Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại khu bảo tồn thiên nhiên copia và vườn quốc gia xuân sơn

Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng tại Copia và Xuân Sơn, mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong y sinh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Vân
• Người hướng dẫn: PGS.TS Dương Minh Lam
• Trường học: Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học - Vi sinh
• Đề tài: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
• 1.1.1. Nấm và nấm ký sinh côn trùng
• 1.1.1.1. Giới thiệu về nấm
• 1.1.1.2. Sơ lược về nấm ký sinh côn trùng
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.2.1. Phương pháp vi sinh vật học
• 1.2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 1.2.2.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide
• 1.2.2.4. Các phương pháp phân tích
• 1.2.2.5. Phương pháp toán học
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.3.1. Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn
• 1.3.2. Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn
• 1.3.3. Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn
• 1.3.4. Khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập
• 1.3.5. Định loại chủng nấm CPA14V bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử
• 1.3.5.1. Đặc điểm hình thái của chủng nấm CPA14V
• 1.3.5.2. Định loại chủng nấm CPA14V bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.3.6. Nghiên cứu môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm
• 1.3.6.1. Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide
• 1.3.6.2. Ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm
• 1.3.6.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm
• 1.3.6.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của chủng nấm
• 1.3.7. Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ chủng nấm
• 1.3.7.1. Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ chủng nấm ở quy mô phòng thí nghiệm
• 1.3.7.2. Xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide
• 1.3.8. Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các cao chiết tổng, phân đoạn và chất sạch beauvericin của chủng nấm
• 1.3.8.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro
• 1.3.8.2. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
• 1.3.8.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
• 1.4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu cyclooligomer depsipeptide

Nghiên cứu về cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực mới mẻ và đầy tiềm năng. Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ nấm, đặc biệt là từ các loài nấm ký sinh côn trùng. Những hợp chất này được sinh tổng hợp thông qua hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs). COD có khả năng sinh học đa dạng, bao gồm khả năng gây độc tế bào, kháng vi sinh vật và chống ung thư. Nghiên cứu này không chỉ giúp làm rõ sự đa dạng của nấm ký sinh côn trùng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc khai thác các hoạt chất sinh học từ nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú tại Việt Nam.

1.1. Đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) là nhóm nấm có khả năng gây bệnh cho côn trùng. Chúng có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, giúp kiểm soát quần thể côn trùng gây hại. Nghiên cứu cho thấy có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng đã được ghi nhận. Những loài này không chỉ có giá trị trong nông nghiệp mà còn trong y học, nhờ vào khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ. Việc tìm hiểu về đa dạng sinh học của nấm ký sinh côn trùng tại các khu vực như Copia và Xuân Sơn sẽ cung cấp thông tin quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo.

II. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được áp dụng trong luận án này bao gồm việc phân lập và định loại các chủng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn. Các phương pháp vi sinh vật học và sinh học phân tử được sử dụng để xác định đặc điểm hình thái và sinh học của các chủng nấm. Đặc biệt, việc nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide là rất quan trọng. Các yếu tố như pH, nguồn cacbon và nitơ sẽ được khảo sát để tối ưu hóa quy trình sản xuất COD. Kết quả từ các thí nghiệm này sẽ cung cấp cơ sở cho việc tách chiết và tinh sạch COD từ các chủng nấm đã phân lập.

2.1. Tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide

Quy trình tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng được thực hiện thông qua các phương pháp sắc ký hiện đại. Việc xác định cấu trúc hóa học của COD sẽ được thực hiện bằng các kỹ thuật như NMR và LC-MS. Những kết quả này không chỉ giúp khẳng định sự hiện diện của COD mà còn mở ra khả năng ứng dụng trong y dược. Các hoạt tính sinh học của COD cũng sẽ được khảo sát để đánh giá tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh, đặc biệt là trong lĩnh vực chống ung thư.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Copia và Xuân Sơn. Nhiều chủng nấm đã được phân lập và xác định có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide. Đặc biệt, chủng nấm CPA14V đã được định loại và xác định có khả năng sinh tổng hợp COD cao. Các thí nghiệm cho thấy rằng môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp COD. Những phát hiện này không chỉ góp phần làm rõ sự đa dạng sinh học của nấm ký sinh côn trùng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc khai thác các hoạt chất sinh học từ nguồn tài nguyên thiên nhiên tại Việt Nam.

3.1. Tiềm năng ứng dụng của cyclooligomer depsipeptide

Các hoạt chất cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có tiềm năng ứng dụng lớn trong y dược. Chúng có khả năng gây độc tế bào, kháng vi sinh vật và chống ung thư. Nghiên cứu này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới từ nguồn tài nguyên thiên nhiên. Việc khai thác và ứng dụng COD không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn đa dạng sinh học mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành dược phẩm tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thùy Vân, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Dương Minh Lam và TS Ngô Sỹ Hiền. Luận án thuộc chuyên ngành Sinh học / Vi sinh vật học - Công nghệ sinh học, được hoàn thành tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội phối hợp cùng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Học viện Cảnh sát nhân dân.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) là nhóm vi sinh vật có vai trò sinh thái quan trọng với gần 2.000 loài đã được ghi nhận trên thế giới. Nhóm nấm này có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đa dạng như cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid và terpenoid. Trong số đó, cyclooligomer depsipeptide (COD) là nhóm peptolide mạch vòng đặc biệt được sinh tổng hợp ngoài ribosome (nonribosomal peptide) bởi hệ enzyme phức hợp peptide synthetase (NRPSs). Nhóm chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học giá trị như diệt côn trùng, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng virus, ức chế enzyme acyl-CoA: cholesterol acyltransferase (ACAT) liên quan đến tích lũy amyloid ở bệnh Alzheimer, và đặc biệt là khả năng ức chế mạnh sự sinh trưởng của nhiều dòng tế bào ung thư ở người.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng trước đây chủ yếu tập trung vào khảo sát đa dạng thành phần loài hoặc ứng dụng sinh khối để sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học bảo vệ thực vật. Việc nghiên cứu có hệ thống từ khâu phân lập, định loại, khảo sát điều kiện nuôi cấy lên men lỏng để thu nhận hoạt chất COD, tách chiết, tinh sạch và giải mã cấu trúc hóa học của hợp chất này vẫn còn là khoảng trống chưa được công bố. Bên cạnh đó, Khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia (VQG) Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai vùng sinh thái rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới vùng núi phía Bắc có độ đa dạng sinh học cao, nhưng khu hệ nấm ký sinh côn trùng và tiềm năng sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp tại hai địa bàn này hầu như chưa được khảo sát.

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (tỉnh Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (tỉnh Phú Thọ).

Nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu của luận án được triển khai qua 6 nhiệm vụ cụ thể:

1. Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.
2. Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide.
3. Định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phương pháp hình thái kết hợp sinh học phân tử (phân tích đa gen).
4. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy lên men lỏng (pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ) nhằm sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm.
5. Nghiên cứu quy trình tách chiết, thu hồi, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide thu được.
6. Khảo sát một số hoạt tính sinh học (in vitro) của các phân đoạn cao chiết và chất sạch cyclooligomer depsipeptide (hoạt tính gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm vi sinh vật được phân lập từ các mẫu côn trùng bị nhiễm nấm thu thập thực địa tại KBTTN Copia (Sơn La) và VQG Xuân Sơn (Phú Thọ); các phân đoạn cao chiết và hoạt chất cyclooligomer depsipeptide tinh sạch (ký hiệu CC1/beauvericin).
• Phạm vi không gian: Rừng tự nhiên thuộc KBTTN Copia (huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La; tọa độ 21°15' - 21°25' vĩ độ Bắc, 103°30' - 103°44' kinh độ Đông; diện tích 19.426 ha) và VQG Xuân Sơn (huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ; tọa độ 21°03' - 21°12' vĩ độ Bắc, 104°51' - 105°01' kinh độ Đông; diện tích 15.048 ha).
• Phạm vi chuyên môn và thời gian: Thực nghiệm vi sinh vật học, sinh học phân tử, lên men sinh học quy mô bình tam giác tại phòng thí nghiệm, phân tích hóa học các hợp chất thiên nhiên (HPLC, LC/MS Q-TOF, NMR 1D và 2D), và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (hoàn thành tháng 4 năm 2022).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và hoạt chất COD trên thế giới đã trải qua hơn 70 năm phát triển, tập trung vào ba hướng chính:

1. Tìm kiếm các hoạt chất COD mới và sàng lọc chủng nấm sinh tổng hợp:

   • Hoạt chất COD đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc là enniatin A từ loài nấm Fusarium orthocera var. enniatinum bởi Gaumann và cộng sự (1947). Tiếp đó là nghiên cứu sinh tổng hợp cyclodepsipeptide của Hassal và cộng sự (1964), nghiên cứu cấu trúc của beauvericin từ nấm Beauveria bassiana bởi Hamill và cộng sự (1969).
   • Thuật ngữ "cyclooligomer depsipeptide" được đưa vào hệ thống phân loại hóa học vào năm 2008. Taevernier và cộng sự đã xây dựng khóa phân loại peptolide dựa trên liên kết este giữa nhóm carboxyl C-terminus với nhóm hydroxy-acid (α, β hoặc chuỗi dài).
   • Các hợp chất COD được tìm thấy chủ yếu ở các chi nấm ký sinh côn trùng như Beauveria, Fusarium, Isaria, Acremonium, Cordyceps, Hirsutella, Paecilomyces, Verticillium, Pseudoxylaria. Xu và cộng sự (2009) phân lập 6 hợp chất COD gồm Beauvericin G1, G2, G3, H1, H2, H3 từ Beauveria bassiana ATCC 7159. Vongvilai và cộng sự phân lập enniatin L, M1, M2, N từ Acremonium sp. BCC 2629; Isaka phân lập beauvericin J từ Acremonium sp. BCC 28424. Nilanonta và cộng sự phát hiện allobeauvericin (A, B, C) từ Paecilomyces tenuipes BCC 1614; Vongvanich và cộng sự xác định hirsutellide A từ Hirsutella kobayasii. Gần đây, Abdalla và cộng sự (2018) đã phân lập nhóm pseudoxylallemycin (A-F) từ Pseudoxylaria sp. X802.
   • Đối với chi Cordyceps, Wang và cộng sự (2014) lần đầu ghi nhận Cordyceps cicadae có khả năng sinh tổng hợp cordycepin A, beauvericin, beauvericin A, E, J. Rachmawati và cộng sự (2017) xác định khả năng sinh beauvericin từ Cordyceps militaris.

2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học và định hướng ứng dụng:

   • Trước năm 2000: Tập trung chủ yếu vào hoạt tính diệt côn trùng (Artemia salina, Calliphora erythrocephala, Aedes aegypti, Spodoptera frugiperda) và kháng vi sinh vật (Bacillus spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa).
   • Từ năm 2000 đến nay: Tập trung vào hoạt tính gây độc và ức chế tế bào ung thư ở người (ung thư gan Hep-G2, ung thư vú MCF-7, BC-1, ung thư biểu mô KB, ung thư phổi A549, NCI-H460, ung thư tuyến tụy MIA Pa Ca-2, bạch cầu CCRF-CEM, HL60), hoạt tính kháng virus (HIV-1 integrase), chống sốt rét (hirsutellide A), chống dị ứng và ức chế enzyme ACAT1/ACAT2 liên quan đến bệnh Alzheimer (verticilide A1-A3, enniatin D).

3. Cơ chế sinh tổng hợp và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy lên men:

   • Cơ chế sinh tổng hợp được chứng minh diễn ra ngoài ribosome thông qua các enzyme đa chức năng NRPSs (ESyn, BeauvSyn, BassSyn, PFSyn) với hai mô hình giả thuyết: mô hình song song ("parallel") và mô hình tuyến tính/vòng lặp ("linear/looping") được đề xuất bởi Süssmuth, Yu, Steiniger, Boeker.
   • Nghiên cứu môi trường lên men lỏng của Lee và cộng sự (trên Fusarium oxysporum KFCC 11363P với 10 loại môi trường), Supothina và cộng sự (trên Isaria tenuipes so sánh lên men rắn và lỏng), Paszkiewicz và cộng sự (trên Conidiobolus coronatus).

Nhóm COD	Số lượng đơn phân / Cấu trúc đặc trưng	Đại diện tiêu biểu	Chi nấm sinh tổng hợp chính
Cyclohexadepsipeptide	3 đơn vị dipeptidol (vòng 18 cạnh, liên kết este xen kẽ amide)	Beauvericin (A-J), Enniatin (A-V), Hirsutellide A, Cardinalisamide (A-C)	Beauveria, Fusarium, Isaria, Cordyceps, Acremonium, Paecilomyces
Cyclooctadepsipeptide	4 đơn vị dipeptidol (vòng 24 cạnh)	Bassianolide, PF1022 (A-H), Verticilide (A1-A3), Glomosporin	Beauveria, Verticillium, Rosellinia, Trichoderma
Diketomorpholine	1 monomer duy nhất (D-Hiv và N-Me-Phe)	Bassiatin, Lateritin	Beauveria, Cordyceps, Fusarium, Gibberella, Isaria
Dimer peptide vòng	2 monomer chứa amino acid thơm kỵ nước và gốc allenyl	Pseudoxylallemycin (A-F)	Pseudoxylaria

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và vị trí của luận án

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng trước đây chủ yếu dừng lại ở việc khảo sát đa dạng sinh học hoặc thu nhận sinh khối để chế tạo thuốc trừ sâu sinh học:

• Tác giả Lê Tấn Hưng khảo sát nấm ký sinh côn trùng tại VQG Cát Tiên.
• Tác giả Nguyễn Thị Lộc nghiên cứu chế phẩm trừ sâu sinh học Ometar và Biovip từ Metarhizium và Beauveria.
• Tác giả Phạm Thị Thùy và Phạm Văn Nhạ nghiên cứu ứng dụng Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae phòng trừ sâu hại cây rừng và rệp sáp hại cà phê.
• Tác giả Nguyễn Thị Thanh Lan, Đinh Minh Hiệp nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps takaomontana và Cordyceps spp. từ VQG Pù Mát để thu nhận quả thể giàu hoạt chất.

Luận án của NCS Nguyễn Thị Thùy Vân là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiếp cận một cách toàn diện theo chuỗi: Phân lập từ tự nhiên $\rightarrow$ Sàng lọc định lượng khả năng sinh COD bằng HPLC $\rightarrow$ Định loại đa gen $\rightarrow$ Tối ưu hóa điều kiện lên men lỏng $\rightarrow$ Chiết tách, tinh sạch $\rightarrow$ Xác định cấu trúc hóa học bằng khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân $\rightarrow$ Thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đặc điểm cấu trúc COD: Cyclooligomer depsipeptide cấu tạo từ các đơn phân, mỗi đơn phân gồm ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid (như D-2-hydroxyisovaleric acid - D-Hiv) và một 2-amino acid (như N-methyl-L-phenylalanine - N-Me-Phe). Các đơn phân liên kết xen kẽ giữa liên kết este và liên kết amide tạo cấu trúc mạch vòng đối xứng.
• Cơ chế sinh tổng hợp NRPSs: Hệ enzyme NRPSs gồm các module liên kết. Module 1 chứa miền Adenylation (A1) kích hoạt D-hydroxycarboxylic acid và gắn vào Peptidyl carrier protein (PCP1). Module 2 chứa miền A2 kích hoạt L-amino acid, gắn vào PCP2a và bị methyl hóa tại miền Methylation (Mt). Sự kết hợp chuỗi qua miền Condensation (C) và đóng vòng este tại miền C3 (PCP2b-C3).

                                   \
                                   /

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp vi sinh vật học:

   • Thu thập mẫu xác côn trùng ký sinh ngoài tự nhiên tại Copia và Xuân Sơn.
   • Phân lập thuần khiết các chủng nấm trên môi trường thạch đĩa, bảo quản giống nấm.
   • Nuôi cấy khảo sát trên 05 môi trường lên men lỏng khác nhau: Sabouraud Dextrose Broth (SDB), Potato Dextrose Broth (PDB), Czapek - Dox (CzD), Minimal Medium (MM), Trypcase Soya Broth (TSB).
   • Xác định sinh khối khô (Cell Dry Weight - CDW) bằng phương pháp sấy khô sinh khối ở nhiệt độ xác định đến khối lượng không đổi.

2. Phương pháp sinh học phân tử:

   • Tách chiết ADN tổng số của chủng nấm nghiên cứu.
   • Nhân bản phân đoạn gen bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho 3 vùng gen:
     • Vùng ITS1-5.8S rDNA-ITS2 (Internal Transcribed Spacer).
     • Vùng LSU (vùng gen mã hóa tiểu phần lớn ribosome 28S rRNA).
     • Vùng Rpb1 (RNA polymerase II largest subunit).
   • Giải trình tự gen, xử lý chuỗi nucleotide, tra cứu độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST.
   • Xây dựng cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) dựa trên sự kết hợp dữ liệu 3 vùng gen (ITS, LSU, Rpb1) bằng phần mềm chuyên dụng để định loại chính xác đến mức độ loài.

3. Phương pháp chiết tách và tinh sạch:

   • Chiết xuất COD từ sinh khối nấm bằng phương pháp ngâm chiết kết hợp sóng siêu âm.
   • Khảo sát các thông số chiết: loại dung môi hữu cơ (Methanol, Ethanol, Ethyl acetate, Dichloromethane...), nhiệt độ chiết và thời gian siêu âm.
   • Tinh sạch sơ bộ bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và sắc ký cột (Column Chromatography) pha thường/pha đảo với hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần.
   • Tinh sạch hợp chất đích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) điều chế.

4. Phương pháp phân tích hóa học và xác định cấu trúc:

   • Định tính và định lượng COD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích (HPLC) đầu dò UV ở bước sóng $\lambda = 203\text{ nm}$, so sánh thời gian lưu ($R_t$) với chất chuẩn đối chứng và xây dựng đường chuẩn.
   • Xác định khối lượng phân tử chính xác bằng khối phổ phân giải cao LC/MS Q-TOF.
   • Xác định công thức cấu tạo hóa học bằng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đa chiều: phổ 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT) và phổ 2 chiều ($^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, NOESY, HSQC, HMBC).

5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học (in vitro):

   • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro (xác định giá trị $\text{IC}_{50}$) trên các dòng tế bào ung thư tiêu chuẩn.
   • Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua các phản ứng dập tắt gốc tự do.
   • Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định in vitro (xác định nồng độ ức chế tối thiểu - MIC) trên các chủng vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm kiểm định.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày cơ sở khoa học, tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide tại hai khu bảo tồn thiên nhiên trọng điểm miền Bắc là KBTTN Copia (Sơn La) và VQG Xuân Sơn (Phú Thọ). Nêu rõ mục tiêu tổng quát, đối tượng nghiên cứu, phạm vi thực hiện và 4 luận điểm đóng góp mới của đề tài.

Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

Chương này tổng kết toàn diện các tài liệu khoa học liên quan đến nấm ký sinh côn trùng và cyclooligomer depsipeptide:

• Đặc điểm nấm ký sinh côn trùng: Trình bày 4 nhóm nấm theo phân loại sinh thái của Evans (ký sinh nội quan, phát triển trên lớp vỏ cuticun, mọc trên ký chủ, cộng sinh) và chu trình xâm nhiễm 3 giai đoạn (xâm nhập qua vỏ cuticun nhờ enzyme phân giải $\rightarrow$ phát triển sợi nấm trong xoang cơ thể $\rightarrow$ hình thành bào tử sau khi ký chủ chết). Điểm lại các chi nấm chính (Metarhizium, Beauveria, Isaria, Cordyceps, Ophiocordyceps, Lecanicillium, Hirsutella...).
• Cấu trúc hóa học và phân loại COD: Phân tích chi tiết 4 nhóm COD chính (Cyclohexadepsipeptide gồm beauvericins, enniatins, hirsutellide A; Cyclooctadepsipeptide gồm bassianolide, PF1022; Diketomorpholine gồm bassiatin, lateritin; nhóm Dimer tuần hoàn Pseudoxylallemycin A-F).
• Hoạt tính sinh học của COD: Dẫn chứng các số liệu tài liệu về hoạt tính diệt côn trùng, kháng khuẩn Gram dương/Gram âm, kháng virus HIV-1, ức chế enzyme ACAT1/ACAT2 và phổ ức chế trên 20 dòng tế bào ung thư (Vero, U-937, BC-1, MCF-7, KB, CCRF-CEM, A549, MIA Pa Ca-2, Hep-G2...).
• Con đường sinh tổng hợp và công nghệ lên men: Phân tích cấu trúc module NRPSs và hai mô hình cơ chế ("parallel" và "linear/looping"). Đánh giá ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, giá trị pH, nguồn cacbon và nguồn nitơ đến sự tích lũy sinh khối và hàm lượng COD.
• Tình hình nghiên cứu thế giới và trong nước: Khái quát các thành tựu của các nhóm tác giả quốc tế và chỉ ra khoảng trống nghiên cứu tại Việt Nam.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết về địa bàn nghiên cứu, hóa chất, chủng mẫu, trang thiết bị và quy trình thực nghiệm:

• Địa bàn thu mẫu:
  • KBTTN Copia (Thuận Châu, Sơn La): Rừng tự nhiên vùng núi cao trên 1.500 m (đỉnh Copia, Trông Sia, Long Nọi), nhiệt độ trung bình 19°C, lượng mưa trung bình 1.600 mm/năm, độ ẩm trung bình 85%.
  • VQG Xuân Sơn (Thanh Sơn, Phú Thọ): Địa hình núi đất xen kẽ núi đá vôi (độ cao 200 - 1.386 m), nhiệt độ trung bình 22 - 23°C, độ ẩm trung bình 86%.
• Quy trình thực nghiệm:
  • Quy trình phân lập thuần khiết nấm ký sinh côn trùng từ mẫu vật thực địa (các mẫu mang ký hiệu CPA tại Copia và XS tại Xuân Sơn).
  • Quy trình tách chiết ADN và giải trình tự 3 vùng gen ITS, LSU, Rpb1.
  • Thiết kế thí nghiệm khảo sát 05 loại môi trường lên men lỏng, dải pH ban đầu, nguồn cacbon và nguồn nitơ.
  • Quy trình chiết siêu âm sinh khối, sắc ký cột và HPLC thu nhận hợp chất sạch CC1.
  • Phương pháp phân tích phổ khối LC/MS Q-TOF và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D-NMR).
  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro (gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này tập hợp các kết quả thực nghiệm đạt được của luận án:

• Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập: Phân lập được tập hợp các chủng nấm từ mẫu côn trùng thu thập tại Copia (ký hiệu CPA1, CPA3, CPA5, CPA13V, CPA14V, CPA15, CPA16, CPA31, CPA40, CPA44...) và Xuân Sơn (ký hiệu XS01, XS07, XS12, XS36, XS37, XS38, XS57, XS65, XS66, XS67, XS69, XS71, XS77, XS83...).
• Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp COD: Bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 203 nm so sánh với chất chuẩn, phát hiện chủng nấm CPA14V có khả năng sinh tổng hợp COD cao vượt trội, được lựa chọn làm chủng nghiên cứu trọng tâm.
• Định loại chủng nấm CPA14V:
  • Khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cơ quan sinh sản vi thể.
  • Phân tích trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên sự kết hợp dữ liệu của 3 vùng gen (ITS1-5.8S rDNA-ITS2, LSU và Rpb1). Kết quả định danh chính xác chủng CPA14V là Cordyceps cateniannulata (ghi nhận lần đầu tiên sự xuất hiện của loài này tại Việt Nam).
• Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy lên men lỏng chủng Cordyceps cateniannulata CPA14V:
  • Môi trường lên men: Đánh giá khả năng sinh trưởng (CDW) và tích lũy COD trên 05 loại môi trường, lựa chọn môi trường lỏng tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp COD.
  • Ảnh hưởng của pH: Khảo sát dải pH ban đầu ảnh hưởng đến sinh khối khô và hiệu suất tổng hợp COD, xác định giá trị pH tối ưu.
  • Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Đánh giá các nguồn cacbon khác nhau, xác định loại đường cho hiệu suất sinh khối và COD cao nhất.
  • Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Khảo sát các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ, lựa chọn nguồn nitơ tối ưu cho quá trình lên men.
• Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học hợp chất COD:
  • Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất sinh khối khô: xác định hệ dung môi chiết, nhiệt độ chiết và thời gian rung siêu âm thích hợp.
  • Tinh sạch hợp chất bằng sắc ký cột pha đảo và HPLC, thu được hợp chất sạch ký hiệu là CC1.
  • Kết quả phân tích phổ khối LC/MS Q-TOF và phổ NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, COSY, NOESY, HMBC) khẳng định hợp chất CC1 có cấu trúc hoàn toàn trùng khớp với hoạt chất beauvericin (một cyclohexadepsipeptide dạng trimer mạch vòng cấu tạo từ 3 đơn vị dipeptidol [D-Hiv và N-Me-Phe]).
• Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và beauvericin (CC1):
  • Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
  • Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro.
  • Khảo sát hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định in vitro (vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm kiểm định).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

Theo công bố của tác giả trong văn bản luận án, công trình đạt được 4 đóng góp mới chính:

1. Là luận án đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện và có hệ thống (từ khâu phân lập ngoài tự nhiên, tuyển chọn, định loại đa gen, nghiên cứu các đặc điểm lên men lỏng thu nhận, quy trình tách chiết, tinh sạch, giải mã cấu trúc hóa học bằng NMR/MS đến khảo sát hoạt tính sinh học) về 01 chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả năng sinh tổng hợp COD và có tiềm năng ứng dụng thực tiễn.
2. Là công trình đầu tiên công bố dữ liệu khoa học về tính đa dạng của nấm ký sinh côn trùng và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm được phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ).
3. Lần đầu tiên ghi nhận và bổ sung sự có mặt của loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps cateniannulata vào danh lục khu hệ vi sinh vật học tại Việt Nam.
4. Là công bố khoa học đầu tiên trên thế giới chứng minh loài nấm Cordyceps cateniannulata có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất cyclooligomer depsipeptide (cụ thể là beauvericin).

Kiến nghị và đề xuất

• Cần tiếp tục mở rộng điều tra, thu thập mẫu nấm ký sinh côn trùng ở các sinh cảnh rừng tự nhiên khác trên địa bàn miền Bắc nhằm bảo tồn nguồn gen và xây dựng cơ sở dữ liệu đa dạng sinh học.
• Khuyến nghị phát triển quy trình nuôi cấy lên men lỏng chủng Cordyceps cateniannulata CPA14V ở quy mô lớn hơn (quy mô pilot/bioreactor) để đánh giá tính khả thi trong sản xuất hoạt chất beauvericin làm nguyên liệu dược dụng.
• Đề xuất thử nghiệm mở rộng các hoạt tính sinh học chuyên sâu khác của hợp chất beauvericin thu nhận từ chủng CPA14V trên các mô hình tế bào và in vivo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thử nghiệm nuôi cấy và tối ưu hóa điều kiện lên men mới được thực hiện ở quy mô bình tam giác trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm trên các hệ thống nồi lên men tự động kiểm soát oxy hòa tan và nạp cơ chất liên tục.
• Các đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và beauvericin mới dừng lại ở các mô hình sàng lọc in vitro, chưa đánh giá độc tính tế bào học bán trường diễn hoặc tác dụng dược lý trên mô hình động vật in vivo.
• Cơ chế sinh tổng hợp và các cụm gen (gene cluster) mã hóa enzyme NRPSs ở chủng Cordyceps cateniannulata CPA14V chưa được giải mã toàn bộ hệ gen (whole-genome sequencing).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng Cordyceps cateniannulata CPA14V nhằm phân tích cụm gen sinh tổng hợp beauvericin synthetase (BeauvSyn) và các con đường trao đổi chất liên quan.
• Nghiên cứu nâng quy mô lên men lỏng (scale-up) lên hệ thống bioreactor để tối ưu hóa năng suất sinh khối và hiệu suất tích lũy beauvericin.
• Khảo sát sâu hơn cơ chế gây độc tế bào ung thư và thử nghiệm tiền lâm sàng hoạt tính sinh học của hợp chất beauvericin thu được.

---

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo khoa học và ứng dụng thực tiễn cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học; là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập nấm ký sinh côn trùng, kỹ thuật phân tích đa gen (ITS, LSU, Rpb1) để định danh nấm, và phương pháp giải cấu trúc hóa học peptolide bằng khối phổ MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D-NMR).
• Giảng viên và nhà nghiên cứu: Cung cấp tài liệu giảng dạy chuyên đề về chất chuyển hóa thứ cấp của vi sinh vật, công nghệ lên men lỏng sinh tổng hợp hoạt chất sinh học, và tiềm năng của chi Cordyceps.
• Các cơ quan quản lý bảo tồn thiên nhiên và hoạch định chính sách: Cung cấp dẫn liệu khoa học thực địa giá trị về danh mục nguồn gen vi sinh vật tại KBTTN Copia (Sơn La) và VQG Xuân Sơn (Phú Thọ), phục vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học và khai thác bền vững tài nguyên sinh vật bản địa.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất cyclooligomer depsipeptide (COD) chính được tinh sạch và xác định cấu trúc từ chủng nấm nghiên cứu trong luận án là gì?
Hợp chất COD được tách chiết, tinh sạch từ sinh khối chủng nấm Cordyceps cateniannulata CPA14V (ký hiệu CC1) được xác định cấu trúc hóa học là beauvericin (một cyclohexadepsipeptide dạng trimer mạch vòng tạo thành từ 3 đơn vị dipeptidol gồm D-hydroxyisovaleric acid và N-methyl-L-phenylalanine).

2. Chủng nấm tiềm năng CPA14V được phân lập tại địa bàn nào và được định loại bằng những phương pháp nào?
Chủng nấm CPA14V được phân lập từ mẫu côn trùng thu thập tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La). Chủng được định loại chính xác là loài Cordyceps cateniannulata dựa trên sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái vi thể và phân tích phát sinh loài đa gen trên 3 vùng gen: ITS1-5.8S rDNA-ITS2, LSU (28S rRNA) và Rpb1.

3. Vì sao phương pháp lên men lỏng lại được luận án lựa chọn để sản xuất COD thay vì lên men cơ chất rắn truyền thống?
Luận án chỉ ra rằng nuôi cấy trên giá thể rắn gặp nhiều hạn chế như: không phải chủng nấm nào cũng tạo thể quả, việc thu hồi hệ sợi khó khăn, thời gian nuôi cấy kéo dài (từ 3 đến 7 tuần). Thực nghiệm đối chứng (dẫn liệu từ Supothina và cộng sự) cho thấy hàm lượng COD tích lũy và hiệu suất tổng trong môi trường lên men lỏng cao hơn nhiều lần so với lên men rắn, đồng thời rút ngắn đáng kể chu kỳ sản xuất.

4. Luận án đã sử dụng những kỹ thuật phổ nào để chứng minh cấu trúc hóa học của hợp chất CC1?
Luận án đã kết hợp kỹ thuật đo khối phổ phân giải cao LC/MS Q-TOF để xác định khối lượng phân tử chính xác và hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều bao gồm phổ 1 chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, phổ DEPT) cùng các phổ 2 chiều ($^1\text{H-}^1\text{H}$ COSY, NOESY, HSQC, HMBC) để giải mã các liên kết este, liên kết amide và tương tác không gian trong cấu trúc phân tử.

5. Loài Cordyceps cateniannulata có ý nghĩa khoa học đặc biệt gì trong công trình này?
Đây là lần đầu tiên loài Cordyceps cateniannulata được ghi nhận có mặt tại khu hệ nấm Việt Nam, đồng thời là công bố đầu tiên trên thế giới chứng minh loài này có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide (beauvericin).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thùy Vân là công trình nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống về nấm ký sinh côn trùng và hoạt chất cyclooligomer depsipeptide tại KBTTN Copia và VQG Xuân Sơn. Công trình đã phân lập, sàng lọc và định danh thành công chủng nấm Cordyceps cateniannulata CPA14V dựa trên phân tích đa gen (ITS, LSU, Rpb1), đồng thời tối ưu hóa các thông số lên men lỏng (môi trường dinh dưỡng, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ) để thu nhận sinh khối và hoạt chất. Hợp chất đích CC1 được tinh sạch và xác định cấu trúc là beauvericin thông qua phân tích phổ LC/MS Q-TOF và NMR đa chiều, đồng thời được chứng minh có các hoạt tính sinh học in vitro giá trị. Kết quả luận án đóng góp dữ liệu mới cho danh mục nguồn gen vi sinh vật Việt Nam và mở ra tiềm năng nghiên cứu ứng dụng nguồn hoạt chất tự nhiên từ nấm ký sinh côn trùng trong y dược học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng [96]. Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái. Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng đƣợc ghi nhận [19, 222]. Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp nhƣ: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid… [48], [196].

Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide. Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân. Trong đó mỗi đơn phân đƣợc cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid.

COD đƣợc sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) [53]. COD là hoạt chất tự nhiên đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn [55], nấm [168], thực vật [207], tảo [46], hải miên [17], và một số loại sinh vật biển khác [92, 141]. Trong các nhóm COD thì COD từ nấm ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất [196]. Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả năng gây độc ở thực vật [116], gây độc tế bào [176], kháng virus [93], diệt côn trùng [211], chống sốt rét [75], chống khối u [106], ức chế hoạt động của một số loại enzyme [128, 156] cũng nhƣ là hạn chế sự hình thành các amyloid ở bệnh Alzheimer [73].

Đặc biệt trong các nghiên cứu gần đây cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng có nhiều tiềm năng trong phòng chống ung thƣ, ức chế sự sinh trƣởng của một số dòng ung thƣ khác nhau ở ngƣời [72, 107, 197]. Hiện nay, các hoạt chất COD từ nấm 2 ký sinh côn trùng đƣợc coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên mới có tiềm năng ứng dụng trong y dƣợc. Trên thế giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng cũng nhƣ COD từ nấm ký sinh côn trùng bắt đầu từ khá sớm. Điển hình nhƣ nghiên cứu về tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var.

enniatinum của Gaumann [57], nghiên cứu về sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, và D-L- Cyclodi- (β-seryloxy- propionyl) của Hassal và cộng sự [66] hay nghiên cứu về cấu trúc của beauvericin từ nấm của Hamill và cộng sự [64],. Trải qua hơn 70 năm, nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng vẫn thu hút đƣợc sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và ứng dụng của chúng đã đƣợc công bố. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng hoặc sử dụng sinh khối nấm để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu nhƣ nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Lộc [3], Phạm Thị Thùy [10], Phạm Văn Nhạ [6],… Nghiên cứu về COD từ nấm ký sinh côn trùng là vấn đề rất mới mẻ, hiện chƣa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam đề cập tới vấn đề này.

Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vƣờn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật ở miền Bắc Việt Nam.