Luận án tiến sĩ sinh học tách dòng biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ bacillus thuringiensis phân lập ở việt nam

Nghiên cứu và tách dòng endochitinase từ Bacillus thuringiensis tại Việt Nam, ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp và công nghiệp sinh học.

• Tác giả: Trịnh Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Đình Bính, Viện Công nghệ sinh học
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Công nghệ sinh học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ sinh học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Nghiên cứu endochitinase

Nghiên cứu endochitinase tập trung vào việc phân tích và ứng dụng enzyme này trong các lĩnh vực khác nhau. Endochitinase là một enzyme thủy phân chitin, có khả năng phân cắt liên kết β-(1,4)-glucoside trong chitin, tạo ra các sản phẩm chitin-oligosaccharide. Enzyme này có tiềm năng lớn trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại. Nghiên cứu này cũng nhấn mạnh việc tách dòng và biểu hiện endochitinase từ Bacillus thuringiensis, một vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme này với hiệu suất cao.

1.1. Khả năng sinh học của endochitinase

Khả năng sinh học của endochitinase được đánh giá qua khả năng thủy phân chitin và ức chế sự phát triển của nấm bệnh. Các nghiên cứu cho thấy endochitinase có thể phân hủy thành tế bào nấm, làm giảm khả năng gây bệnh của chúng. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng endochitinase trong việc phát triển các chế phẩm sinh học thay thế thuốc trừ sâu hóa học.

1.2. Ứng dụng trong nông nghiệp

Ứng dụng trong nông nghiệp của endochitinase được thể hiện qua khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại. Enzyme này có thể được sử dụng như một thành phần trong các chế phẩm sinh học, giúp tăng hiệu quả diệt trừ sâu bệnh mà không gây hại đến môi trường. Ngoài ra, endochitinase còn được nghiên cứu để sản xuất các sản phẩm giá trị cao như chitooligosaccharide và N-acetyl-D-glucosamine.

II. Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là một vi khuẩn gram dương, có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể và các enzyme như endochitinase. Vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học nhờ khả năng diệt côn trùng hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt tại Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp endochitinase cao, nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp.

2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Bt

Phân lập và tuyển chọn chủng Bt được thực hiện thông qua các phương pháp vi sinh và sinh học phân tử. Các chủng Bt được phân lập từ các mẫu đất và thực vật tại Việt Nam, sau đó được sàng lọc dựa trên khả năng sinh tổng hợp endochitinase. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 36 chủng Bt có khả năng sinh tổng hợp enzyme này với hiệu suất cao.

2.2. Khả năng sinh tổng hợp endochitinase

Khả năng sinh tổng hợp endochitinase của các chủng Bt được đánh giá qua các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và nguồn cơ chất. Nghiên cứu cho thấy các chủng Bt có khả năng sinh tổng hợp endochitinase cao trong điều kiện tối ưu, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

III. Tách dòng endochitinase

Tách dòng endochitinase là một bước quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme này. Quá trình này bao gồm việc tách chiết gen mã hóa endochitinase từ Bacillus thuringiensis, sau đó biểu hiện gen này trong các hệ thống tái tổ hợp như E. coli. Nghiên cứu này đã thành công trong việc tách dòng và biểu hiện gen chiA mã hóa endochitinase từ chủng Bt phân lập tại Việt Nam.

3.1. Tách chiết gen chiA

Tách chiết gen chiA được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử như PCR và điện di. Gen chiA được khuếch đại và tách chiết từ chủng Bt phân lập, sau đó được đưa vào vector biểu hiện để tạo ra các dòng tái tổ hợp. Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự nucleotide của gen chiA, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Biểu hiện gen chiA trong E. coli

Biểu hiện gen chiA trong E. coli được thực hiện để sản xuất endochitinase tái tổ hợp. Các dòng E. coli tái tổ hợp được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, và endochitinase được tinh sạch để nghiên cứu các tính chất hóa lý. Kết quả cho thấy endochitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao và tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp.

IV. Ứng dụng trong nông nghiệp

Ứng dụng trong nông nghiệp của endochitinase được thể hiện qua khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại. Enzyme này có thể được sử dụng như một thành phần trong các chế phẩm sinh học, giúp tăng hiệu quả diệt trừ sâu bệnh mà không gây hại đến môi trường. Ngoài ra, endochitinase còn được nghiên cứu để sản xuất các sản phẩm giá trị cao như chitooligosaccharide và N-acetyl-D-glucosamine.

4.1. Kiểm soát nấm bệnh

Kiểm soát nấm bệnh là một trong những ứng dụng quan trọng của endochitinase. Enzyme này có khả năng phân hủy thành tế bào nấm, làm giảm khả năng gây bệnh của chúng. Nghiên cứu này đã chứng minh hiệu quả của endochitinase trong việc ức chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh thực vật như Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani.

4.2. Tăng hiệu quả diệt côn trùng

Tăng hiệu quả diệt côn trùng là một ứng dụng khác của endochitinase. Enzyme này có thể được sử dụng kết hợp với protein tinh thể Cry từ Bacillus thuringiensis để tăng hiệu quả diệt trừ sâu bệnh. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng endochitinase có thể hỗ trợ protein tinh thể Cry trong việc diệt trừ các loại côn trùng gây hại, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU…………………………………………………………. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1. Vi khu n Bacillus thuringiensis………………………………… 5 1. S phát tri n và ng ng c chitin s t.

thuringi nsis tr n th gi i 7 1. Cấu trúc c chitin s …………………………………………………. C ch ho t ộng c chitin s ………………………………………. Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s ………………….

Các y u t nh h ng n quá tr nh sinh t ng h p chitin s. Hệ i u hiện Esch richi co i. Một s y u t nh h ng n quá tr nh n m n t ng h p chitin s tái t h p………………………………………………………………… 29 1. Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p…………………………….

Ứng d ng c a chitinase. Trong nông nghiệp và o vệ môi tr ng. Ứng d ng trong công nghiệp. Ứng d ng trong y c.

Ứng d ng trong c tính sinh kh i nấm. Ứng d ng trong công nghệ sinh học. Sơ lƣ c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng……………………. 36 iv Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.

Vật liệu nghiên cứu. Ch ng gi ng và p smi ………………………………………………… 39 2. Môi tr ng nuôi cấy……………………………………………………… 40 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Ph ng pháp vi sinh. Ph ng pháp hó sinh. Ph ng pháp sinh học phân tử. T i u i u kiện i u hiện th o ph ng pháp mặt áp ng.

Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p. Ph ng pháp thử nghiệm. 57 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3. Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………… 58 3.

Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài các ch ng B. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………….

Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 65 3. Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 66 3.

Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gian nuôi cấy……………………………………………………… 67 3. Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………. pH môi tr ng nuôi cấy……………………………………………….

Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B.4 Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E. Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E. Bi u hiện chiA tái t h p trong E.

Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p……. T i u kh năng i u hiện rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng………………………………………………………………………. Ki m tra s t ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………….

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 90 3. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 90 3. pH t i u và ộ b n pH…………………………………………………. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92 3.

Ảnh h ng c a chất t y rử ……………………………………………. Ảnh h ng c a dung môi hữu c ………………………………………. Động học c a ph n ng nzym ………………………………………. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s …………………….

Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……………………… 95 3. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p…. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p……. 97 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4.

Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………. Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài kurstaki các ch ng B. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng.

thuringi nsis s rov r kurst ki…………………………………………………………. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………. Sàng lọc ho t tính kháng nấm c các ch ng.

thuringi nsis serovar kurst ki………………………………………………………. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gi n nuôi cấy………………………………………………………. Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………… 103 4.

pH môi tr ng nuôi cấy…………………………………………………. Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein ChiA ………………………………. Biểu hiện rChiA trong vi khu n E.

Bi u hiện rChiA trong vi khu n………………………………………… 108 4. T i u i u kiện bi u hiện………………………………………………. T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 112 vii 4. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 113 4.

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 114 4. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 114 4. pH t i u và ộ b n pH………………………………………………… 115 4. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115 4.

Ảnh h ng c chất t y rử. Ảnh h ng c a dung môi hữu c. Động học c a ph n ng enzym. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase.

Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p. 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

122 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 123 TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO………. 130 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ch viết tắt Ch viết ầy Bp Base pair BSA Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bò BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Colloidal chitin Chitin dạng keo cs Cộng sự chiA Gen mã hóa chitinase ĐC Đối chứng dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate DNS 3,5 - dinitrosalicylic E.

coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid EtBr Ethidium Bromide g/l Gam/lít GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)2 Diacetyl-chitobiose (GlcNAc)3 Triacetyl-chitotriose (GlcNAc)4 Tetraacetyl-chitotetraose IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng Kana Kanamycine kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn MTCS Môi trường cơ sở OD Optical density - mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi ix PDA Môi trường khoai tây rChiA Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulphate Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium SDS-PAGE doecyl sulfat Sol Solution – dung dịch TAE Tris acetic acid EDTA TE Tris EDTA U Unit - đơn vị v/p Vòng/phút X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside x DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần các môi trường nuôi cấy………………………… 40 Bảng 2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch…………………. Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập………………………………………… 60 Bảng 3.

Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh………………… 62 Bảng 3. Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk………………. Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase…………. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid……….

Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau………………………………………………. Kết quả của 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng…………. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase………………… 85 Bảng 3. Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thực nghiệm……………… 88 Bảng 3.

Kết quả tinh sạch chitinase tái tổ hợp………………………. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính enzym của rChiA……………………………………………. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau. Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Cry và rChiA………………………………………………………….

98 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu tạo tế bào Bt……………………………………. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H……………………………. Cấu trúc không gian họ chitinase 19….

Sự tương đồng vùng xúc tác của chiA74 với chitinase của các loài khác…………………. Cơ chế hoạt động của enzym chitinase ở Trichoderma. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller…………………………………. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng BSA theo Bradford……… 45 Hình 2.

Bản đồ 7 vùng địa lý của Việt Nam………………………. Khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy…………………………………………………… 59 Hình 3. Hình dạng tinh thể dưới kính hiển vi của một số chủng Bt. Hình ảnh ngưng kết của Bt với huyết thanh đ c hiệu 4D4.

Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B)…. Kết quả sàng lọc gen chiA t các chủng Btk phân lập ở Hà Nội……………………………………. Ảnh kháng nấm R. oxysporum (B) của các chủng Btk………………………………………………….

Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ nuôi cấy (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (A) và nồng độ cơ chất (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 68 Hình 3. Ảnh hưởng của pH môi trường (A) và nguồn các bon (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 69 xii Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ lên khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………………………………… 70 Hình 3.

Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen chiA t các dòng khuẩn lạc trắng (A) và điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết t các khuẩn lạc dòng pGEM-Teasy/MSS1.1 trên gel 1% agarose (B)……………………………………. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA của chủng B.1 với trình tự EF581163. So sánh trình tự amino acid của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 với trình tự có mã số ABQ65137.2 trên ngân hàng dữ liệu……………………… 73 Hình 3.

Cấu trúc 3 vùng của protein ChiA………………………… 74 Hình 3. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen chiA……… 75 Hình 3. Điện di đồ gen chiA (A) và vector pET28b(+) tinh sạch (B) 76 Hình 3. Kết quả PCR khuẩn lạc các dòng biến nạp mang gen chiA với c p mồi đ c hiệu (A) và cắt vector tái tổ hợp pET28b/chiA với EcoRI và XhoI (B)……………….

Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE ……. Phân tích Western blot (A) và kết quả kiểm tra hoạt tính chitinase của dịch chiết protein tái tổ hợp trên đĩa thạch (B)…………. Phổ điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau……………………………………………….