Luận án tiến sĩ nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏdioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học

Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong xử lý chất diệt cỏ dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học, góp phần bảo vệ môi trường.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tâm Thư
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Cẩm Hà
• Trường học: Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí Trong Phân Hủy Sinh Học Chất Diệt Cỏ và Dioxin
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Trang phụ bìa
• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình vẽ, đồ thị
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường
• 1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam
• 1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung
• 1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa
• 1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng
• 1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát
• 1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin
• 1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
• 1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin
• 1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin
• 1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
• 1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin
• 1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo
• 1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo
• 1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate
• 1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides
• 1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas
• 1.4.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo
• 1.5. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật
• 1.5.1. Phương pháp vi sinh vật
• 1.5.2. Phương pháp hóa sinh
• 1.5.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 1.5.4. Phương pháp Metagenomics
• 1.6. Các phương pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tương tự bằng phân hủy sinh học
• 1.7. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam
• 1.7.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng
• 1.7.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa
• 1.7.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng
• 2.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa
• 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng
• 2.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.5. Thành phần các môi trường nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng
• 2.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
• 2.5.2. Các dung dịch đã sử dụng
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất
• 2.6.2. Tách DNA tổng số
• 2.6.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý
• 2.6.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 2.6.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa
• 2.6.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
• 2.6.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo
• 2.6.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
• 2.6.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA
• 2.6.11. Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm
• 2.6.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ
• 2.6.11.2. Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu
• 2.6.12. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T
• 2.6.13. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
• 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý
• 3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý
• 3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý
• 3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu
• 3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
• 3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu
• 3.3. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa
• 3.3.1. Sự biến động số lượng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý
• 3.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý
• 3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào
• 3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý và trong mẫu làm giàu
• 3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics
• 3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm
• 3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.2. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.5.2.2. Ảnh hưởng của pH
• 3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
• 3.5.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
• 3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đất
• 3.5.2.6. Ảnh hưởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ
• 3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào
• 3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate
• 3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
• 3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP
• 3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm
• 3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides
• 3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
• 3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin
• 3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu
• 3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T
• 3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T
• 3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP
• 3.7.3. Khả năng phân hủy các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate BDN10T đã được làm sạch
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• SUMMARY

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí

Nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn kỵ khí trong phân hủy sinh học chất diệt cỏ và dioxin là một lĩnh vực quan trọng trong bảo vệ môi trường. Chất diệt cỏ chứa dioxin là một trong những chất độc hại, khó phân hủy và có tác động nghiêm trọng đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Việc tìm hiểu sự đa dạng của các quần xã vi khuẩn kỵ khí có thể giúp phát triển các phương pháp xử lý hiệu quả hơn.

1.1. Đặc điểm của Chất Diệt Cỏ và Dioxin

Chất diệt cỏ và dioxin là những hợp chất hữu cơ chứa clo, có khả năng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Chúng khó bị phân hủy bởi vi sinh vật và có thể tích tụ trong chuỗi thức ăn.

1.2. Tầm quan trọng của Vi Khuẩn Kỵ Khí

Vi khuẩn kỵ khí đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học các chất độc hại. Chúng có khả năng chuyển hóa và phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo, giúp làm sạch môi trường.

II. Vấn Đề Ô Nhiễm Môi Trường do Chất Diệt Cỏ và Dioxin

Ô nhiễm do chất diệt cỏ và dioxin đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng tại nhiều khu vực, đặc biệt là ở Việt Nam. Các nghiên cứu cho thấy rằng ô nhiễm này không chỉ ảnh hưởng đến môi trường mà còn đến sức khỏe con người. Việc tìm kiếm các giải pháp hiệu quả để xử lý ô nhiễm là rất cần thiết.

2.1. Tác Động của Dioxin đến Sức Khỏe

Dioxin có thể gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng, bao gồm ung thư và các bệnh về sinh sản. Việc hiểu rõ tác động của nó là cần thiết để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

2.2. Tình Hình Ô Nhiễm ở Việt Nam

Việt Nam đang phải đối mặt với tình trạng ô nhiễm dioxin nghiêm trọng, đặc biệt tại các khu vực như sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng. Các nghiên cứu cho thấy mức độ ô nhiễm cao và cần có các biện pháp xử lý kịp thời.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí

Để nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn kỵ khí, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định các loài vi khuẩn mà còn đánh giá khả năng phân hủy của chúng đối với chất diệt cỏ và dioxin.

3.1. Phương Pháp Sinh Học Phân Tử

Sử dụng các kỹ thuật như nested-PCR và DGGE để xác định sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn kỵ khí trong mẫu đất ô nhiễm. Những phương pháp này cho phép phân tích chính xác và nhanh chóng.

3.2. Phương Pháp Metagenomics

Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ giúp nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật trong môi trường. Phương pháp này cho phép phân tích toàn bộ hệ gen của quần xã vi khuẩn, từ đó hiểu rõ hơn về khả năng phân hủy của chúng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của các vi khuẩn kỵ khí có khả năng phân hủy chất diệt cỏ và dioxin. Những vi khuẩn này không chỉ có mặt trong các mẫu đất ô nhiễm mà còn có khả năng hoạt động hiệu quả trong điều kiện thiếu oxy.

4.1. Đánh Giá Khả Năng Phân Hủy

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy dioxin lên đến 99% sau một thời gian xử lý. Điều này mở ra hướng đi mới cho việc xử lý ô nhiễm môi trường.

4.2. Ứng Dụng Công Nghệ Phân Hủy Sinh Học

Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công tại nhiều khu vực ô nhiễm, giúp cải thiện chất lượng môi trường và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

V. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn kỵ khí trong phân hủy sinh học chất diệt cỏ và dioxin là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc hiểu rõ hơn về các vi khuẩn này sẽ giúp phát triển các phương pháp xử lý ô nhiễm hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tương Lai của Nghiên Cứu

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các vi khuẩn kỵ khí và khả năng phân hủy của chúng. Điều này sẽ giúp tìm ra các giải pháp tối ưu cho việc xử lý ô nhiễm.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Mới

Nên xem xét các phương pháp kết hợp giữa sinh học phân tử và công nghệ sinh học để tối ưu hóa quá trình phân hủy các chất độc hại trong môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là nhóm hợp chất hữu cơ chứa clo có độc tính cao, đặc tính tích lũy sinh học lớn và đặc biệt khó bị phân hủy trong môi trường tự nhiên. Trong chiến tranh giai đoạn 1961–1971, khối lượng lớn chất diệt cỏ chứa dioxin đã được rải xuống miền Trung và miền Nam Việt Nam. Mặc dù đã qua hơn 40 năm, hàm lượng tồn lưu tại các điểm nóng như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát vẫn ở mức rất cao, trong đó đồng phân cực độc 2,3,7,8-TCDD chiếm tới 99% tổng độ độc tương đương (TEQ).

Công nghệ phân hủy sinh học (bioremediation) thông qua phương pháp chôn lấp tích cực đã được thử nghiệm và ứng dụng tại Đà Nẵng (quy mô từ 0,5 m³ đến 100 m³) và Biên Hòa (lô xử lý 3.384 m³), đạt hiệu quả giảm độ độc từ 50–70% sau gần 2 năm tại Đà Nẵng và trên 99% sau 27 tháng tại Biên Hòa. Quá trình khử độc triệt để đòi hỏi sự phối hợp của nhiều nhóm vi sinh vật, trong đó quá trình loại khử clo kỵ khí (reductive dechlorination) giữ vai trò then chốt mở đầu nhằm hạ thấp số lượng nguyên tử clo, tạo điều kiện cho các vi sinh vật hiếu khí khoáng hóa tiếp theo. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, hiểu biết về cấu trúc quần xã, sự đa dạng di truyền và các nhóm gene chức năng của vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trong các lô xử lý này vẫn chưa được giải quyết một cách hệ thống; việc làm giàu nhóm vi khuẩn hô hấp loại clo bắt buộc trong nước chưa thu được kết quả hoàn chỉnh. Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tâm Thư được thực hiện nhằm giải quyết các khoảng trống khoa học này.

Mục đích nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

1. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.
2. Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.
3. Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo.

Để thực hiện các mục đích trên, luận án triển khai 6 nội dung nghiên cứu:

1. Xác định sự có mặt của một số nhóm vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR.
2. Nghiên cứu sự đa dạng vi khuẩn khử sulfate (KSF) và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp điện di trên gel biến tính (DGGE).
3. Đánh giá sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí sử dụng dioxin và vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý 3.384 m³ tại Biên Hòa.
4. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã vi khuẩn khử sulfate và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.
5. Đánh giá khả năng phân hủy hoặc chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo và vi khuẩn khử sulfate.
6. Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Quần xã vi khuẩn kỵ khí bản địa, nhóm vi khuẩn khử sulfate, chi Dehalococcoides, chi Pseudomonas, các chủng phân lập (như chủng KSF BDN10T); các chất ô nhiễm gồm 17 đồng phân PCDD/Fs, 2,3,7,8-TCDD, OCDD, 2,4,5-T, 2,4-D, và sản phẩm trung gian 2,4-DCP, 2,4,5-TCP.
• Phạm vi không gian: Mẫu đất lấy từ các lô xử lý chôn lấp tích cực thử nghiệm quy mô 10 m³, 100 m³ tại sân bay Đà Nẵng và lô xử lý quy mô 3.384 m³ tại khu Z1 sân bay Biên Hòa (thu thập tại 16 vị trí sau 36 tháng xử lý).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm, theo dõi mẫu nuôi cấy làm giàu kéo dài 12 tháng (1 năm) và các giai đoạn xử lý đất hiện trường từ 24 đến 36 tháng, hoàn thành năm 2013.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng thuật các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về các hợp chất hữu cơ chứa clo, cơ chế phân hủy sinh học và tính đa dạng của vi sinh vật tham gia chuyển hóa:

• Độc tính và tình hình ô nhiễm: Tài liệu của Schecter (2006), Smidt (2000, 2004), Fennell (2004), Tas (2009), Wagner (2009), Angelo (2010), Ssebugere (2013) cung cấp số liệu tổng quan về sự phát tán của dioxin, PCB, HCB, PCE, TCE trên thế giới. Báo cáo của Hatfield Consultants (2009, 2011) và Văn phòng 33 phản ánh thực trạng ô nhiễm dioxin tại các điểm nóng Đà Nẵng (nồng độ TCDD bề mặt đạt tới 361.000 ppt), Biên Hòa (khu Z1 nồng độ TCDD ở độ sâu 60–90 cm đạt 259.000 ppt, chiếm 99% TEQ) và Phù Cát (khu nhiễm độc cao đạt 11.000 ppt).
• Cơ chế chuyển hóa và phân hủy sinh học: Reineke (2001), Hiraishi (2003, 2008), Maphosa (2010), Yoshida (2005) xác định 4 con đường phân hủy sinh học chất clo hữu cơ: oxy hóa cắt vòng thơm nhờ enzyme dioxygenase hiếu khí; loại clo sản phẩm cắt vòng (ortho/meta hoặc ortho biến đổi); phân hủy bằng enzyme ngoại bào (laccase, MnP, LiP do nấm mục gỗ Phanerochaete chrysosporium, xạ khuẩn tiết ra); và hô hấp loại clo kỵ khí nhờ hệ enzyme nội bào reductive dehalogenase (RdhA).
• Vi khuẩn phân hủy hiếu khí: Fukumori (1993), Kitagawa (2002), Mai (2001), Itoh (2004), Vroumsia (2005), Chang (2008), Habe (2001), Aly (2008), Hong (2004), Hartmann (2013), Sowers (2013), Hidayat (2013), Cvančarová (2013) làm rõ khả năng chuyển hóa 2,4-D, 2,4,5-T, DBF, DD, 1-MCDD, 2-MCDD bởi các chủng Burkholderia, Cupriavidus necator JMP134, Sphingomonas wittichii RW1, Rhodococcus opacus SAO101, Terrabacter sp. DBF63.
• Vi khuẩn hô hấp loại khử clo kỵ khí: Hiraishi (2008), Richardson (2013), Kranzioch (2013) phân loại vi khuẩn hô hấp clo thành 3 ngành chính: Proteobacteria, Firmicutes, Chloroflexi.
  • Nhóm hô hấp loại clo bắt buộc: Chi Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Dehalobacter. Löffler và cộng sự (2013) thống nhất phân loại loài Dehalococcoides mccartyi với 6 chủng chuẩn (195, CBDB1, BAV1, VS, FL2, GT). Hendrickson (2002) chia nhóm này thành 3 phân nhóm di truyền: Cornell, Victoria và Pinellas. Bunge và cộng sự (2003, 2008, 2009) chứng minh khả năng loại clo 1,2,3,4-TCDD, 1,2,3,7,8-PeCDD của chủng CBDB1. Kube (2005), Seshadri (2005), Wagner (2009) phân tích số lượng bản sao gene rdhA (cbrA, pceA, tceA).
  • Nhóm hô hấp loại clo không bắt buộc: Điển hình là nhóm vi khuẩn khử sulfate (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfomonile, Desulfococcus). Barton (2007), Muyzer (2008), Boyle (1995, 1999b), Sun (2000), Häggblom (2006), Drzyzga (2001), Duret (2012), Bisaillon (2010), Marzorati (2007), Ritalahti (2004) chứng minh vai trò khử sulfate và khử clo của D. hafniense, D. dehalogenans, D. dechloracetivorans.
  • Nhóm loại clo đồng trao đổi chất: Điển hình là chi Pseudomonas, Clostridium, Shewanella. Nghiên cứu của Kaschabek (2002), Kim (2009), Gohil (2011) mô tả các chuỗi enzyme chuyển hóa hợp chất clo và cắt vòng benzoate, phenylacetate.
• Nghiên cứu tại Việt Nam: Các công trình của Đặng Thị Cẩm Hà (2005, 2009, 2012), Kiều Hữu Ảnh (2003), Hoàng Thị Mỹ Hạnh (2004), La Thanh Phương (2005), Lê Văn Nhương (2005), Nguyễn Bá Hữu (2007, 2008, 2009), Nguyễn Thị Sánh (2005, 2007), Phạm Ngọc Long (2009), Nguyễn Ngọc Bảo (2010), Phùng Khắc Huy Chú (2012) đã phát hiện sự tồn tại của Pseudomonas, Desulfovibrio, Dehalococcoides trong các lô xử lý thực nghiệm tại Đà Nẵng và Biên Hòa.

Khoảng trống nghiên cứu được lựa chọn giải quyết: Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chủ yếu tiếp cận vi khuẩn hiếu khí hoặc phân tích đơn lẻ một số đoạn gene bằng kỹ thuật PCR-DGGE/SSCP thông thường; chưa xây dựng được quy trình làm giàu thành công toàn diện quần xã vi khuẩn kỵ khí có đầy đủ 3 nhóm chức năng (bắt buộc, không bắt buộc và đồng trao đổi chất) từ đất ô nhiễm nồng độ cao; chưa ứng dụng công cụ giải trình tự thế hệ mới Metagenomics để đánh giá hệ gene chức năng phân hủy clo hữu cơ trong các lô xử lý thực địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết chuyển hóa sinh học kỵ khí các hợp chất cơ clo (chloroethene, chlorophenol, chlorophenoxyalkanoic acid, PCDD/Fs). Khung phân tích tập trung vào quá trình hô hấp loại clo (Reductive dehalogenation) — phản ứng trong đó hợp chất clo hữu cơ đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng, khí hydro ($H_2$) hoặc các axit hữu cơ chuỗi ngắn đóng vai trò chất cho điện tử dưới sự xúc tác của phức hệ enzyme reductive dehalogenase (RdhA) chứa cụm sắt-lưu huỳnh ($Fe/S$) và nhân corrinoid.

Phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp đồng thời phương pháp sinh học phân tử hiện đại, phương pháp vi sinh vật học thực nghiệm và phương pháp hóa phân tích:

• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số trực tiếp từ mẫu đất hiện trường và mẫu nuôi cấy làm giàu.
  • Kỹ thuật Nested-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene 16S rRNA của vi khuẩn khử sulfate, Dehalococcoides và gene chức năng rdhA.
  • Điện di trên gel biến tính (DGGE) với gradient biến tính thích hợp (sử dụng cặp mồi DCC305f/DSV838r cho KSF và các mồi chuyên biệt cho Dehalococcoides) để phân tích cấu trúc và thành phần loài vi khuẩn.
  • Tách dòng, giải trình tự đoạn gene 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree).
  • Phương pháp Metagenomics: Giải trình tự hệ gene metagenome trực tiếp trên hệ thống máy Roche 454 GS Junior; xử lý và lắp ráp chuỗi nucleotide bằng phần mềm Newbler; phân tích chú giải chức năng và phân loại vi sinh vật qua hệ thống MG-RAST.
• Phương pháp vi sinh vật học thực nghiệm:
  • Nuôi cấy làm giàu vi khuẩn kỵ khí trên môi trường khoáng chuyên dụng bổ sung dịch chiết đất ô nhiễm (DCĐ), 2,4,5-T và 2,4-DCP trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt.
  • Đánh giá động thái số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm số ống có thể nhất (MPN) và đếm khuẩn lạc sống.
  • Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ từ 20–45°C, pH từ 5,0–9,0, nồng độ NaCl từ 0–5%, nguồn carbon khác nhau, nồng độ dịch chiết đất và các hợp chất clo hữu cơ) lên sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate.
  • Làm sạch và quan sát hình thái tế bào vi khuẩn kỵ khí dưới kính hiển vi.
• Phương pháp hóa học:
  • Chiết tách chất diệt cỏ/dioxin từ mẫu đất và môi trường nuôi cấy.
  • Phân tích định tính và định lượng 2,4-DCP, 2,4,5-T bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  • Phân tích xác định 17 đồng phân PCDD/Fs và tính toán tổng độ độc tương đương (TEQ) bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ phân giải cao (HRGC/HRMS).

Nguồn tư liệu và dữ liệu

Dữ liệu phân tích gồm mẫu đất lấy từ các vị trí xử lý tại sân bay Đà Nẵng, 16 mẫu đất thu từ lô chôn lấp tích cực 3.384 m³ tại khu Z1 sân bay Biên Hòa sau 36 tháng xử lý; tập dữ liệu metagenome phân tích từ mẫu làm giàu 12 tháng; các phổ sắc ký HPLC và dữ liệu phân tích khối phổ GC/MS đo độ độc tồn lưu.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương này tổng quan toàn diện các tư liệu khoa học về đặc điểm cấu tạo, tính chất lý hóa, thời gian bán hủy và độ độc của các hợp chất hữu cơ chứa clo (chất diệt cỏ phenoxy 2,4-D, 2,4,5-T; các đồng phân PCDD/Fs; PCB, HCB, TCE, PCE). Trình bày chi tiết thực trạng ô nhiễm dioxin tại các căn cứ quân sự cũ ở Việt Nam (Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát). Phân tích chi tiết 4 cơ chế phân hủy sinh học chất hữu cơ chứa clo ở điều kiện hiếu khí và kỵ khí; làm rõ vai trò sinh lý của 3 nhóm vi khuẩn hô hấp clo (Firmicutes, Proteobacteria, Chloroflexi), cấu trúc hệ enzyme RdhA và sự đa dạng các gene chức năng (rdhA, tfdA, dioxygenase). Khái quát các phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật trong đất từ phương pháp nuôi cấy truyền thống đến sinh học phân tử và Metagenomics.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu đất từ các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Bảng trình tự các cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu sử dụng trong phản ứng PCR, Nested-PCR và DGGE. Liệt kê hóa chất, thiết bị máy móc, công thức pha chế môi trường nuôi cấy kỵ khí và các dung dịch đệm. Quy trình chiết tách DNA tổng số, quy trình đổ gel và chạy DGGE theo nồng độ chất biến tính. Quy trình làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn khử sulfate trên cơ chất dịch chiết đất, 2,4,5-T, 2,4-DCP. Quy trình thử nghiệm sinh lý sinh thái, kỹ thuật làm sạch chủng vi khuẩn BDN10T. Phương pháp giải trình tự metagenome bằng hệ thống Roche 454 GS Junior, xử lý dữ liệu bằng Newbler và MG-RAST; phương pháp phân tích sắc ký HPLC và GC/MS.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu cấu trúc quần xã, thử nghiệm sinh học và hiệu quả phân hủy hóa học:

• Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý: Phân tích Nested-PCR và DGGE xác định sự có mặt đồng thời của vi khuẩn khử sulfate và Dehalococcoides trong các mẫu đất xử lý tại Đà Nẵng và Biên Hòa. Phân tích phát sinh chủng loại dựa trên đoạn 16S rRNA ghi nhận các dòng vi khuẩn khử sulfate có quan hệ gần gũi với Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfitobacterium, và các dòng Dehalococcoides thuộc các phân nhóm Cornell, Victoria.
• Phân tích Metagenome mẫu làm giàu vi khuẩn kỵ khí: Mẫu làm giàu từ 16 vị trí đất lô xử lý Biên Hòa sau 36 tháng được phân tích hệ gene metagenome bằng máy Roche 454 GS Junior và chú giải qua MG-RAST. Kết quả ghi nhận tập đoàn vi sinh vật đa dạng với sự chiếm ưu thế của Proteobacteria, trong đó chi Pseudomonas chiếm tỷ lệ cao nhất. Đã phát hiện hàng loạt gene chức năng mã hóa enzyme chuyển hóa vòng thơm và loại halogen như haloacid dehalogenase, reductive dehalogenase (rdhA), dioxygenase, hydrolase.
• Đặc điểm sinh thái của quần xã vi khuẩn khử sulfate: Quần xã vi khuẩn khử sulfate làm giàu từ Đà Nẵng và Biên Hòa sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30–37°C, pH 7,0–7,5, nồng độ NaCl 0,5–1,0%, thích ứng tốt khi sử dụng nguồn carbon là lactate, pyruvate và chịu được nồng độ dịch chiết đất cũng như các chất cơ clo ở mức xác định. Phân lập và làm sạch thành công chủng vi khuẩn khử sulfate BDN10T từ mẫu Đà Nẵng.
• Khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất diệt cỏ/dioxin: Quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu từ đất Biên Hòa sau thời gian nuôi cấy đã làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ trên mẫu đất ô nhiễm ban đầu có độ độc rất cao (41.265 ng TEQ/kg đất khô), phân hủy đáng kể các đồng phân dioxin/furan từ 4 đến 8 clo, đặc biệt là 2,3,7,8-TCDD và OCDD. Quần xã vi khuẩn làm giàu và chủng làm sạch BDN10T chuyển hóa hiệu quả 2,4,5-T và sản phẩm trung gian 2,4-DCP, 2,4,5-TCP.

Dưới đây là bảng tổng hợp các nhóm vi khuẩn và khả năng phân hủy hợp chất clo hữu cơ được ghi nhận trong nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu / Nhóm vi khuẩn	Nhóm hô hấp loại clo	Phương pháp phát hiện / Phân tích	Cơ chất chuyển hóa / Phân hủy ghi nhận	Hiệu quả / Đặc điểm sinh học chính
Dehalococcoides spp. (nhóm Cornell, Victoria)	Hô hấp loại clo bắt buộc	Nested-PCR, DGGE, giải trình tự 16S rRNA	PCDD/Fs, 2,4,5-T, 2,4-DCP	Tồn tại trong các lô xử lý; mang các gene rdhA tham gia khử clo
Dehalogenimonas spp.	Hô hấp loại clo bắt buộc	Metagenomics (Roche 454, MG-RAST)	Hợp chất mạch thẳng và vòng chứa clo	Hiện diện trong metagenome mẫu làm giàu đất Biên Hòa
Vi khuẩn khử sulfate (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfococcus)	Hô hấp loại clo không bắt buộc	Nested-PCR, DGGE, nuôi cấy kỵ khí	2,4,5-T, 2,4-DCP, dịch chiết đất ô nhiễm	Sinh trưởng tối ưu ở 30–37°C, pH 7,0–7,5; sử dụng lactate/pyruvate
Chủng vi khuẩn KSF BDN10T	Hô hấp loại clo không bắt buộc	Phân lập, làm sạch, giải trình tự 16S rRNA, HPLC	2,4-DCP, 2,4,5-TCP	Chuyển hóa và làm giảm nồng độ các chất chlorophenol trung gian
Pseudomonas spp.	Loại clo đồng trao đổi chất	DGGE, Metagenomics, nuôi cấy	2,4-D, 2,4,5-T, PCDD/Fs, chlorocatechol	Chiếm ưu thế lớn nhất trong metagenome mẫu làm giàu; mang gene tfdA, haloacid dehalogenase
Quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu (từ đất Biên Hòa 36 tháng)	Tập đoàn hỗn hợp (bắt buộc, không bắt buộc, đồng trao đổi chất)	Nuôi cấy làm giàu 1 năm, HRGC/HRMS, HPLC, Metagenomics	Đất ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô), 17 đồng phân PCDD/Fs, 2,4,5-T	Giảm 55,7% tổng độ độc TEQ; phân hủy đồng thời 2,3,7,8-TCDD, OCDD và các chlorophenol

Chương 4. Bàn luận

Chương này bàn luận chuyên sâu về mối tương quan giữa động thái biến động quần xã vi khuẩn kỵ khí với hiệu suất khử độc chất diệt cỏ/dioxin trong quy trình chôn lấp tích cực. Tác giả luận giải cơ chế phối hợp trao đổi chất giữa ba nhóm vi khuẩn: nhóm đồng trao đổi chất (Pseudomonas) và vi khuẩn khử sulfate (Desulfovibrio, Desulfitobacterium) đóng vai trò tạo sinh khối, hạ thế oxy hóa khử và chuyển hóa bước đầu; nhóm hô hấp loại clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas) sử dụng $H_2$ làm chất cho điện tử để khử clo ở các vị trí bền vững trên khung dioxin. Đối chiếu dữ liệu metagenomics với các nghiên cứu quốc tế để làm sáng tỏ sự phân bố đa dạng của các cụm gene rdhA, haloacid dehalogenase và dioxygenase trong điều kiện thực địa tại Việt Nam.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam làm giàu thành công quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo từ đất chôn lấp tích cực xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Quần xã làm giàu bao gồm đầy đủ cả ba nhóm chức năng: nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter); và nhóm hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella), trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế.
2. Đã đánh giá định lượng khả năng phân hủy và chuyển hóa làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ trên mẫu đất ô nhiễm rất nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí. Đánh giá được hiệu suất phân hủy 17 đồng phân PCDD/PCDF, 2,4,5-T và các sản phẩm phân hủy sinh học trung gian (2,4,5-TCP, 2,4-DCP) bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí cũng như bởi chủng vi khuẩn khử sulfate BDN10T đã được làm sạch.
3. Lần đầu tiên tại Việt Nam áp dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí và xác định các nhóm gene chức năng (rdhA, haloacid dehalogenase, dioxygenase...) tham gia vào chuỗi phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu 1 năm từ đất sau 36 tháng xử lý tại sân bay Biên Hòa.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và bảo tồn tập đoàn vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo có hoạt tính cao nhằm phục vụ nhân giống quy mô lớn.
• Kiến nghị ứng dụng kết hợp quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo đã được làm giàu vào các quy trình công nghệ sinh học chôn lấp tích cực quy mô lớn tại các vùng đất ô nhiễm dioxin còn lại ở Việt Nam nhằm rút ngắn thời gian xử lý và nâng cao hiệu quả khử độc hoàn toàn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Nghiên cứu tập trung chủ yếu trên các mẫu đất và mẫu làm giàu thu thập từ các lô xử lý chôn lấp tích cực tại sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng, chưa mở rộng phân tích toàn diện trên các mẫu đất ô nhiễm thuộc các điểm nóng khác như Phù Cát.
• Việc phân lập thuần khiết các chủng vi khuẩn hô hấp loại clo kỵ khí bắt buộc (Dehalococcoides) gặp rào cản sinh học lớn do đặc tính phụ thuộc cộng sinh dinh dưỡng nghiêm ngặt trong quần xã, do đó các đánh giá chuyển hóa chủ yếu thực hiện trên mẫu tập đoàn làm giàu hoặc chủng vi khuẩn khử sulfate dễ nuôi cấy (BDN10T).

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiếp tục nghiên cứu phân lập thuần khiết và giải mã chi tiết các gene rdhA đặc thù của các chủng Dehalococcoides bản địa.
• Thử nghiệm bổ sung các chất cho điện tử thích hợp ($H_2$, lactate, formate) và các đồng yếu tố (vitamin B12) nhằm thúc đẩy tối đa tốc độ loại clo kỵ khí của quần xã vi sinh vật trong điều kiện xử lý thực tế ngoài hiện trường.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học, Sinh học môi trường và Khoa học môi trường: Tham khảo cơ sở lý luận về cơ chế hô hấp loại clo kỵ khí, các con đường phân hủy sinh học dioxin và các hợp chất phenoxy.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa vi sinh học truyền thống với sinh học phân tử hiện đại (Nested-PCR, DGGE) và công cụ Metagenomics (nền tảng Roche 454, Newbler, MG-RAST) trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất không nuôi cấy được.
• Cơ quan quản lý, các nhà khoa học và chuyên gia môi trường/quân đội: Cung cấp số liệu thực nghiệm khoa học phục vụ thiết kế, vận hành và tối ưu hóa các quy trình công nghệ xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học/dioxin tồn lưu sau chiến tranh bằng biện pháp phân hủy sinh học tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu từ đất lô xử lý Biên Hòa gồm những nhóm chức năng nào và chi nào chiếm ưu thế?
Quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu bao gồm đủ 3 nhóm chức năng: nhóm hô hấp loại clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); nhóm hô hấp loại clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter); và nhóm loại clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella). Trong đó, chi Pseudomonas chiếm tỷ lệ ưu thế lớn nhất trong dữ liệu metagenome.

2. Hiệu suất khử độc dioxin của quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu đạt được mức độ nào trên mẫu đất ô nhiễm nặng?
Trên mẫu đất ô nhiễm rất nặng có tổng độ độc ban đầu là 41.265 ng TEQ/kg đất khô, quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu đã phân hủy và chuyển hóa làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ, phân hủy đồng thời 17 đồng phân PCDD/PCDF, trong đó có hai đồng phân chính là 2,3,7,8-TCDD và OCDD.

3. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng như thế nào đến sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate trong nghiên cứu?
Quần xã vi khuẩn khử sulfate làm giàu từ Đà Nẵng và Biên Hòa sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 30–37°C, khoảng pH trung tính 7,0–7,5, nồng độ muối NaCl từ 0,5–1,0%, sử dụng tốt nguồn carbon hữu cơ là lactate và pyruvate, đồng thời duy trì khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa dịch chiết đất ô nhiễm và các chất cơ clo ở nồng độ xác định.

4. Công cụ Metagenomics đã phát hiện những nhóm gene chức năng quan trọng nào trong mẫu làm giàu?
Phân tích Metagenomics trên hệ thống Roche 454 GS Junior và MG-RAST đã xác định sự hiện diện của các nhóm gene reductive dehalogenase (rdhA), haloacid dehalogenase, các gene mã hóa enzyme cắt vòng thơm dioxygenase, ring-hydroxylating complex, hydrolase và các enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa các hợp chất vòng thơm chứa clo.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Tâm Thư đã làm sáng tỏ cấu trúc và sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo cũng như các hệ gene chức năng liên quan trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa. Công trình đã làm giàu thành công tập đoàn vi khuẩn kỵ khí đa dạng có khả năng làm giảm 55,7% độ độc TEQ trên đất ô nhiễm nặng và chứng minh vai trò chuyển hóa của các chủng vi khuẩn khử sulfate làm sạch. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng, khẳng định tiềm năng ứng dụng công nghệ phân hủy sinh học trong việc xử lý triệt để các điểm nóng ô nhiễm dioxin tồn lưu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme.

Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo. Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3 đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3. Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin.

Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành. Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này.

Đặc biệt, 2 nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công.

Để tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”. Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây: Mục đích nghiên cứu  Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.  Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.  Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo.

Nội dung nghiên cứu  Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR.  Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.  Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử lý 3. 3  Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.

 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.  Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng. Phƣơng pháp nghiên cứu 1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu.

Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin.

Các VK KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là 2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5- TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên đất ô nhiễm ở mục (2).

5 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo 1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v., trong nông nghiệp và cả trong chiến tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006).

Thời gian bán hủy của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa. Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng thơm và đa vòng thơm (Hình 1. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009).

(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian 6 của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin (PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau.

Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác. cis-1,3- Tetrachloroethene Trichloroethene -hexachlorocyclohexane dichloropropene (PCE) (TCE) (HCH) 2,4,5-T 2,4-D 2,4-dichlorophenol 1,2,4,5- (2,4-DCP) tetrachlorobenzen PCDD PCDF 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p- dioxin (2,3,7,8-TCDD) Hình 1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình 2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật.

2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5- trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong nông nghiệp và lâm nghiệp. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc tương đương là 1 (Schecter, 2006).