Nghiên Cứu Đa Dạng Quần Xã Vi Khuẩn Kỵ Khí Trong Phân Hủy Sinh Học Chất Diệt Cỏ và Dioxin

Chất diệt cỏ chứa dioxin là một trong những chất hữu cơ chứa clo độc hại, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến… 166 trang · Viện Công Nghệ Sinh Học · 2013.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tâm Thư
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Cẩm Hà
• Trường học: Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí Trong Phân Hủy Sinh Học Chất Diệt Cỏ và Dioxin
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường
• 1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam
• 1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung
• 1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa
• 1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng
• 1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát
• 1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo
• 1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin
• 1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
• 1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin
• 1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin
• 1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy
• 1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin
• 1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo
• 1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo
• 1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate
• 1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides
• 1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas
• 1.4.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo
• 1.5. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật
• 1.5.1. Phương pháp vi sinh vật
• 1.5.2. Phương pháp hóa sinh
• 1.5.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 1.5.4. Phương pháp Metagenomics
• 1.6. Các phương pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tương tự bằng phân hủy sinh học
• 1.7. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam
• 1.7.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng
• 1.7.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa
• 1.7.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng
• 2.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa
• 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng
• 2.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.5. Thành phần các môi trường nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng
• 2.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
• 2.5.2. Các dung dịch đã sử dụng
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất
• 2.6.2. Tách DNA tổng số
• 2.6.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý
• 2.6.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại
• 2.6.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa
• 2.6.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
• 2.6.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo
• 2.6.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate
• 2.6.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
• 2.6.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA
• 2.6.11. Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm
• 2.6.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ
• 2.6.11.2. Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu
• 2.6.11.3. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T
• 2.6.12. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
• 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý
• 3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý
• 3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý
• 3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu
• 3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
• 3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu
• 3.3. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa
• 3.3.1. Sự biến động số lượng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý
• 3.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý
• 3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào
• 3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý và trong mẫu làm giàu
• 3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics
• 3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm
• 3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.2. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.5.2.2. Ảnh hưởng của pH
• 3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
• 3.5.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
• 3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đất
• 3.5.2.6. Ảnh hưởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ
• 3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate
• 3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào
• 3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate
• 3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
• 3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP
• 3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm
• 3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides
• 3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu
• 3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin
• 3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu
• 3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T
• 3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T
• 3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP
• 3.7.3. Khả năng phân hủy các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate BDN10T đã được làm sạch
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• SUMMARY

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vi Khuẩn Kỵ Khí Phân Hủy Dioxin Chất Diệt Cỏ

Chất diệt cỏ chứa dioxin là một trong những chất hữu cơ chứa clo độc hại, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Khả năng phân hủy tự nhiên của chúng rất hạn chế. Giải pháp phân hủy sinh học (bioremediation) sử dụng vi khuẩn kỵ khí đang được nghiên cứu rộng rãi vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin, cũng như đánh giá tiềm năng phân hủy sinh học của chúng. Mục tiêu là tối ưu hóa quy trình xử lý ô nhiễm bằng cách khai thác sức mạnh của vi sinh vật kỵ khí.

1.1. Đặc điểm ô nhiễm chất diệt cỏ và dioxin

Chất diệt cỏ chứa dioxin là một vấn đề ô nhiễm nghiêm trọng tại nhiều khu vực, đặc biệt là các khu vực quân sự trước đây như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng. Sự tồn tại dai dẳng của dioxin trong môi trường gây ra những tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Việc xử lý đất ô nhiễm bằng các phương pháp truyền thống thường tốn kém và gây ảnh hưởng đến môi trường. Do đó, phân hủy sinh học nổi lên như một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn. Cần nghiên cứu sâu hơn về các vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân hủy các chất này.

1.2. Vai trò của vi khuẩn kỵ khí trong xử lý ô nhiễm

Vi khuẩn kỵ khí đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ trong điều kiện thiếu oxy. Quá trình phân hủy kỵ khí thường bao gồm nhiều giai đoạn, trong đó các vi sinh vật khác nhau thực hiện các phản ứng khác nhau. Việc hiểu rõ sinh thái học vi sinh vật và cơ chế phân hủy của các vi khuẩn kỵ khí là rất quan trọng để phát triển các phương pháp xử lý ô nhiễm hiệu quả. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc xác định và phân lập các vi khuẩn kỵ khí có khả năng phân hủy chất diệt cỏ và dioxin.

II. Thách Thức Phân Hủy Sinh Học Dioxin Chất Diệt Cỏ Kỵ Khí

Quá trình phân hủy sinh học các hợp chất clo hóa, đặc biệt là dioxin, trong điều kiện kỵ khí đặt ra nhiều thách thức. Bản chất trơ về mặt hóa học và độc tính cao của dioxin đòi hỏi các vi khuẩn kỵ khí có các enzym phân hủy đặc biệt và khả năng chịu đựng nồng độ độc hại cao. Hiệu quả của quá trình phân hủy cũng phụ thuộc vào các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng. Việc xác định và tối ưu hóa các điều kiện môi trường để tăng cường hoạt động của vi khuẩn kỵ khí là một thách thức quan trọng.

2.1. Giới hạn sinh học trong phân hủy dioxin kỵ khí

Sự phân hủy kỵ khí dioxin bị giới hạn bởi nhiều yếu tố sinh học. Các vi khuẩn kỵ khí có khả năng phân hủy dioxin thường phát triển chậm và đòi hỏi các điều kiện môi trường cụ thể. Cơ chế phân hủy dioxin của các vi khuẩn kỵ khí vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn, gây khó khăn cho việc tối ưu hóa quy trình xử lý. Cần nghiên cứu sâu hơn về gen vi khuẩn và enzym phân hủy để vượt qua những giới hạn này.

2.2. Yếu tố môi trường ảnh hưởng quá trình phân hủy

Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, độ ẩm và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của vi khuẩn kỵ khí trong quá trình phân hủy sinh học chất diệt cỏ và dioxin. Việc tối ưu hóa các yếu tố môi trường này có thể giúp tăng cường hiệu quả phân hủy và giảm thời gian xử lý ô nhiễm. Cần thực hiện các thí nghiệm để xác định các điều kiện môi trường tối ưu cho sự phát triển và hoạt động của các vi khuẩn kỵ khí.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí Phân Hủy

Nghiên cứu này sử dụng kết hợp các phương pháp vi sinh vật, sinh học phân tử, và hóa sinh để đánh giá sự đa dạng và hoạt động của vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các phương pháp sinh học phân tử như DGGE và Metagenomics được sử dụng để xác định các loài vi khuẩn kỵ khí khác nhau và các gen vi khuẩn liên quan đến quá trình phân hủy. Các phương pháp hóa sinh được sử dụng để đo lường nồng độ các chất ô nhiễm và sản phẩm phân hủy, từ đó đánh giá hiệu quả phân hủy của các vi khuẩn kỵ khí.

3.1. Kỹ thuật phân tích sinh học phân tử tiên tiến

Các kỹ thuật sinh học phân tử như định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rRNA, DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) và Metagenomics cung cấp các công cụ mạnh mẽ để phân tích sự đa dạng và thành phần của quần xã vi sinh vật kỵ khí. Metagenomics cho phép nghiên cứu toàn bộ gen vi khuẩn trong một mẫu môi trường, giúp xác định các gen chức năng liên quan đến quá trình phân hủy. Các kỹ thuật này giúp hiểu rõ hơn về sinh thái học vi sinh vật và cơ chế phân hủy của các vi khuẩn kỵ khí.

3.2. Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn

Việc làm giàu và phân lập các vi khuẩn kỵ khí có khả năng phân hủy chất diệt cỏ và dioxin là rất quan trọng để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân hủy và tiềm năng ứng dụng của chúng. Phương pháp này bao gồm nuôi cấy vi khuẩn trong các môi trường chọn lọc chứa chất diệt cỏ hoặc dioxin làm nguồn carbon duy nhất. Sau đó, các vi khuẩn có khả năng phát triển được phân lập và định danh vi khuẩn. Việc này giúp tạo ra các chủng vi khuẩn thuần khiết để nghiên cứu chi tiết hơn.

3.3. Đánh giá hiệu quả phân hủy bằng phương pháp hóa sinh

Việc đánh giá hiệu quả phân hủy của các vi khuẩn kỵ khí đòi hỏi các phương pháp hóa sinh để đo lường nồng độ các chất ô nhiễm và sản phẩm phân hủy trong môi trường nuôi cấy. Các kỹ thuật như HPLC (High Performance Liquid Chromatography) và GC/MS (Gas Chromatography/Mass Spectrometry) được sử dụng để phân tích định lượng các chất này. Kết quả phân tích giúp đánh giá khả năng phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ và dioxin của các vi khuẩn kỵ khí.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn Kỵ Khí Phân Hủy Dioxin

Nghiên cứu đã xác định sự hiện diện của nhiều loài vi khuẩn kỵ khí khác nhau trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin, bao gồm các loài thuộc các chi Dehalococcoides, Desulfovibrio, và Geobacter. Các loài Dehalococcoides được biết đến với khả năng hô hấp loại khử clo các hợp chất clo hóa, trong khi các loài Desulfovibrio và Geobacter có khả năng phân hủy các chất hữu cơ khác và tạo điều kiện cho quá trình phân hủy dioxin diễn ra. Metagenomics cho thấy sự hiện diện của nhiều gen vi khuẩn liên quan đến quá trình phân hủy các hợp chất clo hóa.

4.1. Phát hiện các chi vi khuẩn kỵ khí quan trọng

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý đất ô nhiễm. Các chi vi khuẩn quan trọng được phát hiện bao gồm Dehalococcoides, Desulfovibrio, và Geobacter. Dehalococcoides có khả năng hô hấp loại khử clo, một quá trình quan trọng trong phân hủy các hợp chất clo hóa. Desulfovibrio và Geobacter có khả năng phân hủy các chất hữu cơ khác và tạo điều kiện khử để dioxin có thể bị phân hủy.

4.2. Phân tích gen chức năng tham gia phân hủy

Phân tích Metagenomics đã xác định nhiều gen chức năng liên quan đến quá trình phân hủy các hợp chất clo hóa trong gen vi khuẩn của quần xã vi sinh vật kỵ khí. Các gen này mã hóa cho các enzym phân hủy có khả năng loại bỏ clo từ các phân tử dioxin và chất diệt cỏ, làm cho chúng dễ bị phân hủy hơn. Việc xác định các gen này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phân hủy và có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp công nghệ sinh học môi trường tiên tiến.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Vi Khuẩn Kỵ Khí Trong Xử Lý Ô Nhiễm

Kết quả nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp ứng dụng sinh học hiệu quả hơn để xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Việc sử dụng vi khuẩn kỵ khí trong các quy trình bioremediation có thể giúp giảm chi phí và tác động môi trường so với các phương pháp xử lý truyền thống. Việc kết hợp các phương pháp xử lý khác nhau, chẳng hạn như phân hủy hiếu khí và kỵ khí, có thể mang lại hiệu quả xử lý cao hơn.

5.1. Bioremediation tăng cường bằng vi khuẩn kỵ khí

Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các chiến lược bioremediation tăng cường, trong đó các vi khuẩn kỵ khí được bổ sung vào đất ô nhiễm để tăng cường quá trình phân hủy. Việc bổ sung các chất dinh dưỡng và điều chỉnh các yếu tố môi trường cũng có thể giúp tăng cường hoạt động của vi khuẩn kỵ khí. Điều này có thể giúp đẩy nhanh quá trình xử lý và giảm chi phí so với các phương pháp xử lý truyền thống.

5.2. Phát triển công nghệ sinh học môi trường tiên tiến

Nghiên cứu về gen vi khuẩn và enzym phân hủy có thể được sử dụng để phát triển các công nghệ sinh học môi trường tiên tiến, chẳng hạn như các enzym tái tổ hợp hoặc các vi khuẩn biến đổi gen có khả năng phân hủy dioxin và chất diệt cỏ hiệu quả hơn. Các công nghệ này có thể giúp giải quyết các vấn đề ô nhiễm phức tạp và bảo vệ môi trường cho các thế hệ tương lai.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Vi Khuẩn Kỵ Khí

Nghiên cứu này đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng và hoạt động của vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các kết quả này có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp xử lý ô nhiễm hiệu quả hơn và bền vững hơn. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá các cơ chế phân hủy mới và phát triển các công nghệ sinh học môi trường tiên tiến để giải quyết các vấn đề ô nhiễm phức tạp.

6.1. Tối ưu hóa quy trình phân hủy kỵ khí

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình phân hủy kỵ khí bằng cách điều chỉnh các yếu tố môi trường, bổ sung các chất dinh dưỡng và sử dụng các vi khuẩn cộng sinh để tăng cường hiệu quả phân hủy. Việc nghiên cứu các tương tác giữa các vi khuẩn khác nhau trong quần xã vi sinh vật cũng có thể giúp phát triển các chiến lược xử lý hiệu quả hơn.

6.2. Nghiên cứu cơ chế và enzym phân hủy dioxin

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân hủy dioxin và các enzym phân hủy có thể giúp phát triển các enzym tái tổ hợp hoặc các vi khuẩn biến đổi gen có khả năng phân hủy dioxin hiệu quả hơn. Việc này đòi hỏi các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến và sự hợp tác giữa các nhà khoa học từ nhiều lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin từ thời kỳ chiến tranh tại các điểm nóng như sân bay Biên Hòa, sân bay Đà Nẵng và sân bay Phù Cát là vấn đề môi trường phức tạp do độc tính cao và tính bền vững của các hợp chất cơ clo đa vòng thơm. Phương pháp phân hủy sinh học (bioremediation) thông qua công nghệ chôn lấp tích cực đã được thử nghiệm và ứng dụng thực tế ở quy mô từ 0,5 $\text{m}^3$ đến 100 $\text{m}^3$ tại Đà Nẵng (đạt hiệu quả khử độc 50–70% sau gần 2 năm) và quy mô 3.384 $\text{m}^3$ tại Biên Hòa (đạt hiệu quả trên 99% sau 27 tháng). Tuy nhiên, cơ sở sinh học phân tử và vai trò của quần xã vi sinh vật kỵ khí tham gia hô hấp loại khử clo trong các khối ủ này chưa được làm sáng tỏ một cách hệ thống, đặc biệt là việc làm giàu và phân tích cấu trúc di truyền của các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tâm Thư tập trung giải quyết khoảng trống này nhằm cung cấp luận cứ khoa học về thành phần loài và các gene chức năng tham gia phân giải chất độc.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm ba nội dung chính:

1. Đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.
2. Đánh giá sự đa dạng các nhóm gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo từ mẫu đất lô xử lý tại Biên Hòa.
3. Đánh giá khả năng phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin và các sản phẩm trung gian trong mẫu làm giàu bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo.

Đối tượng nghiên cứu là quần xã vi khuẩn kỵ khí (vi khuẩn khử sulfate, Dehalococcoides, Pseudomonas...), các dòng thuần phân lập, hệ gene metagenome và các gene chức năng mã hóa enzyme phân hủy hợp chất clo vòng thơm. Phạm vi nghiên cứu về không gian tập trung tại các lô xử lý phân hủy sinh học ở sân bay Đà Nẵng (lô 10 $\text{m}^3$, 100 $\text{m}^3$) và sân bay Biên Hòa (lô chôn lấp tích cực 3.384 $\text{m}^3$ tại khu vực Z1). Phạm vi thời gian bao gồm quá trình theo dõi các mốc xử lý thực địa (đến 36 tháng tại Biên Hòa) và quá trình làm giàu nhân tạo trong phòng thí nghiệm kéo dài 12 tháng.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hiện trạng ô nhiễm và cơ chế phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo:

• Về mức độ ô nhiễm và độc tính: Schecter (2006), Tas (2009), Wagner (2009) và Fennell (2004) đã phân tích tính bền vững và sự tích lũy sinh học của các hợp chất chlorophenoxy (2,4-D; 2,4,5-T), polychlorinated biphenyls (PCB) và polychlorodibenzo-p-dioxins/furans (PCDD/Fs). Tại Việt Nam, các báo cáo của Hatfield (2009, 2011), Báo cáo Văn phòng 33 và Bộ Tài nguyên và Môi trường (2006, 2012) chỉ ra rằng nồng độ 2,3,7,8-TCDD tại khu Z1 sân bay Biên Hòa lên tới 259.000 ppt và tại đầu Bắc sân bay Đà Nẵng lên tới 361.000 ppt, chiếm trên 90–99% tổng độ độc tương đương (TEQ).
• Về cơ chế phân hủy sinh học: Reineke (2001) và Hiraishi (2003, 2008) phân định 4 con đường chuyển hóa: oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng, phân giải nhờ enzyme ngoại bào (laccase, MnP, LiP do nấm tiết ra) và loại khử clo kỵ khí (hô hấp loại clo). Quá trình kỵ khí được xem là bước mở đầu giúp giảm số lượng nguyên tử clo trên khung phân tử đa vòng, tạo tiền đề cho các phản ứng khoáng hóa tiếp theo.
• Về vi khuẩn hô hấp loại clo: Bunge và cộng sự (2003, 2008, 2009), Adrian (2007), Löffler và cộng sự (2013) đã chứng minh vai trò của Dehalococcoides mccartyi (các chủng 195, CBDB1, BAV1, FL2, VS, GT) trong việc loại clo của PCDD/Fs và chloroethene. Các nghiên cứu của Boyle và cộng sự (1995, 1999b), Sun (2000), Drzyzga và cộng sự (2001), Bisaillon và cộng sự (2010) mô tả hoạt tính của vi khuẩn khử sulfate (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomonile).
• Các nghiên cứu tại Việt Nam: Đặng Thị Cẩm Hà (2005, 2009, 2012) cùng các cộng sự đã xây dựng công nghệ chôn lấp tích cực. Nguyễn Bá Hữu (2007c, 2008, 2009) sử dụng phương pháp DGGE và SSCP phát hiện sự có mặt của Dehalococcoides và Pseudomonas trong các lô xử lý tại Đà Nẵng. Nguyễn Thị Sánh (2005, 2007), La Thanh Phương (2005) và Phùng Khắc Huy Chú (2012) nghiên cứu khả năng đồng trao đổi chất của các chủng Pseudomonas bản địa.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là việc thiếu hụt dữ liệu metagenomics về toàn bộ quần xã vi khuẩn kỵ khí và các cụm gene chức năng trong đất xử lý dioxin quy mô lớn ở Việt Nam, cũng như chưa có quy trình làm giàu thành công tập đoàn vi khuẩn kỵ khí chứa đầy đủ cả ba nhóm sinh lý hô hấp loại clo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về chuỗi chuyển hóa yếm khí các hợp chất cơ clo, trong đó các phân tử chứa clo đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng và hydro phân tử ($\text{H}_2$) hoặc các acid hữu cơ ngắn giữ vai trò chất cho điện tử. Quá trình khử clo được xúc tác chính bởi enzyme reductive dehalogenase (RdhA) nằm trong màng tế bào.

Nhóm vi khuẩn	Đặc điểm sinh lý	Đại diện điển hình
Hô hấp loại clo bắt buộc	Chỉ thu năng lượng sinh trưởng từ quá trình khử clo; sử dụng $\text{H}_2$ làm chất cho điện tử; kỵ khí tuyệt đối.	Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Dehalobacter
Hô hấp loại clo không bắt buộc	Có thể sử dụng cơ chất chứa clo hoặc các chất nhận điện tử vô cơ khác ($\text{SO}_4^{2-}$, $\text{S}_2\text{O}_3^{2-}$, $\text{NO}_3^-$).	Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter
Đồng trao đổi chất	Khử clo ngẫu nhiên song song với quá trình trao đổi chất; sống được ở điều kiện kỵ khí, vi hiếu khí hoặc hiếu khí.	Pseudomonas, Clostridium, Shewanella

Hệ thống phương pháp thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

• Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số trực tiếp từ đất và dịch nuôi cấy; khuếch đại phân đoạn gene 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR và nested-PCR; phân tích cấu trúc quần thể bằng điện di trên gel biến tính (DGGE); nhân dòng và giải trình tự nucleotide; giải trình tự metagenome bằng hệ máy Roche 454 GS Junior và phân tích dữ liệu thông qua phần mềm Newbler cùng hệ thống máy chủ MG-RAST.
• Phương pháp vi sinh vật: Nuôi cấy kỵ khí trong bình yếm khí chuyên dụng; làm giàu tập đoàn vi khuẩn hô hấp loại clo trên môi trường khoáng bổ sung dịch chiết đất ô nhiễm, 2,4,5-T và 2,4-DCP; phân lập và làm sạch vi khuẩn khử sulfate; khảo sát các yếu tố sinh thái ảnh hưởng đến sinh trưởng (nhiệt độ, pH, nồng độ $\text{NaCl}$, nguồn carbon, nồng độ dịch chiết đất); quan sát hình thái bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử.
• Phương pháp hóa học: Định lượng các thành phần 2,4,5-T và 2,4-DCP bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); phân tích hàm lượng 17 đồng phân PCDD/Fs độc hại trên hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ phân giải cao (HRGC/HRMS).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về cấu trúc, độc tính và con đường lan truyền của các chất diệt cỏ nhóm phenoxy và dioxin. Trình bày chi tiết đặc điểm hóa lý của 2,4-D, 2,4,5-T và 210 đồng phân dioxin (75 PCDD và 135 PCDF), trong đó nhấn mạnh đồng phân 2,3,7,8-TCDD có hệ số độc tính TEF quy ước bằng 1. Tổng quan phân tích sâu 4 cơ chế thoái hóa sinh học, so sánh hiệu quả giữa phân hủy hiếu khí và loại clo yếm khí. Phân tích chi tiết các nhóm vi khuẩn tham gia chuỗi hô hấp loại clo thuộc ba ngành Proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes và cấu trúc các gene rdhA mã hóa enzyme RdhA. Đồng thời, chương 1 điểm lại các kết quả xử lý đất nhiễm chất độc hóa học tại Đà Nẵng, Biên Hòa và xác định cơ sở khoa học để lựa chọn hướng tiếp cận vi sinh kỵ khí kết hợp metagenomics.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc các mẫu đất thu thập từ các ngăn của lô xử lý thử nghiệm tại sân bay Đà Nẵng (lô 10 $\text{m}^3$ và 100 $\text{m}^3$) và 16 vị trí lấy mẫu đại diện ở các độ sâu khác nhau từ lô xử lý chôn lấp tích cực 3.384 $\text{m}^3$ tại sân bay Biên Hòa sau 36 tháng vận hành. Liệt kê trình tự các cặp mồi chuyên biệt sử dụng trong nested-PCR và DGGE (bao gồm mồi đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate DCC305f/DSV838r, mồi cho Dehalococcoides, mồi cho gene rdhA). Thiết lập công thức nồng độ chất biến tính trong gel DGGE, quy trình giải trình tự gen thế hệ mới trên máy Roche 454 GS Junior, cũng như quy trình chiết xuất và phân tích tồn lưu hóa chất trên HPLC và HRGC/HRMS.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các dẫn liệu thực nghiệm thu được:

• Đa dạng vi khuẩn loại clo trong các lô xử lý: Bằng kỹ thuật nested-PCR và DGGE, tác giả chứng minh sự hiện diện liên tục của vi khuẩn khử sulfate và vi khuẩn Dehalococcoides trong các khối đất xử lý tại cả Đà Nẵng và Biên Hòa. Phân tích cây phát sinh chủng loại cho thấy các dòng vi khuẩn khử sulfate có quan hệ gần gũi với các chi Desulfovibrio, Desulfomicrobium, và các dòng Dehalococcoides tương đồng cao với nhóm chủng chuẩn Dehalococcoides mccartyi.
• Phân tích Metagenomics mẫu làm giàu: Phân tích mẫu vi khuẩn kỵ khí làm giàu từ 16 vị trí đất Biên Hòa trên nền đất ô nhiễm nặng bằng máy Roche 454 GS Junior (qua Newbler và MG-RAST) đã định danh được tập đoàn vi sinh vật gồm đầy đủ cả ba nhóm hô hấp loại clo. Vi khuẩn thuộc ngành Proteobacteria chiếm tỷ lệ lớn, trong đó chi Pseudomonas chiếm ưu thế vượt trội, cùng với sự hiện diện của Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Clostridium, Shewanella.

Nhóm vi sinh vật / Gene chức năng	Đặc điểm ghi nhận trong mẫu làm giàu
Proteobacteria (Pseudomonas)	Chiếm ưu thế lớn trong dữ liệu metagenome; tham gia đồng trao đổi chất và phân giải vòng thơm.
Chloroflexi (Dehalococcoides)	Nhóm hô hấp loại clo bắt buộc; mang các trình tự gene rdhA xúc tác khử clo ở vị trí nhân thơm.
Firmicutes (Desulfitobacterium, Clostridium)	Tham gia khử clo không bắt buộc và lên men sinh $\text{H}_2$ cung cấp cho Dehalococcoides.
Hệ gene chức năng phân giải	Phát hiện các gene haloacid dehalogenase, benzoyl-CoA reductase, dioxygenase, hydrolase.

• Đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate: Quần xã vi khuẩn khử sulfate sinh trưởng tối ưu ở dải nhiệt độ 30–37°C, pH 7,0–7,5, nồng độ $\text{NaCl}$ từ 0,5–1,0% và có khả năng chống chịu tốt với dịch chiết đất chứa độc chất. Chủng vi khuẩn khử sulfate thuần khiết ký hiệu BDN10T (phân lập từ mẫu đất Đà Nẵng) được xác định về hình thái tế bào que ngắn và trình tự đoạn 16S rRNA đặc hiệu.
• Khả năng chuyển hóa và phân hủy độc chất:
  • Tập đoàn vi khuẩn kỵ khí làm giàu từ đất Biên Hòa làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ trên nền đất ô nhiễm ban đầu 41.265 ng TEQ/kg đất khô sau thời gian nuôi cấy.
  • Làm giảm rõ rệt hàm lượng của 17 đồng phân PCDD/Fs độc hại (đặc biệt là 2,3,7,8-TCDD và OCDD).
  • Quần xã vi sinh vật kỵ khí chuyển hóa thành công 2,4,5-T và sản phẩm trung gian 2,4-DCP; chủng BDN10T sau khi làm sạch thể hiện khả năng phân giải và chuyển hóa 2,4,5-TCP và 2,4-DCP trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Chương 4. Bàn luận

Tác giả phân tích và tổng hợp mối quan hệ tương hỗ giữa các nhóm vi sinh vật trong hệ sinh thái kỵ khí nhân tạo. Luận án chỉ ra rằng quá trình phân hủy các chất hữu cơ chứa clo không diễn ra đơn độc bởi một chủng riêng lẻ mà đòi hỏi sự phối hợp trao đổi chất giữa nhiều nhóm: vi khuẩn lên men tạo $\text{H}_2$ và acid hữu cơ, vi khuẩn khử sulfate điều hòa thế oxy hóa khử và tham gia loại clo không bắt buộc, vi khuẩn Dehalococcoides thực hiện cắt nguyên tử clo ở các vị trí bền vững, và Pseudomonas thực hiện biến đổi cấu trúc vòng. Cấu trúc quần xã vi sinh vật này giải thích cho hiệu quả xử lý thực địa đạt trên 99% tại lô chôn lấp tích cực Biên Hòa và cung cấp cơ sở để tối ưu hóa công nghệ sinh học xử lý đất nhiễm chất độc hóa học.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã công bố các phát hiện khoa học và đóng góp mới gồm:

1. Lần đầu tiên tại Việt Nam làm giàu thành công tập đoàn vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo từ đất của lô chôn lấp tích cực quy mô lớn xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Tập đoàn vi khuẩn này quy tụ đầy đủ cả ba nhóm sinh lý: nhóm bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas), nhóm không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter) và nhóm đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella), trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế.
2. Đánh giá định lượng khả năng phân hủy độc chất trong điều kiện thực nghiệm: tập đoàn vi khuẩn kỵ khí làm giàu làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ trên mẫu đất ô nhiễm rất nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô). Xác định được khả năng phân hủy và chuyển hóa 17 đồng phân PCDD/Fs độc hại, 2,4,5-T, 2,4-DCP bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí và khả năng chuyển hóa chlorophenol bởi chủng vi khuẩn khử sulfate BDN10T.
3. Lần đầu tiên áp dụng công cụ Metagenomics để giải mã cấu trúc quần xã vi khuẩn kỵ khí và hệ thống các nhóm gene chức năng (rdhA, haloacid dehalogenase, các gene mã hóa enzyme chuyển hóa hợp chất vòng thơm) từ khối đất xử lý dioxin sau 36 tháng tại sân bay Biên Hòa.

Kiến nghị của luận án nhấn mạnh việc tiếp tục hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy nhằm duy trì tính ổn định của tập đoàn vi khuẩn kỵ khí làm giàu, hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ bổ sung vào các khối ủ xử lý đất nhiễm dioxin quy mô công nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án chỉ ra một số hạn chế gắn liền với đặc thù đối tượng nghiên cứu:

• Các vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo bắt buộc như Dehalococcoides có tốc độ sinh trưởng chậm, đòi hỏi điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt và phụ thuộc chặt chẽ vào các chất chuyển hóa trung gian từ các vi sinh vật đồng hành (như nguồn vitamin $\text{B}_{12}$, khí $\text{H}_2$), dẫn đến khó khăn trong việc tách dòng thuần khiết từng loài riêng biệt.
• Dữ liệu biểu hiện gene chức năng (rdhA) chủ yếu được khảo sát ở mức độ định tính và định danh trình tự metagenome, chưa định lượng chi tiết mức độ phiên mã (transcriptomics) của từng bản sao gene cụ thể dưới sự cảm ứng của từng đồng phân dioxin riêng lẻ.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất là tối ưu hóa môi trường nuôi cấy liên tục tập đoàn vi khuẩn kỵ khí, nghiên cứu sâu cơ chế điều hòa biểu hiện các cụm gene rdhA và thử nghiệm ứng dụng tập đoàn vi sinh vật làm giàu này vào các mô hình xử lý sinh học tăng cường (bioaugmentation) ngoài hiện trường.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học và Khoa học Môi trường: Tham khảo khung phương pháp luận kết hợp giữa vi sinh truyền thống (làm giàu, phân lập kỵ khí) và sinh học phân tử hiện đại (DGGE, nested-PCR, Metagenomics 454). Các dữ liệu về trình tự mồi và quy trình phân tích gene rdhA là tài liệu thực hành có giá trị cao.
• Các nhà khoa học trong lĩnh vực công nghệ môi trường: Tiếp cận dẫn liệu thực nghiệm chi tiết về con đường phân hủy yếm khí các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân giải (POPs) và vai trò của vi khuẩn khử sulfate.
• Cơ quan quản lý và đơn vị xử lý môi trường (Bộ Quốc phòng, Bộ Tài nguyên và Môi trường): Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá, kiểm soát và tối ưu hóa các thông số vận hành (độ ẩm, dinh dưỡng, điều kiện yếm khí) tại các bãi chôn lấp tích cực tẩy độc dioxin ở Biên Hòa và các địa bàn khác.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba nhóm vi khuẩn kỵ khí tham gia hô hấp loại khử clo được xác định trong luận án gồm những chi đại diện nào?
Luận án xác định ba nhóm gồm: nhóm hô hấp loại clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); nhóm hô hấp loại clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter); và nhóm loại clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella), trong đó chi Pseudomonas chiếm tỷ lệ ưu thế nhất.

2. Quần xã vi khuẩn kỵ khí làm giàu từ đất Biên Hòa đạt hiệu suất khử độc bao nhiêu trên nền đất ô nhiễm?
Trong điều kiện thực nghiệm nuôi cấy trên nền đất ô nhiễm nặng có nồng độ ban đầu 41.265 ng TEQ/kg đất khô, tập đoàn vi khuẩn kỵ khí làm giàu đã phân hủy và chuyển hóa làm giảm 55,7% tổng độ độc tương đương (TEQ), đồng thời làm giảm nồng độ của cả 17 đồng phân PCDD/Fs.

3. Công cụ sinh học phân tử nào lần đầu tiên được luận án ứng dụng để phân tích mẫu đất xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại Việt Nam?
Luận án lần đầu tiên ứng dụng công nghệ Metagenomics giải trình tự thế hệ mới trên hệ thống máy Roche 454 GS Junior, kết hợp xử lý dữ liệu bằng phần mềm Newbler và máy chủ MG-RAST để phân tích cấu trúc hệ thống vi khuẩn và các nhóm gene chức năng phân giải chất độc.

4. Chủng vi khuẩn khử sulfate thuần khiết BDN10T có nguồn gốc từ đâu và có hoạt tính gì?
Chủng BDN10T được phân lập và làm sạch từ mẫu đất của lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng. Chủng này có tế bào hình que ngắn, thuộc nhóm vi khuẩn khử sulfate và có khả năng chuyển hóa, phân hủy các hợp chất chlorophenol như 2,4,5-TCP và 2,4-DCP.

5. Tại sao vi khuẩn Dehalococcoides giữ vai trò then chốt trong quá trình xử lý kỵ khí các hợp chất chứa clo?
Dehalococcoides là nhóm vi khuẩn hô hấp loại clo bắt buộc, mang nhiều bản sao gene rdhA mã hóa enzyme reductive dehalogenase, có khả năng khử các nguyên tử clo ở các vị trí bền vững trên khung phân tử đa vòng thơm (PCDD/Fs) và chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất chloroethene (PCE, TCE) thành ethene không độc hại.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tâm Thư đã làm sáng tỏ cấu trúc đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí và hệ gene chức năng tham gia hô hấp loại clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Bằng việc kết hợp phương pháp làm giàu vi sinh vật kỵ khí truyền thống với kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến và metagenomics, công trình đã xác lập thành công tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng làm giảm 55,7% tổng độ độc TEQ trên nền đất ô nhiễm nặng. Các kết quả đạt được cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm vững chắc, khẳng định vai trò của vi khuẩn kỵ khí trong quy trình công nghệ phân hủy sinh học chất độc hữu cơ bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme.

Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo. Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3 đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3. Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin.

Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành. Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này.

Đặc biệt, 2 nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công.

Để tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”. Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây: Mục đích nghiên cứu  Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.  Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.  Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo.

Nội dung nghiên cứu  Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR.  Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.  Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử lý 3. 3  Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.

 Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.  Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng. Phƣơng pháp nghiên cứu 1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu.

Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin.

Các VK KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là 2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5- TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên đất ô nhiễm ở mục (2).

5 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo 1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v., trong nông nghiệp và cả trong chiến tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006).

Thời gian bán hủy của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa. Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng thơm và đa vòng thơm (Hình 1. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009).

(iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian 6 của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin (PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau.

Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác. cis-1,3- Tetrachloroethene Trichloroethene -hexachlorocyclohexane dichloropropene (PCE) (TCE) (HCH) 2,4,5-T 2,4-D 2,4-dichlorophenol 1,2,4,5- (2,4-DCP) tetrachlorobenzen PCDD PCDF 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p- dioxin (2,3,7,8-TCDD) Hình 1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình 2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật.

2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5- trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong nông nghiệp và lâm nghiệp. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc tương đương là 1 (Schecter, 2006).