{Ba}^{2+}$, EDTA, SDS
Sản phẩm thủy phân chính (phân tích TLC) $(\text{GlcNAc})_2$, $(\text{GlcNAc})_3$, GlcNAc (kiểu cắt endo-)
  1. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của enzym tái tổ hợp rChiA:
    • Khả năng kháng nấm gây bệnh thực vật: rChiA thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự nảy mầm và phát triển hệ sợi của các loài nấm kiểm định: Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, và Mucor sp. Hình ảnh kính hiển vi cho thấy dưới tác động của rChiA, sợi nấm bị biến dạng, phình to bất thường, teo rỗng và đứt gãy cấu trúc thành tế bào so với đối chứng sử dụng enzym bất hoạt.
    • Khả năng tăng cường hoạt tính diệt sâu hại: Thử nghiệm phối hợp rChiA với dịch protein tinh thể Cry của B. thuringiensis trên ấu trùng sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu khoang (Spodoptera litura) tuổi 2 - 3. Kết quả chứng minh sự có mặt của rChiA làm giảm rõ rệt giá trị $LC_{50}$ của chế phẩm protein tinh thể Cry so với khi chỉ sử dụng đơn lẻ protein Cry, rút ngắn thời gian gây chết ấu trùng và gia tăng đáng kể hiệu lực diệt sâu.

Chương 4: Bàn luận kết quả

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các phát hiện của luận án với các công trình đã công bố trong và ngoài nước:

  • Bàn luận về tính đa dạng và đặc điểm sinh học của nguồn gen B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam, đặc biệt là mối tương quan giữa hình thái tinh thể, nhóm huyết thanh tiêm mao H (kurstaki) với khả năng sinh tổng hợp endochitinase.
  • So sánh trình tự gen chiA và mô hình không gian protein ChiA từ chủng MSS1.1 với các trình tự tương đồng trên thế giới như chiA74 từ Bt. kenyae, chiA71 từ Bt. pakistani, khẳng định tính bảo tồn của vùng xúc tác GH18 và vai trò của các gốc amino acid thơm tại vùng CBD trong cơ chế trượt và gắn kết trên vi sợi chitin không tan.
  • Đánh giá hiệu quả của hệ biểu hiện E. coli pET28b(+) và việc sử dụng lactose làm chất cảm ứng kinh tế thay thế IPTG, phân tích sự tương thích của mô hình bề mặt đáp ứng RSM trong việc kiểm soát các thông số lên men tối ưu.
  • So sánh các đặc tính hóa lý (nhiệt độ, pH, ion kim loại, động học enzym) của rChiA với chitinase từ các chủng Bt khác (Bt. tenebrionis, Bt. konkukian, B. licheniformis DS23), khẳng định tính phù hợp của enzym trong điều kiện sinh lý tự nhiên và môi trường nông nghiệp.
  • Làm rõ cơ chế "bảo vệ kép" (Dual control): phân tích cơ chế enzym rChiA phá vỡ màng peritrophic trong ruột sâu tạo điều kiện cho độc tố Cry xâm nhập nhanh vào tế bào biểu mô ruột, đồng thời phân giải vách tế bào nấm chứa chitin, chứng minh tiềm năng khoa học và ứng dụng thực tiễn của enzym tái tổ hợp trong phát triển thuốc bảo vệ thực vật sinh học thế hệ mới.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa tại Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao từ các vùng địa lý khác nhau.
  2. Khẳng định enzym endochitinase tái tổ hợp (rChiA) của chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) - vừa kháng các loài nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật vừa tăng hoạt tính diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc trừ sâu bệnh sinh học thế hệ mới.
  3. Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase (chiA) của các chủng Bacillus thuringiensis Việt Nam phục vụ cho công tác nghiên cứu, đào tạo và định hướng ứng dụng công nghệ sinh học.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

  • Ý nghĩa khoa học:
    • Bổ sung dữ liệu khoa học về đặc điểm sinh học, trình tự gen mã hóa endochitinase (chiA), cấu trúc phân tử và đặc tính động học của enzym chitinase họ GH18 từ vi khuẩn B. thuringiensis bản địa Việt Nam.
    • Cung cấp cơ sở khoa học và vật liệu di truyền tái tổ hợp phục vụ công nghệ lên men vi sinh vật sản xuất enzym năng suất cao, làm phong phú thêm hiểu biết trong lĩnh vực công nghệ protein - enzym.
  • Ý nghĩa thực tiễn:
    • Tạo thành công chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET28b/chiA có khả năng biểu hiện cao chitinase tái tổ hợp có hoạt tính xúc tác mạnh, quy trình tinh sạch đơn giản thông qua cột ái lực Ni-NTA.
    • Xác lập quy trình tối ưu hóa lên men sử dụng chất cảm ứng giá rẻ (lactose), mở ra khả năng hạ giá thành sản xuất enzym quy mô lớn.
    • Cung cấp chế phẩm sinh học tiềm năng có tác dụng kép: tăng cường hiệu lực diệt sâu hại bộ Cánh vảy của chế phẩm BT (giảm liều lượng sử dụng và giảm tính kháng thuốc của sâu) đồng thời kiểm soát nấm bệnh hại cây trồng, hướng tới sản xuất nông nghiệp sạch và an toàn môi trường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng nấm và tác dụng tương hỗ diệt sâu hại của chitinase tái tổ hợp rChiA mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro và thử nghiệm trên lá trong lồng nuôi), chưa triển khai khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng.
  • Quá trình lên men biểu hiện protein tái tổ hợp rChiA được thực hiện trong bình tam giác ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên men trên hệ thống nồi lên men (bioreactor) quy mô pilot.
  • Enzym tái tổ hợp được biểu hiện nội bào trong E. coli, do đó cần qua bước phá vỡ tế bào (siêu âm) để thu hồi dịch enzym.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Thiết kế hệ thống lên men pilot liên tục nhằm tối ưu hóa các thông số cấp khí, tốc độ khuấy, nồng độ cơ chất để nâng cao sản lượng thu hồi enzym rChiA.
  • Nghiên cứu công nghệ tạo dạng chế phẩm sinh học phối hợp ổn định (dạng bột thấm nước WP hoặc dạng nhũ dầu EC) giữa bào tử - tinh thể protein Cry của Bt và dịch enzym endochitinase rChiA.
  • Khảo nghiệm hiệu lực phòng trừ sâu tơ, sâu khoang và bệnh héo rũ, lở cổ rễ do nấm trên các mô hình canh tác cây rau màu ngoài đồng ruộng thực tế.
  • Thử nghiệm chuyển gen chiA từ chủng MSS1.1 vào cây trồng nhằm nâng cao khả năng tự kháng sâu bệnh của giống cây trồng biến đổi gen.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng và ứng dụng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành: Là tài liệu chuyên khảo giá trị thuộc các ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Hóa sinh học và Bảo vệ thực vật; cung cấp phương pháp luận chuẩn xác từ khâu phân lập vi sinh vật, định danh huyết thanh, thiết kế vector biểu hiện, quy hoạch thực nghiệm RSM đến phân tích động học enzym và thử nghiệm sinh học.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về hệ thống enzym thủy phân chitin, cấu trúc - chức năng miền protein họ GH18, và các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong biểu hiện gen ngoại lai.
  • Doanh nghiệp sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học: Cung cấp giải pháp công nghệ tạo nguồn enzym bổ sung nhằm nâng cao hoạt lực diệt sâu của chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis, giảm thiểu chi phí sản xuất thông qua việc sử dụng môi trường cảm ứng lactose thay thế IPTG.

Các phần nội dung đáng tham khảo

  • Quy trình phân loại dưới loài B. thuringiensis bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên tiêm mao H.
  • Thiết kế vector biểu hiện pET28b(+) mang gen ngoại lai có đuôi His-tag và quy trình tinh sạch enzym bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.
  • Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men theo mô hình bề mặt đáp ứng Box-Behnken (RSM).
  • Kỹ thuật Zymogram kiểm tra hoạt tính phân giải chitin trực tiếp trên gel điện di và phương pháp xác định thông số động học Lineweaver-Burk.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao endochitinase từ Bacillus thuringiensis lại có khả năng tăng cường hoạt lực diệt sâu của protein tinh thể Cry?

Màng peritrophic lót trong lòng ruột giữa của ấu trùng côn trùng được cấu tạo từ mạng lưới vi sợi chitin liên kết chặt chẽ với protein, đóng vai trò như màng lọc bảo vệ biểu mô ruột. Endochitinase (EC 3.2.1.14) cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-(1,4)-glycoside nội mạch chitin, phá hủy tính toàn vẹn cấu trúc của màng peritrophic. Sự suy yếu và thủng màng peritrophic giúp độc tố protein tinh thể Cry dễ dàng tiếp cận, gắn kết với các thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào biểu mô ruột, thúc đẩy nhanh quá trình tạo lỗ thủng tế bào, gây rối loạn thẩm thấu và làm sâu chết nhanh hơn ở liều lượng độc tố Cry thấp hơn.

2. Chủng vi khuẩn được lựa chọn để tách dòng gen chiA trong luận án là chủng nào và có nguồn gốc từ đâu?

Chủng vi khuẩn được lựa chọn là Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1. Chủng này được phân lập từ mẫu đất tại khu vực Hà Nội (thuộc 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam), được định danh dưới loài bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên tiêm mao H với kháng thể chuẩn 4D4 và có đường kính vòng phân giải chitin trên đĩa thạch đạt $\ge 25\text{ mm}$.

3. Protein tái tổ hợp rChiA có khối lượng phân tử bao nhiêu và thuộc họ enzym nào?

Protein tái tổ hợp rChiA biểu hiện trong E. coli BL21(DE3) có khối lượng phân tử khoảng 74 kDa (xác định qua điện di SDS-PAGE và Western blot). Enzym thuộc họ glycosyl hydrolase 18 (GH18), có cấu trúc gồm 3 miền chức năng: miền xúc tác chứa motif Phe-Asp-Gly-Val-Asp-Leu-Asp-Trp-Glu (aa 203 - 211), miền liên kết tương tự fibronectin (FLD) và miền gắn cơ chất chitin (CBD, aa 587 - 629).

4. Điều kiện hoạt động tối ưu và độ bền nhiệt, pH của enzym tái tổ hợp rChiA được xác định như thế nào?

Thực nghiệm hóa sinh xác định enzym tái tổ hợp rChiA có nhiệt độ hoạt động tối ưu trong khoảng $45 - 50^\circ\text{C}$ và bền ở nhiệt độ dưới $45^\circ\text{C}$. pH tối ưu của enzym nằm trong dải trung tính từ $6,0 - 7,0$ và enzym duy trì độ bền ổn định trong dải pH từ $5,0 - 8,0$.

5. Enzym rChiA thể hiện hoạt tính đối kháng với những loài nấm gây bệnh thực vật nào?

Enzym rChiA tinh sạch thể hiện khả năng ức chế mạnh sự nảy mầm và phát triển sợi nấm của các loài nấm gây bệnh cây trồng gồm: Fusarium oxysporum (gây bệnh héo vàng/héo rũ), Rhizoctonia solani (gây bệnh lở cổ rễ/đốm vằn), Fusarium solani và nấm Mucor sp.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trịnh Thị Thu Hà đã phân lập và tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn bản địa Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 từ nguồn đất Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp endochitinase cao. Công trình đã tách dòng, giải mã trình tự gen mã hóa chiA, thiết kế thành công vector biểu hiện pET28b/chiA trong vật chủ Escherichia coli BL21(DE3), tối ưu hóa điều kiện biểu hiện bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) và tinh sạch được enzym tái tổ hợp rChiA kích thước 74 kDa. Các kết quả thực nghiệm đã làm sáng tỏ đặc tính hóa lý, động học phản ứng enzym và chứng minh thuyết phục khả năng "bảo vệ kép" của rChiA: vừa ức chế hiệu quả các loài nấm gây bệnh thực vật (F. oxysporum, R. solani), vừa tương hỗ nâng cao hoạt tính diệt sâu hại bộ Cánh vảy của protein tinh thể Cry. Đây là công trình nghiên cứu vi sinh vật học thực nghiệm có giá trị khoa học cao và đóng góp thiết thực cho định hướng phát triển các chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học thế hệ mới tại Việt Nam.