Luận văn thạc sĩ về đánh giá đa dạng di truyền loài xá xị Cinnamomum parthenoxylon tại miền Bắc

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học phân tích đa dạng di truyền loài xá xị Cinnamomum parthenoxylon tại miền Bắc qua trình tự psba.

• Tác giả: Nguyễn Xuân Vĩnh
• Người hướng dẫn: TS. Hà Bích Hồng
• Trường học: Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền loài xá xị Cinnamomum parthenoxylon tại miền Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Đặc điểm sinh học loài Xá Xi
• 1.2. Tổng quan về ADN mã vạch (ADN barcodes)
• 1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch
• 1.2.2. Giới thiệu về chỉ thị trnH-psbA và ứng dụng của chỉ thị trnH-psbA
• 1.2.3. Nghiên cứu về đa dạng di truyền của các loài thuộc chi Cinnamomum
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Lựa chọn mẫu và cách lấy mẫu. Địa điểm thực hiện nghiên cứu. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp
• 2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
• 2.3.2. Phương pháp định lượng ADN tổng số
• 2.3.3. Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
• 2.3.4. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
• 2.3.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.6. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen ADN mã vạch
• 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách chiết ADN tổng số
• 3.2. Nhân bản đoạn trình tự ADN mã vạch trnH-psbA của loài Xá xi
• 3.3. Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN mã vạch của loài Xá xi
• 3.4. Phân tích trình tự nucleotide của đoạn ADN mã vạch trnH-psbA của 54 mẫu Xá xi phục vụ đánh giá đa dạng di truyền
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về loài xá xị Cinnamomum parthenoxylon

Loài xá xị, có tên khoa học là Cinnamomum parthenoxylon, thuộc họ Long não (Lauraceae). Loài cây này được biết đến với nhiều đặc điểm sinh học độc đáo và giá trị kinh tế cao. Cây xá xị có thể cao từ 20 đến 25 mét, với đường kính thân từ 40 đến 70 cm. Vỏ cây có màu nâu, thường nứt dọc và bong ra từng mảng. Lá cây có hình dạng trứng hoặc bầu dục, với gân bên 3-8 đôi. Hoa của cây xá xị lưỡng tính, có màu trắng vàng và thường mọc thành cụm. Quả của cây có hình mong, có đường kính khoảng 0,6 cm. Cây xá xị thường phân bố trong rừng mưa nhiệt đới, ưa sống ở độ cao từ 300 đến 900 mét và trên đất có độ phì cao. Đặc biệt, cây này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp chế biến gỗ và sản xuất tinh dầu, do đó có giá trị thương mại cao trên thị trường quốc tế.

II. Đánh giá đa dạng di truyền của loài xá xị

Đánh giá đa dạng di truyền của loài xá xị là một phần quan trọng trong nghiên cứu nhằm bảo tồn nguồn gen. Sử dụng ADN mã vạch, đặc biệt là chỉ thị trnH-psbA, giúp xác định sự khác biệt di truyền giữa các cá thể trong quần thể. Nghiên cứu cho thấy rằng trình tự trnH-psbA có khả năng phân biệt cao giữa các loài thực vật, với tỷ lệ thành công đạt 84% trong việc xác định loài thuộc họ Long não. Điều này cho thấy rằng việc sử dụng ADN mã vạch không chỉ giúp phân loại chính xác các loài mà còn hỗ trợ trong việc bảo tồn đa dạng sinh học. Nghiên cứu này cũng góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho các loài thực vật tại Việt Nam, phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp tách chiết ADN, nhân bản đoạn ADN mã vạch trnH-psbA, và phân tích trình tự nucleotide. Việc tách chiết ADN từ 54 mẫu xá xị được thực hiện theo quy trình tiêu chuẩn, đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của mẫu. Sau đó, phản ứng PCR được thực hiện để nhân bản đoạn ADN mã vạch, với các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu. Cuối cùng, trình tự nucleotide của đoạn ADN mã vạch được giải trình tự và phân tích để đánh giá mức độ đa dạng di truyền. Kết quả cho thấy sự khác biệt di truyền giữa các mẫu từ các tỉnh miền Bắc Việt Nam, từ đó xác định được các haplotype khác nhau.

IV. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu không chỉ có giá trị trong việc bổ sung dữ liệu di truyền cho danh mục các loài thực vật ở Việt Nam mà còn có ý nghĩa lớn trong công tác bảo tồn. Việc đánh giá đa dạng di truyền của loài xá xị giúp xác định được các quần thể có giá trị cao, từ đó có thể xây dựng các chương trình bảo tồn hiệu quả. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng công nghệ ADN mã vạch vào các nghiên cứu sinh học khác, thúc đẩy việc bảo tồn và phát triển bền vững các loài thực vật quý hiếm tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam sở hữu hệ thực vật đa dạng với hơn 19 triệu ha rừng và đất rừng, đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế và bảo tồn sinh thái. Trong số các loài cây quý hiếm, cây Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) được đánh giá là loài có giá trị kinh tế cao và thuộc nhóm cực kỳ nguy cấp (CR) theo Nghị định 06/2019/NĐ-CP. Loài cây này không chỉ cung cấp gỗ chất lượng cao mà còn có tinh dầu dùng trong công nghiệp hóa mỹ phẩm và dược phẩm. Tuy nhiên, do khai thác quá mức và khả năng tái sinh tự nhiên kém, số lượng cây ngoài tự nhiên ngày càng giảm, đặt ra thách thức lớn cho công tác bảo tồn.

Nghiên cứu tập trung đánh giá đa dạng di truyền của loài Xá xị tại 5 tỉnh miền Bắc gồm Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình, Quảng Ninh và Thanh Hóa, dựa trên trình tự ADN mã vạch trnH-psbA. Mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch phục vụ bảo tồn và phát triển nguồn gen loài này. Nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn 2021-2022 tại Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp, với 54 mẫu lá thu thập từ các quần thể tự nhiên.

Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần bổ sung dữ liệu di truyền cho danh mục các loài thực vật Việt Nam mà còn làm cơ sở khoa học cho các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững loài Xá xị, đồng thời hỗ trợ công tác quản lý nguồn gen quý hiếm trong bối cảnh biến đổi môi trường và khai thác tài nguyên rừng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết về ADN mã vạch (DNA barcoding), một phương pháp sử dụng đoạn ADN ngắn đặc trưng trong bộ gen để định danh và phân biệt các loài sinh vật. Đoạn gen trnH-psbA, nằm trong hệ gen lục lạp, được chọn làm chỉ thị phân tử do có độ biến đổi cao giữa các loài nhưng ổn định trong cùng loài, kích thước khoảng 450 bp, phù hợp cho việc nhân bản và giải trình tự.

Ngoài ra, các khái niệm chính bao gồm:

• Haplotype: Kiểu gen đơn bội biểu thị sự đa dạng di truyền trong quần thể.
• Đa dạng haplotype (Hd): Chỉ số đánh giá mức độ đa dạng kiểu gen trong quần thể, Hd = 1 biểu thị đa dạng cao.
• Đa dạng nucleotide (Pi): Tỷ lệ sai khác nucleotide trung bình giữa các cặp trình tự trong quần thể.
• Khoảng cách di truyền: Đánh giá mức độ khác biệt về trình tự ADN giữa các quần thể.

Lý thuyết này giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền, từ đó đưa ra các giải pháp bảo tồn phù hợp.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 54 mẫu lá Xá xị thu thập từ 5 tỉnh miền Bắc: Vĩnh Phúc (Vườn Quốc gia Tam Đảo), Phú Thọ (Vườn Quốc gia Xuân Sơn), Hòa Bình (Khu Bảo tồn Thiên nhiên Hang Kia - Pà Cò, Thượng Tiền, Phu Canh), Quảng Ninh (Rừng Quốc gia Yên Tử) và Thanh Hóa (Khu Bảo tồn Xuân Liên, Pha Phanh).

Phương pháp chọn mẫu là lấy mẫu ngẫu nhiên từ các cây trội, đảm bảo mẫu lá bánh tẻ, không sâu bệnh, bảo quản trong túi nilon chứa silica gel và lưu giữ ở -20°C.

Quy trình nghiên cứu gồm:

• Tách chiết ADN tổng số bằng bộ kit Qiagen, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy quang phổ Scan Drop 250.
• Nhân bản đoạn gen trnH-psbA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,0%.
• Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger tại công ty chuyên nghiệp.
• Xử lý dữ liệu bằng phần mềm BioEdit, Mega7, DnaSP 6.0 để phân tích đa dạng haplotype, đa dạng nucleotide và xây dựng cây quan hệ di truyền.
• Thời gian nghiên cứu từ 10/2021 đến 8/2022.

Phương pháp phân tích được lựa chọn nhằm đảm bảo độ chính xác cao trong đánh giá đa dạng di truyền và phù hợp với đặc điểm sinh học của loài Xá xị.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết ADN thành công: 54 mẫu lá Xá xị được tách chiết ADN tổng số với nồng độ dao động từ 12,4 đến 35,8 ng/μl, độ tinh sạch OD260/OD280 từ 1,23 đến 1,69. Tất cả mẫu đều cho sản phẩm PCR đặc hiệu kích thước khoảng 850 bp, chứng tỏ chất lượng ADN đủ tốt cho phân tích tiếp theo.

2. Nhân bản và giải trình tự ADN mã vạch trnH-psbA: Đoạn gen trnH-psbA dài khoảng 464-476 bp được nhân bản thành công ở tất cả mẫu. Tỷ lệ tương đồng trình tự trong từng tỉnh dao động từ 97,66% đến 100%. Đã xác định được 10 haplotype khác nhau trong tổng số 54 mẫu, thể hiện sự đa dạng di truyền đáng kể.

3. Đa dạng di truyền quần thể: Hệ số đa dạng haplotype (Hd) trung bình là 0,804, cho thấy mức độ đa dạng cao; đa dạng nucleotide (Pi) trung bình là 0,00912, mức độ biến đổi nucleotide tương đối thấp. Quần thể tại Vĩnh Phúc và Phú Thọ có số lượng haplotype lớn nhất (4 haplotype), trong khi Quảng Ninh chỉ có 1 haplotype duy nhất.

4. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể: Khoảng cách di truyền thấp (0,001-0,003) giữa các quần thể Phú Thọ, Hòa Bình, Quảng Ninh và Thanh Hóa, trong khi quần thể Vĩnh Phúc có khoảng cách di truyền cao hơn (0,009-0,011) so với các quần thể còn lại, phản ánh sự phân hóa di truyền rõ rệt.

5. Hàm lượng tinh dầu: Hàm lượng tinh dầu trung bình của các quần thể dao động từ 1,13% đến 1,26%, không có sự khác biệt đáng kể giữa các quần thể, nhưng cao hơn so với Xá xị tại Malaysia.

Thảo luận kết quả

Sự đa dạng haplotype cao cho thấy quần thể Xá xị tại miền Bắc có khả năng thích nghi và phát triển tốt, đặc biệt là các quần thể tại Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình và Thanh Hóa. Ngược lại, quần thể Quảng Ninh có đa dạng di truyền thấp, có thể do phân bố hạn chế hoặc tác động của khai thác.

Khoảng cách di truyền cao của quần thể Vĩnh Phúc có thể liên quan đến sự cô lập địa lý hoặc tác động khai thác quá mức, làm giảm sự trao đổi gen với các quần thể khác. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về đa dạng di truyền của loài Cinnamomum khác tại Trung Quốc và Đông Nam Á, cho thấy các yếu tố môi trường và con người ảnh hưởng lớn đến cấu trúc di truyền.

Dữ liệu đa dạng di truyền kết hợp với hàm lượng tinh dầu ổn định cung cấp cơ sở khoa học để phát triển các chương trình nhân giống và bảo tồn nguồn gen, đồng thời hỗ trợ khai thác bền vững loài cây có giá trị kinh tế này.

Biểu đồ cây quan hệ di truyền và bảng phân tích haplotype minh họa rõ sự phân bố đa dạng di truyền giữa các quần thể, giúp hình dung mối quan hệ di truyền và mức độ khác biệt giữa các nhóm mẫu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng chương trình bảo tồn quần thể Xá xị tại miền Bắc: Ưu tiên bảo vệ các quần thể có đa dạng di truyền cao như Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình và Thanh Hóa. Thời gian thực hiện trong 3-5 năm, chủ thể là các cơ quan quản lý rừng và viện nghiên cứu sinh học.

2. Phát triển nhân giống hữu tính và vô tính: Áp dụng kỹ thuật nhân giống từ hạt và cành ghép để tăng số lượng cá thể, đặc biệt tại quần thể Quảng Ninh có đa dạng di truyền thấp. Mục tiêu tăng số lượng cây trồng lên ít nhất 30% trong 2 năm.

3. Nghiên cứu bổ sung các chỉ thị phân tử khác: Tiến hành đánh giá đa dạng di truyền bằng các marker SSR, EST-SSR để khẳng định kết quả và mở rộng phạm vi nghiên cứu. Thời gian 2 năm, do các viện công nghệ sinh học thực hiện.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch quốc gia: Tập hợp dữ liệu trình tự ADN mã vạch của loài Xá xị và các loài quý hiếm khác để hỗ trợ công tác định danh và bảo tồn. Chủ thể là Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phối hợp với Bộ Giáo dục và Đào tạo, hoàn thành trong 3 năm.

5. Tuyên truyền nâng cao nhận thức cộng đồng: Tổ chức các chương trình giáo dục, truyền thông về giá trị và tầm quan trọng của loài Xá xị nhằm giảm khai thác trái phép và khuyến khích bảo vệ tự nhiên. Thời gian liên tục, do các tổ chức phi chính phủ và chính quyền địa phương thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học: Sử dụng dữ liệu đa dạng di truyền và phương pháp ADN mã vạch để phát triển nghiên cứu về bảo tồn nguồn gen và phân loại loài.

2. Cơ quan quản lý tài nguyên rừng và bảo tồn thiên nhiên: Áp dụng kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho các chính sách bảo vệ và phát triển bền vững loài Xá xị tại miền Bắc.

3. Doanh nghiệp chế biến gỗ và tinh dầu: Tham khảo để hiểu rõ nguồn gen và chất lượng nguyên liệu, từ đó phát triển sản phẩm có giá trị kinh tế cao và bền vững.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, lâm nghiệp: Học tập phương pháp nghiên cứu ADN mã vạch, kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền và ứng dụng thực tiễn trong bảo tồn sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. ADN mã vạch là gì và tại sao chọn trnH-psbA?
   ADN mã vạch là đoạn ADN ngắn đặc trưng giúp định danh loài. TrnH-psbA được chọn vì có độ biến đổi cao giữa các loài, dễ nhân bản và giải trình tự, tỷ lệ khuếch đại thành công 100%, phù hợp cho đánh giá đa dạng di truyền thực vật.

2. Phương pháp tách chiết ADN có đảm bảo chất lượng không?
   Sử dụng bộ kit Qiagen cho kết quả tách chiết ADN với nồng độ từ 12,4 đến 35,8 ng/μl và độ tinh sạch OD260/OD280 từ 1,23 đến 1,69, đủ điều kiện cho phản ứng PCR và giải trình tự.

3. Đa dạng di truyền của loài Xá xị tại miền Bắc như thế nào?
   Đa dạng haplotype cao (Hd = 0,804) cho thấy quần thể có sự đa dạng di truyền tốt, trong khi đa dạng nucleotide thấp (Pi = 0,00912) phản ánh sự biến đổi nucleotide hạn chế, phù hợp với đặc điểm sinh học của loài.

4. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể có ý nghĩa gì?
   Khoảng cách di truyền thấp giữa các quần thể cho thấy sự trao đổi gen và quan hệ gần gũi, trong khi khoảng cách cao như ở Vĩnh Phúc phản ánh sự phân hóa và có thể do cô lập địa lý hoặc tác động khai thác.

5. Kết quả nghiên cứu có ứng dụng thực tiễn ra sao?
   Dữ liệu đa dạng di truyền hỗ trợ xây dựng chương trình bảo tồn, phát triển nhân giống, quản lý khai thác bền vững và phát triển sản phẩm từ cây Xá xị, góp phần bảo vệ nguồn gen quý hiếm và phát triển kinh tế địa phương.

Kết luận

• Đã thành công trong việc phân lập và giải trình tự đoạn ADN mã vạch trnH-psbA của 54 mẫu cây Xá xị tại 5 tỉnh miền Bắc.
• Phát hiện 10 haplotype khác nhau, thể hiện đa dạng di truyền cao trong quần thể, đặc biệt tại Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình và Thanh Hóa.
• Khoảng cách di truyền giữa các quần thể thấp ngoại trừ quần thể Vĩnh Phúc có sự phân hóa rõ rệt.
• Kết quả cung cấp cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn, nhân giống và phát triển bền vững loài Xá xị.
• Đề xuất nghiên cứu bổ sung và xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch quốc gia để nâng cao hiệu quả quản lý nguồn gen.

Tiếp theo, cần triển khai các giải pháp bảo tồn và nhân giống theo khuyến nghị, đồng thời mở rộng nghiên cứu đa dạng di truyền với các chỉ thị phân tử khác để hoàn thiện bức tranh di truyền của loài Xá xị tại Việt Nam. Các cơ quan quản lý và nhà nghiên cứu được khuyến khích áp dụng kết quả này vào thực tiễn nhằm bảo vệ nguồn gen quý hiếm và phát triển kinh tế sinh thái bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TONG QUAN VAN DE NGHIÊN CUU 1. Đặc điểm sinh học loài Xá Xi Xá xi, lên khoa học là Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn. Tên gọi khác là Co chấu, Re đầu, Re hương, thuộc họ Re hay họ Long não (Lauraceae). Xã xi là cây gỗ, kích thước trung bình hoặc lớn; thân hình trụ thing, cao 20 - 25 m, đường kính thân (40 - 70) em; rụng lá nhiều hay it; gốc cây phình to và đôi khi có bạnh gốc.

Vỏ ngoài màu nâu. nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc và bong ra từng mảng; thịt vỏ có mau nâu đỏ nhạt. Cành non tròn, thô, có cạnh, màu lục xám. Lá đơn nguyên, mọc cách: phiến lá hình trứng hay hình bau dục thuôn; kích thước 5 - 15 x 2,5 - 8em; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng: hai mặt nhẫn; gân bên 3 - 8 đôi; cuống lá dai 1,2 - 3em.

Cụm hoa dạng chuỷ hay tán; mọc ở đầu cành hay nách 14; mỗi cụm mang khoảng 10 hoa. Hoa lưỡng tính; bao hoa 6 thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn4 6, chi nhị có lông, 3 nhị vòng trong có 2 tuyến mật; nhị lép 3. Quả mong, hình | đường kính 0,6 - Lem; đi răng, khi chín mẫu xanh vàng hoặc. fm den (Hình 1.

Cành mang hoa và qua cây. xj ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc Xá xi cho gỗ tốt, có vân đẹp, khi khô ít bị nút nẻ hay bị én dạng, khong bị mối mọt, chịu nước, gia công chế biế Lá dùng làm thuế máu, chữa đau da dày, phong thấp, mẫn ngửa ngoài da. Quả được dùng chữa cảm, sốt, ly, ho gà. Tinh dầu Xá xj được.

ir dung rộng rai trong công nghệ hoá mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm, do đó có giá trị thương mại rat lớn trê thị trường thé giới (Nguyễn Tién Bai 2003; Phạm Hoàng Hộ, 1999). Phân bố tự nhiên trong rừng mưa nhiệt đới, thường ở độ cao 300 - 900m, cây ưa sống trên đất có ting dày, độ phì cao, tơi xốp, 4m, thoát nước tốt và ở những nơi khuất gió. Cây tra sáng, sinh trưởng tốt trong những rừng. có mật độ trung bình.

Có thể tái sinh bằng hạt hoặc chdi, tái sinh chdi mạnh. Ở Việt Nam cây phân bố ở một số như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hòa Bình, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quang Nam, Bình Thuận, Lâm Đồng, ông Nai, Bình Phước. Tổng quan về ADN mã vạch (ADN barcodes) 1. Giới thiệu về ADN mã vạch: Nam 2003, Paul Heber - nhà nghiên cứ tại Đại học Guelph, Ontario Lin đầu tiên đưa ra thuật ngữ *ADN mã vạch”.

ADN mã vạch sử dụng một trình tự ADN ngắn nằm trong geneome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loại sinh vật với nhau, nó tương tự như máy quet trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài của chúng rất giống. nhau nhưng thực sự là khác nhau. Như vậy mã vạch ADN là một phương pháp định danh mà nó sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật dang nghiên cứu nhằm xác định sinh vật đó thuộc loại nào. và cộng sự (2007), ệ thống mã vạch ADN lý tưởng phải dap ứng các yêu cầu sau đây: + Thứ nhất, đoạn ADN chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loà nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài.

+ Thứ hai, hệ thống định danh bằng ADN phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng ADN có thể được sử dụng cho nhóm phân loại khác nhau. + Thứ ba, đoạn ADN chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thé dé đàng định danh loài vào các nhóm phân loại (ch, ho.) + Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mỗi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ àng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự ADN, * Đoạn ADN nghiên cứu nên có kích thước ngắn để quá trình nhân bản ADN không bị sai lệch. Thông thường, đoạn ADN nghiên cứu có kích thước 150bp trở lại, nếu dài hơn sẽ dễ bị sai lầm trong quá trình nhân bản ADN. Đặc điểm quan trọng nhất của ADN mã vạch là phái phổ biển và đặc hiệu trong các biển dị và đễ dang sử dụng.

Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại. có sự biến đổi giữa các loài nhưng én định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể. Do đó, ADN mã vạch lý tưởng là một đoạn ADN có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp được với cặp mỗi được thiết kế đặc hiệu dé cr làng khuếch đại bing PCR, ADN mã vạch được sử dụng để giải quyết vin đề bảo tồn đa dang sinh học theo hai cách sau: (1) La một phương tiện giám xát đa dạng sinh học chỉnh xác và nhanh chóng cả trước và sau các hành động bảo Ôn, (2) Cung cá dữ liệu để hỗ trợ trong việc ước tính sự đa dạng phát sinh loài để it lập các tru tiên bảo tồn (Krishnamurthy và Francis, 2012). 6 thực các đoạn ADN mã vạch có thể là những đoạn ADN nằm trong hệ gen nhân (28S rDNA, /TS,.) (Chen, 2010; Schoch et al., 2012) hoặc hệ gen lúc lap (matK, rbcL, trnH - psbA, rpo, traL-wnE, yeƒ.

Ba mã vạch ADN là röcL, matK, trmH-psbA được ir dụng để đánh giá sự đa dạng của các loài cây trong một lô rừng mưa nhiệt đới tại Queensland, Uc và kết luận rằng ADN mã vạch là một trợ giúp đáng kể trong đánh giá đa dạng sinh học và xác định các quần thể yy ngay cả khí chúng không thể phân biệt được tắt cả các loài trong lô (Costion et al. Giới thiệu về chỉ thị trnH-psbA và ứng dụng của chỉ thị trnH-psbA Đoạn trình tự œnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao. Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt ‘Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước rit ngắn (~ 300 bp), kích thước của trinh tự này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa vùng gen của hai gen tH và psbA. Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã để xuất việc sử dụng trnFL-psbA như chỉ thị mà vạch độc lập cho thực vật hay kết hợp với ‘matK.

CBOL (Consortium for the Bareode of Life) thấy ring khả năng phân biệt loài của rrnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm. va do đó đề nghị nó như là chỉ thị ma vạch bo sung. Chỉ thị znH: IsbA có thể sử dụng trong hệ thống mã vạch ba locus khi hệ thống mã vạch hai locus không cung cấp diy đủ khả năng phân tích (Kress W. và cs, 2008; Vijayan K.2010), Vùng gen trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) va tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbeL và matK.

Vì vậy, truH-psbA được coi như một trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo. Trình tự này được ding dé phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm. (Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ 2% đến 3,1%.Nghiên cứu về đa dang di truyền của các loài thuộc chỉ Cinnamomum Long não (Cinnamomum) là một chỉ lớn trong họ Long não (Lauraceae), gồm tối 250 loài phân bổ từ đại lục châu A đến khắp vùng Đông Nam Á, Australia và khu vực Tây Thái bình dương.

Tại miền Nam châu Mỹ. chỉ có một số ít loài, nhưng riêng khu vue Malesian đã phát hiện được khoảng 90 loài. Đến nay chỉ có khoảng 150 loài đã được nghiên cứu ở những chừng mực nhất định từng khía cạnh khác nhau.) là một loài thuộc chi Long não (Ciamamomum). họ Long não (Laurace: , được xếp trong danh lục đỏ của IUCN (1994) ở phân hang DD (Data Deficient, ver 2.

Ở Trung Quốc, Xá xj đã được mô tả chỉ đặc điểm hình thái. Các nghiên cứu s loài Xá xị chưa được. ‘quan tâm nhiễu. Trên đối tượng các loài thuộc họ Long Não (Lauraceae), nhóm nghiên cứu của Liu (Liu và es, 2016) đã sử dụng 04 trình tự ADN mã vạch là marK, zbcL, trnH-psbA và ITS2 đề đánh giá hiệu quả phân biệt loài.

Kết quả cho thấy, inh tự /7S2 không phù hợp để lầm ma vạch cho các loài thuộc họ Long não. Trình tự ømarK và rbcLL có tý lệ định danh loài thành công lần lượt là 30.0%, Trong khi đó trình tự zrnH-psbA có khả năng xác định loài với tỷ lệ đạt 84.0% ở cấp loài đối với 175 mẫu từ 117 loài huộc 35 chỉ trong họ Lauraceae. Nghiên cứu cũng cho thấy việ sử dụng chỉ thị /nI- psbA có hiệu quả xác định loài trong họ Long não cao hơn hin các chỉ thị ‘matK, rbcLL, hay sự kết hợp của cả matK và rbeL. Swetha và cộng sự (2014) áp dụng phương pháp mã vạch ADN 48 phát hiện những chất tạp nhiễm là một loại gia vị có giá trị cao, thường bi pha trộn với các loài kếm chất lượng như Cinnamomwm cassia và Cinnamomum malabatrum, Họ sử dụng các locus mã vạch rbcL, matK và psbA-trnH dé đánh gi iém năng của từng locus mã vạch để xác thực C.

verum tir các chất tạp nhiễm liên quan của nó. Khả năng khuếch đại và giải trình tự thành công là 100% đối với rbcL. và psbA-trnH trong khi marK không thể khuếch đại trong các mẫu thị trường do đó xác nhận sự hiện diện của tap nhiễm C> cassia trong các mẫu thương mại của qué thật. Trong số ba locus, locus rbcL tỏ ra hiệu quả trong việc tìm ra những chất tạp nhiễm trong qué được buôn bán.

Các vị trí da hình nucleotide đơn trong vùng này có thé được khai thác trong việc thiết kế các mỗi đặc hiệu cho C. cassia, cho phép phát triển bộ kit dé dé dàng phát hiện các chất tạp nhiễm ở chính cắp độ vùng bang do đó bỏ qua chi phí giải trình tự. Sudmoon và cộng sự (2014) đã sử dụng các vùng ;poB, rbcLL và matK để xác định bảy loài đã biết là Cinnamomum aromaum (dầu cassia), C. verum) và C, burmannii và bày loài chưa biết là các loài quế (họ long.

Nghiên cứu này nhằm điều tra sự da dang về loài của Cinnamomum được sử dụng trong các loại thuốc truyền thống, chất tạo hương cho thực phẩm và chưng cất dé lấy dầu thơm ở Thái Lan bằng kỹ thuật RAPD.